Summary

Die Messung der differentiell methylierter<em> INS</em> DNA-Spezies in Humanserumproben als Biomarker von Islet β Cell Death

Published: December 21, 2016
doi:

Summary

Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.

Abstract

The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.

Introduction

Typ – 1 – Diabetes (T1D) ist eine Autoimmunerkrankung , die durch die Zerstörung der Insulin produzierenden Inselzellen β – Zellen durch autoreaktive T – Zellen 1 gekennzeichnet ist. Die Diagnose von T1D ist in der Regel bei der Messung von Hyperglykämie (Blutzucker> 200 mg / dl) in einem schlanken, jungen Person gemacht, die mit einer Ketoazidose als Beweis für Insulinmangel darstellen könnten. Zum Zeitpunkt der Diagnose von T1D gibt es Hinweise für einen wesentlichen Verlust von β – Zellfunktion und Masse (50-90%) 2. In klinischen Studien wurden mehrere immunmodulatorischen Medikamente, die zum Zeitpunkt der Diagnose eingeleitet wurden führte zur Stabilisierung der β-Zellfunktion (und vermutlich Masse), aber keine haben in klinischer Remission der Erkrankung führte, eine Feststellung, dass die Forderung nach der Entwicklung erhöht hat von Biomarkern für frühere Erkennung der Krankheit und für die Längs Verfolgung der Wirksamkeit von Kombinationstherapien 3,4. Die Bemühungen der internationalen Konsortien, eine solchedas Human Islet Research Network Consortium s an den National Institutes of Heath 5, haben die Notwendigkeit zur Entwicklung von Biomarkern betont , dass in T1D auf β Zellstress und Tod konzentrieren.

Im Einklang mit diesen Bemühungen haben unsere Gruppe und andere kürzlich Biomarker – Assays entwickelt, die epigenetisch modifizierte DNA – Fragmente messen zirkulierenden , die von sterbenden β – Zellen 6 in erster Linie entstehen 9. In allen veröffentlichten Assays bisher hat sich der Schwerpunkt auf die Quantifizierung des humanen kodierenden Gens Präproinsulin (INS) gewesen, der größer Grade unmethylierte CpG – Stellen in den Codierungs- und Promotorregionen im Vergleich zu anderen Zelltypen veranschaulicht. Die Befreiung von nicht – methylierten INS DNA – Fragmente wurde die Hypothese aufgestellt , als in erster Linie vom Sterben (nekrotischen, apoptotischen) β – Zellen entstehen. Unsere jüngsten Studien haben gezeigt , dass in der Jugend, Erhöhungen in sowohl unmethylierte und methylierte DNA INS an Position -69 bp (bezogen auf ter Transkriptionsstartstelle) wurden in neu einsetzende T1D beobachtet und diente zusammen als spezifische Biomarker für diese Population 6. Diese Biomarker Assays beinhalten die Isolierung von zellfreien DNA aus Serum oder Plasma unter Verwendung handelsüblicher Kits Spin, gefolgt von einer Bisulfit-Umwandlung von der isolierten DNA (an nicht-methylierte Cytosine bis uracile konvertieren, so dass methylierte Cytosine intakt).

In diesem Bericht beschreiben wir die technischen Aspekte der Serumprobe Sammlung, Isolierung von zellfreien DNA aus Serum, Bisulfitumwandlung und Leistung von Tröpfchen digitalen PCR (von nun an, digitale PCR) für differentiell methyliert INS DNA.

Protocol

Ethics Statement: Protocols were approved by the Indiana University Institutional Review Board. Parents of subjects provided written informed consent, and children older than 7 years provided assent for their participation. 1. Serum Processing NOTE: The assay as described has been rigorously tested using human serum isolated as follows. Collect blood in one red top (no-additive; uncoated) blood collection tube. Let sit at room temperature for 30 min to allow the clot to form. <li…

Representative Results

Um Daten in geeigneter Weise zu interpretieren, verwenden wir Plasmid – Kontrollen sowohl für die unmethylierte und methylierte Ziel INS DNA in jeder digitalen PCR – Lauf. Diese Kontrollen stellen sicher, dass Signale an methylierter und nicht methylierter DNA entsprechen, sind klar zu unterscheiden. Abbildung 1 zeigt die 2-D Streudiagramme zu Tröpfchen für Plasmid Kontrollen enthält Bisulfit umgewandelt unmethylierte INS DNA (1A) e…

Discussion

Die Methylierung von Cytosin durch DNA-Methyltransferasen ermöglicht die epigenetische Kontrolle der Transkription bei vielen Genen. Das INS – Gen beim Menschen wird fast ausschließlich in islet β – Zellen exprimiert, und es scheint Silencing seiner Transkriptions 11 eine Korrelation zwischen der Häufigkeit der Methylierung von Cytosin in dem INS – Gen zu sein. Als solches zeigen die meisten Zelltypen wesentlich höhere Frequenzen der Methylierung des INS – Gen an verschiedenen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.

Materials

Red Top Vacutainer  Beckon Dickinson 366441 no additive, uncoated interior, 10 ml
Cryovial Tube Simport T310-3A polypropylene, screw cap tube, any size
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51106
Poly(A) Sigma P9403 disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl 
Absolute Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
DPBS (with CaCl and MgCl) Sigma D8662
0.2 mL PCR 8-strip Tubes MidSci AVST
8-strip Caps, Dome MidSci AVSTC-N
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo D5031
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Biorad 1863024
Buffer Control for Probes Biorad 1863052
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix Life Technologies AH21BH1
EcoR1 New England Biolabs R0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted Eppendorf 951020346
Pierceable Foil Heat Seal Biorad 1814040
PX1 PCR Plate Sealer Biorad 1814000
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System Biorad 1864101
Automated Droplet Generation Oil for Probes Biorad 186-4110
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator Biorad 186-4108
Pipet Tips for Automated Droplet Generator Biorad 186-4120
Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator Biorad 186-4125
C1000 Touch Thermal Cycler Biorad 1851197
QX200 Droplet Reader Biorad 186-4003
ddPCR Droplet Reader Oil Biorad 186-3004

References

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Tersey, S. A., Nelson, J. B., Fisher, M. M., Mirmira, R. G. Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet β Cell Death. J. Vis. Exp. (118), e54838, doi:10.3791/54838 (2016).

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