Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

نحن هنا وصف وضعت حديثا فيروس التهاب الكبد B (HBV) نظام مراسل لمراقبة مراحل مبكرة من دورة حياة الالتهاب الكبدي الوبائي. وهذا مبسطة في نظام المختبر مساعدة في فحص وكلاء مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي باستخدام استراتيجية عالية الإنتاجية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

عدوى مزمنة بفيروس التهاب الكبد B (HBV) هو عامل خطر رئيسي لأمراض الكبد المزمنة 1. وعلى الرغم من الاستراتيجيات العلاجية الحالية القائمة على النظير النوكليوتيدات التي تمنع الالتهاب الكبدي الوبائي وظيفة بول و / أو إدارة من النوع الأول الإنترفيرون الذي ينشط الاستجابات المناعية عند الأفراد المصابين وكذلك قمع غير مباشرة انتشار الالتهاب الكبدي الوبائي من خلال حفز الانترفيرون وظائف الجينات ويمكن لهذه العلاجات لا يلغي الالتهاب الكبدي الوبائي الحمض النووي تماما 3. وعلاوة على ذلك، فإن ظهور HBVs التي تقاوم عوامل مضادة للبول هو من القلق 4. وقد أظهرت إدارة جنبا إلى جنب العوامل المضادة للفيروسات التي تستهدف بشكل مباشر على الخطوات المختلفة لفيروس نقص المناعة البشري (HIV) أو التهاب الكبد الوبائي (سي) دورة الحياة لقمع بنجاح أو القضاء على فيروس (الخانات). مشابهة لهذه الفكرة، ووضع مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي وكيل (ق) التي تعمل مباشرة على مراحل مختلفة من Hدورة الحياة BV مهمة لتأسيس العلاجات الالتهاب الكبدي الوبائي في المستقبل.

بشكل عام، وإنشاء بسيط في نظام الثقافة المختبر من الفيروس هدف يسهل تطوير عوامل مضادة للفيروس. ومع ذلك، هناك اثنين على الاقل من الحواجز التي تحول دون تطوير نظم الاستزراع في المختبر لفحص عوامل مضادة للالتهاب الكبد البائي. الأول هو عدم وجود نظام في المختبر زراعة الخلايا مناسب لفيروس التهاب الكبد B عدوى / انتشار الأسلحة النووية. على عكس غيره من الفيروسات، مثل فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الوبائي، والتي تم نشرها في خطوط الخلايا المعمول بها، فإنه من الصعب زراعة الالتهاب الكبدي الوبائي في المختبر بسبب القيود التجريبية بما في ذلك مجموعة المضيف ضيق. استخدام نظم محددة ثقافة الخلية مثل خط خلية الكبدي البشري HepaRG، الذي هو عرضة للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي، وقد وضعت 7 إلى التغلب على هذه المشاكل. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا PXB، معزولة عن يوروكيناز-تايالمؤسسة العامة المنشط plasminogen المعدلة وراثيا / الفئران SCID تلقيح مع الكبدية الإنسان الأساسية (PHH) عرضت، لتكون عرضة للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي وتكرار 8. ومع ذلك، مستويات تكرار الالتهاب الكبدي الوبائي في HepaRG تعتمد على حالة التمايز الخلوي بعد والثقافة، والذي يمكن أن يسبب نتائج غير متناسقة وirreproducible من مستويات العدوى / تكرار الالتهاب الكبدي الوبائي. يستخدم PXB عادة للتجارب العدوى ولكن محدودة بسبب توافره. والالتهاب الكبدي الوبائي محرض خط خلية التعبير التتراسيكلين، HepAD38، كما تم استخدامها على نطاق واسع لدراسة تكرار الالتهاب الكبدي الوبائي، ولكن هذا النظام يسمح فقط تقييم بعد النسخ وليس في خطوة دخول العدوى 9. في الآونة الأخيرة، سمحت تحديد ببتيد الصوديوم توروكولات cotransporting (NTCP) بمثابة مستقبلات وظيفية لHBV تطوير نظام الثقافة HBV متغير 10. في الواقع، NTCP التعبير في خلايا سرطانة الكبد غير عرضة مثل Huh7 وHepG2 تمكن عدوى الالتهاب الكبدي الوبائي (10) وبالتالي، تم توسيع وتنويع اختياراتك في خطوط الخلايا عرضة HBV، وحل العديد من القيود التجريبية. المشكلة الثانية هي عدم وجود نظام فحص بسيط لتقييم العدوى والتكرار. وعادة ما يتم إجراء تقييم العدوى عن طريق تحليل HBV DNA و RNA والبروتينات. ومع ذلك، وتحديد حجم هذه العلامات الفيروس هو مضيعة للوقت، في كثير من الأحيان مكلفا وليس بسيطا دائما. لذلك، وتطوير نظام فحص بسيط، مثل استخدام الجينات المراسل، قد تغلب على المشاكل المرتبطة بنظم HBV فحص.

