Summary

示差メチル化の測定<em> INS</em>バイオマーカー膵島のβ細胞死などのヒト血清試料中のDNA種

Published: December 21, 2016
doi:

Summary

Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.

Abstract

The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.

Introduction

1型糖尿病(T1D)は、自己反応性T細胞1によるインスリン産生膵島β細胞の破壊により特徴付けられる自己免疫疾患です。 T1Dの診断は、通常、インスリン欠乏の証拠としてケトアシドーシスを呈する可能性があるリーン、若い個体で高血糖(血糖値>が200mg / dl)の測定時に行われます。 T1Dの診断時に、β細胞機能及び質量の実質的な損失の証拠がある(50〜 – 90%)2。臨床研究では、診断時に制定されたいくつかの免疫調節薬は、疾患の臨床的寛解をもたらしたβ細胞機能(およびおそらく質量)が、いずれの安定化の発展のためにコールを調達している知見をもたらしました病気の早期発見のためとの併用療法3,4の有効性の長手方向の追跡のためのバイオマーカーの。国際コンソーシアムの取り組み、などヒース5の国立研究所のヒト膵島研究ネットワークコンソーシアムはね、T1D中のβ細胞ストレスと死に焦点を当てたバイオマーカーを開発する必要性を強調してきました。

9 これらの取り組みに沿って、私たちのグループなどが最近β細胞6を死んでから主に生じる循環、エピジェネティック修飾されたDNA断片を測定するバイオマーカーアッセイを開発しました。現在まで発表されたアッセイの全てにおいて、焦点は他の細胞型と比較して、コードおよびプロモーター領域における非メチル化CpG部位のより大きな程度を実証するヒト遺伝子をコードするプレ(INS)の定量にされています。非メチル化INS DNA断片の放出は(壊死性、アポトーシス)β細胞を瀕死から主に発生していると仮定しました。我々の最近の研究では位置で、若者にいることを非メチル化とメチル化の両方INS DNAの上昇を示した-69 bpの(トンへの相対彼は新たな発症T1Dで観察され、そして一緒にこの集団6のような特異的バイオマーカーを務めた)転写開始部位。これらのバイオマーカーアッセイは、(ウラシルに非メチル化シトシンを変換するために、無傷のメチル化シトシンを残して)単離されたDNAの重亜硫酸塩変換に続く商用スピンキットを用いて、血清または血漿からの無細胞DNAの単離を伴います。

この報告書では、我々は、血清からの無細胞DNA、重亜硫酸塩変換、および示差的メチル化INS DNAのための液滴のデジタルPCR(以下、デジタルPCR)の性能の単離を、血清サンプル収集の技術的側面を説明します。

Protocol

Ethics Statement: Protocols were approved by the Indiana University Institutional Review Board. Parents of subjects provided written informed consent, and children older than 7 years provided assent for their participation. 1. Serum Processing NOTE: The assay as described has been rigorously tested using human serum isolated as follows. Collect blood in one red top (no-additive; uncoated) blood collection tube. Let sit at room temperature for 30 min to allow the clot to form. <li…

Representative Results

適切にデータを解釈するために、我々は各デジタルPCR実行で非メチル化およびメチル化ターゲットINS DNAの両方のためのプラスミドコントロールを使用します。これらのコントロールは、メチル化および非メチル化DNAに対応する信号が明確に区別されていることを確認してください。 図1は、重亜硫酸塩変換されメチル化されていないINS DNA( …

Discussion

DNAメチルトランスフェラーゼによってシトシンのメチル化は、多くの遺伝子における転写のエピジェネティックな制御を可能にします。ヒトでのINS遺伝子がほぼ独占的に膵島β細胞で発現し、その転写11のサイレンシングにINS遺伝子シトシンのメチル化の頻度との間に相関関係があるように表示されます。 13 このように、ほとんどの細胞型は…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.

Materials

Red Top Vacutainer  Beckon Dickinson 366441 no additive, uncoated interior, 10 ml
Cryovial Tube Simport T310-3A polypropylene, screw cap tube, any size
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51106
Poly(A) Sigma P9403 disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl 
Absolute Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
DPBS (with CaCl and MgCl) Sigma D8662
0.2 mL PCR 8-strip Tubes MidSci AVST
8-strip Caps, Dome MidSci AVSTC-N
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo D5031
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Biorad 1863024
Buffer Control for Probes Biorad 1863052
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix Life Technologies AH21BH1
EcoR1 New England Biolabs R0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted Eppendorf 951020346
Pierceable Foil Heat Seal Biorad 1814040
PX1 PCR Plate Sealer Biorad 1814000
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System Biorad 1864101
Automated Droplet Generation Oil for Probes Biorad 186-4110
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator Biorad 186-4108
Pipet Tips for Automated Droplet Generator Biorad 186-4120
Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator Biorad 186-4125
C1000 Touch Thermal Cycler Biorad 1851197
QX200 Droplet Reader Biorad 186-4003
ddPCR Droplet Reader Oil Biorad 186-3004

References

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Tersey, S. A., Nelson, J. B., Fisher, M. M., Mirmira, R. G. Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet β Cell Death. J. Vis. Exp. (118), e54838, doi:10.3791/54838 (2016).

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