Summary

Medición de diferencialmente metilado<em> INS</em> Especies de ADN en muestras de suero humano como un biomarcador de la muerte celular de islotes β

Published: December 21, 2016
doi:

Summary

Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.

Abstract

The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.

Introduction

La diabetes de tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por la destrucción de los islotes productoras de insulina por las células β células T autorreactivas 1. El diagnóstico de la diabetes tipo 1 se hace típicamente en la medición de (glucemia> 200 mg / dl) la hiperglucemia en un individuo joven magra, que podría presentar con cetoacidosis como evidencia de la deficiencia de insulina. En el momento del diagnóstico de T1D, hay evidencia de una pérdida sustancial de la función de células β y la masa (de 50 – 90%) 2. En estudios clínicos, varios fármacos moduladores inmunes que fueron instituidas en el momento del diagnóstico como resultado la estabilización de la función de las células β (y, presumiblemente, la masa), pero ninguno ha dado lugar a la remisión clínica de la enfermedad, un hallazgo que ha levantado la llamada para el desarrollo de biomarcadores para la detección precoz de la enfermedad y para el seguimiento longitudinal de la efectividad de las terapias de combinación 3,4. Los esfuerzos de los consorcios internacionales, como unaEs la Red de Investigación Consorcio de islotes humanos en los Institutos Nacionales de Heath 5, han hecho hincapié en la necesidad de desarrollar biomarcadores que se centran en el estrés celular β y la muerte en la DM1.

En línea con estos esfuerzos, nuestro grupo y otros han desarrollado recientemente ensayos de biomarcadores que miden la circulación, fragmentos de ADN epigenetically modificados que se derivan principalmente de las células que mueren beta 6 9. En todos los ensayos publicados hasta la fecha, la atención se ha centrado en la cuantificación del gen humano que codifica la preproinsulina (INS), lo que demuestra un mayor grado de sitios CpG no metilados en las regiones codificantes y promotores en comparación con otros tipos de células. La liberación de fragmentos de ADN INS no metilados se planteó la hipótesis de que surja principalmente de la muerte (necrosis, apoptosis) las células beta. Nuestros estudios recientes demostraron que en la juventud, las elevaciones en el ADN INS tanto metilado y no metilado en la posición -69 pb (con relación al tél inicio de la transcripción sitio) se observaron en nueva aparición de diabetes tipo 1, y juntos sirvió como biomarcadores específicos para esta población 6. Estos ensayos de biomarcadores implican el aislamiento de ADN libre de células a partir de suero o plasma usando kits comerciales de giro, seguido de una conversión de bisulfito del ADN aislado (para convertir las citosinas no metiladas a uracilos, dejando citosinas metiladas intacta).

En este informe, se describen los aspectos técnicos de la recogida de muestras de suero, el aislamiento de ADN libre de células a partir de suero, la conversión de bisulfito, y el rendimiento de la PCR digital de la gotita (en adelante, digital PCR) para el ADN metilado diferencialmente INS.

Protocol

Ethics Statement: Protocols were approved by the Indiana University Institutional Review Board. Parents of subjects provided written informed consent, and children older than 7 years provided assent for their participation. 1. Serum Processing NOTE: The assay as described has been rigorously tested using human serum isolated as follows. Collect blood in one red top (no-additive; uncoated) blood collection tube. Let sit at room temperature for 30 min to allow the clot to form. <li…

Representative Results

Para interpretar los datos de forma adecuada, utilizamos plásmido controles tanto para el ADN diana INS no metilado y no metilado en cada PCR plazo digital. Estos controles aseguran que las señales correspondientes a ADN metilado y no metilado son claramente distinguibles. La Figura 1 muestra los gráficos de dispersión 2-D correspondientes a las gotas para los controles de plásmido que contienen bisulfito convertido no metilada de ADN INS (…

Discussion

La metilación de las citosinas por metiltransferasas de ADN permite el control epigenético de la transcripción en muchos genes. El gen INS en los seres humanos se expresa casi exclusivamente en los islotes β células, y no parece haber una correlación entre la frecuencia de metilación de citosinas en el gen INS para silenciamiento de su transcripción 11. Como tal, la mayoría de tipos de células muestran frecuencias sustancialmente más altos de metilación del gen INS en va…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.

Materials

Red Top Vacutainer  Beckon Dickinson 366441 no additive, uncoated interior, 10 ml
Cryovial Tube Simport T310-3A polypropylene, screw cap tube, any size
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51106
Poly(A) Sigma P9403 disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl 
Absolute Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
DPBS (with CaCl and MgCl) Sigma D8662
0.2 mL PCR 8-strip Tubes MidSci AVST
8-strip Caps, Dome MidSci AVSTC-N
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo D5031
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Biorad 1863024
Buffer Control for Probes Biorad 1863052
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix Life Technologies AH21BH1
EcoR1 New England Biolabs R0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted Eppendorf 951020346
Pierceable Foil Heat Seal Biorad 1814040
PX1 PCR Plate Sealer Biorad 1814000
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System Biorad 1864101
Automated Droplet Generation Oil for Probes Biorad 186-4110
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator Biorad 186-4108
Pipet Tips for Automated Droplet Generator Biorad 186-4120
Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator Biorad 186-4125
C1000 Touch Thermal Cycler Biorad 1851197
QX200 Droplet Reader Biorad 186-4003
ddPCR Droplet Reader Oil Biorad 186-3004

References

  1. Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
  2. Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, 32-39 (2005).
  3. Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
  4. Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
  5. . Human Islet Research Network | HIRN Available from: https://hirnetwork.org/ (2016)
  6. Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
  7. Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
  8. Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
  9. Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
  10. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  11. Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
  12. Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
  13. Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
  14. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  15. Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
  16. Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
  17. Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  18. Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).

Play Video

Cite This Article
Tersey, S. A., Nelson, J. B., Fisher, M. M., Mirmira, R. G. Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet β Cell Death. J. Vis. Exp. (118), e54838, doi:10.3791/54838 (2016).

View Video