ومع ذلك، لأن حجم الجينوم التي يمكن تعبئتها إلى القفيصة HBV محدودة - أقل من 3.7 كيلو بايت 11 - حجم الجين مراسل يجب أن تكون قصيرة قدر الإمكان. وعلاوة على ذلك، فإن وجود عناصر رابطة الدول المستقلة المتعددة المنتشرة في جميع أنحاء الجينوم، التي تعتبر ضرورية لتكاثر الفيروس، يحد من الوظائف المتاحة لفي sertion من الجين مراسل في الجينوم. وقد حاول العديد من التقارير لادخال الجينات الغريبة، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1 تات والأخضر بروتين فلوري، وعن dsRed، في جينوم فيروس الالتهاب الكبدى ب 11 و 12 و 13. ومع ذلك، هذه HBVs المؤتلف ليست مفيدة لفحص الالتهاب الكبدي الوبائي عدوى / التكرار، أو لفحص عالية الإنتاجية من العوامل التي تؤثر عدوى الالتهاب الكبدي الوبائي / النسخ المتماثل. هذا هو السبب الرئيسي لانخفاض الإنتاجية من الفيروسات المؤتلف وانخفاض كثافة التعبير مراسل الجينات التي تسببها إنتاج فيروس فعالة.

للتغلب على هذه القضايا، فإننا شيدت HBV مراسل مع ارتفاع العائد من إنتاج فيروس. هذا الفيروس حساس للغاية لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل HBV، من الدخول إلى النسخ. ولتحقيق ذلك، تم اختيار NanoLuc (NL) باسم الجينات علامة لأنه هو صغير (171 الأحماض الأمينية) هندستها مراسل الانارةالطبقة = "XREF"> 14. وعلاوة على ذلك، NL ما يقرب من 150 أضعاف أكثر إشراقا من يراعة أو Renilla وسيفيراز، وردود الفعل الانارة هو ATP مستقل، مما يشير إلى أن معدل ضرب كاذبة سوف تكون منخفضة للكشف عن الإنتاجية العالية. كفاءة إنتاج HBV المؤتلف حوالي 1/5 من الوالد الالتهاب الكبدي الوبائي، وتشبه إلى مستويات ذكرت بحثا عن الفيروسات المؤتلف HBV السابقة؛ ومع ذلك، فإن سطوع NL يتغلب على قضايا الإنتاجية فيروس لذلك يمكن استخدامها لفحص كتلة من عوامل مضادة للالتهاب الكبد البائي.

فحص وكلاء مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي باستخدام خلايا الكبد الأولية، قد يكون HepaRG، HepAD38 وخلايا الكبد NTCP-transduced مفيدة لفحص وكلاء مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي من الطريقة التقليدية (ق). ومع ذلك، فإن النظام المذكور هنا له مزايا عديدة مثل معالجة بسيطة، وحساسية عالية، والتكلفة المنخفضة للفحص. هذه المزايا هي مناسبة لفحوصات إنتاجية عالية لتطوير وتحديد عوامل الالتهاب الكبدي الوبائي الجديد لأغراض علاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إنتاج المؤتلف HBV ترميز البروتين مراسل

  1. إعداد الخلايا HepG2
    1. إعداد خلية ثقافة المتوسط ​​(متوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 100 U / مل الأحماض الأمينية غير الأساسية).
    2. لوحة 4 × 10 6 خلايا HepG2 في طبق المغلفة الكولاجين 10 سم في 10 مل من مستنبت قبل يوم واحد ترنسفكأيشن. احتضان خلايا HepG2 عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة.
      ملاحظة: عندما يتم مطلي 4 × 10 6 خلايا HepG2 تقريبا في صحن 10 سم المغلفة الكولاجين في 10 مل من مستنبت، وأنها ستكون 70-90٪ متكدسة في اليوم التالي.
  2. ترنسفكأيشن
    1. خلايا Transfect HepG2 مع 5 ميكروغرام من pUC1.2HBV دلتا إبسيلون 15 و 5 ميكروغرام من pUC1.2HBV / NL 15 باستخدام ترنسفكأيشنكاشف حسب تعليمات الشركة الصانعة.
    2. في اليوم التالي، وإزالة مستنبت وإضافة 10 مل من مستنبت الطازجة.
    3. أسبوع واحد بعد ترنسفكأيشن، ونقل ثقافة المتوسط ​​تحتوي على فيروس التهاب الكبد B المؤتلف إلى مل أنبوب 50 وانتقل إلى الخطوة 1.3.1. إضافة 10 مل من مستنبت الطازجة إلى لوحة تحتوي على خلايا transfected.
      ملاحظة: يتم الحفاظ على الإنتاج من الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف لمدة 4 أسابيع. مستنبت تحتوي على الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر.
  3. تنقية HBV المؤتلف
    1. إزالة الحطام خلية من مستنبت تحتوي على الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف بواسطة الطرد المركزي (2300 x ج لمدة 5 دقائق).
    2. تمرير طاف من خلال مرشح 0.45 ميكرون الغشاء.
    3. إضافة حجم مساو من 26٪ PEG / 1.5 M كلوريد الصوديوم (البولي ايثيلين جلايكول 6000: 130 غ، كلوريد الصوديوم، و 49 غرام، 1 مل من 0.5 M EDTA ودرجة الحموضة 8.0 و 5 مل من 1 M HEPES الرقم الهيدروجيني 7.6 في 500 مل) إلى مستنبت تحتوي المؤتلفالالتهاب الكبدي الوبائي وتخلط بلطف. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 2300 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    5. تجاهل وطاف حل بيليه في 0.5 مل من TNE (10 ملي تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA).
    6. إزالة الحطام بواسطة الطرد المركزي في 2300 x ج لمدة 5 دقائق.
    7. تحميل 0.5 مل من TNE تحتوي على الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف على 0.8 مل من السكروز 20٪ في TNE.
    8. أجهزة الطرد المركزي في 100000 × ز لمدة 3 ساعة على 15 درجة مئوية.
    9. تجاهل أكبر قدر من طاف وقت ممكن، وحفظ بيليه. و resuspend في 1 مل من DMEM مجانا المصل لكل 40 مل من بدء مستنبت.
    10. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    11. تصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون. إعداد 0.5 مل قسامات وتخزينها في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا لوحظ تلوث البروتين مراسل من عينة الفيروس الأصلي، وتنقية الفيروس عن طريق كثافة التدرج فائقة الطرد المركزي من 5-30٪ سكروز في TNE في 100000 x ج لمدة 2 ساعة، أو CSCL كثافة معايرتها الطرد المركزي جيئة وذهابام 1،1-1،6 غ / مل في 150000 x ج لمدة 50 ساعة.

2. العدوى من فيروس التهاب الكبد B المؤتلف

  1. ثقافة الخلايا HepG2 التعبير عن مستقر NTCP (HepG2 / NTCP) 15 التي هي عرضة للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي في DMEM تستكمل مع FBS 10٪، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 250 ميكروغرام / مل G-418 و 100 U / مل الأحماض الأمينية غير الأساسية عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة.
  2. قبل يوم واحد من العدوى، لوحة ما يقرب من 5 × 10 4 HepG2 / خلايا NTCP 14 في لوحة المغلفة 96-جيدا الكولاجين في 0.1 مل من مستنبت.
  3. HBV المؤتلف ذوبان في 37 ° C حمام الماء حتى هناك قطعة صغيرة من الثلج المتبقي في القنينة.
  4. إعداد المتوسطة للعدوى عن طريق الجمع بين ما يلي: 10 ميكرولتر من 40٪ PEG8000 في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 2 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس])، و 10 ميكرولتر من الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف و 78 ميكرولتر من مستنبت الطازجةلكل بئر من لوحة 96-جيدا.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من حل HBV المؤتلف إلى جانب واحد من لوحة 96-جيدا.
  6. بعد يوم واحد من العدوى، وغسل الخلايا المصابة 3 مرات مع 300 ميكرولتر PBS لكل بئر لإزالة البروتين مراسل فاسد من جزء الفيروس.
  7. احتضان الخلايا المصابة في 200 ميكرولتر من مستنبت تحتوي على 2٪ DMSO لمدة أسبوع واحد أو أقل.

3. تحليل

  1. بعد أسبوع واحد العدوى، وغسل الخلايا المصابة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من تحلل العازلة للخلايا المصابة.
  3. موسيقى الروك لوحة الثقافة لمدة 5 دقائق، ثم الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة مراسل في لوحة luminometer.
  5. إضافة 20 ميكرولتر من المحللة الخلية إلى لوحة luminometer تحتوي على الركيزة المراسل. مزيج من قبل vortexing لفترة وجيزة.
  6. وضع لوحة في luminometer وبدء القراءة 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويبين الشكل 1 تخطيطي للجينوم فيروس التهاب الكبد B، الرنا كتب والبروتينات الفيروس والمنطقة الترميز على الجينوم. وأشار أيضا الجين مراسل وموقعها في الجينوم. ويبين الشكل 2 HBV البلازميد مراسل ومساعد البلازميد التي تحتوي على الجين المراسل. شيد مراسل pUC1.2HBV / NL بحذف مواقف النوكليوتيدات 223-811 من موقع بدء النسخ من preCore مرنا من pUC1.2HBV 16 ثم ادخال الجين المراسل. تم إنشاء pUC1.2HBVdelta مع الطفرات نقطة في تسلسل إشارة encapsidation من الطفرات موقع الموجه PCR. تم هضمها مراسل البلازميد (pUC1.2HBV / NL) وبلازميد المساعد (pUC1.2HBVdelta) مع هين dIII وايكو RI، ثم تعرض لالكهربائي للهلام. ويبين الفرق المتوقع، والتي هي 3،0 كيلو بايت لالبلازميد تقوم تقنية و 3.5 كيلوبايت لل1.2HBV / NL أو 1.2HBVdelta، في الشكللدى عودتهم 2B. ويبين الشكل 3 خلايا HepG2 معربا عن NTCP بفيروس التهاب الكبد البائي المؤتلف. لإنشاء خلايا HepG2 التعبير عن مستقر NTCP، و transfected خلايا HepG2 مع ترميز pCAN-NTCP-MYC NTCP-MYC والجينات المقاومة بالنيوميسين. وقد تم اختيار استنساخ الخلايا مقاومة للG418 وتوسيع نطاقها. وHepG2-NTCP-MYC-clone22 هو عرضة للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي. وتعرض لست] من HepG2 أو HepG2-NTCP-MYC-clone22 إلى النشاف الغربي. NTCP هو بروتين سكري من 349 الأحماض الأمينية، مع N-محطة خارج الخلية التي تحتوي على موقعين بالغليكوزيل N مرتبطة (Asn5 وAsn11). وترد كيلو دالتون الفرقة 43 من unglycosylated NTCP والفرقة 65 كيلو دالتون من الغليكوزيلاتي 10 في الشكل 3A. خلايا HepG2-NTCP-MYC-clone22 معربا عن NTCP، ولكن ليس على الخلايا HepG2، كانت عرضة للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف. ويبين الشكل 4 حركية الجين مراسل (A و B)، RNA فيروس والحمض النووي (أ) مستويات في المؤتلف المصابين HBV HepG2-NTCP-MYC استنساخ22 (أ) أو الخلايا الكبدية الأولية (PHH) الإنسان (B). ورفع مستويات HBV الحمض النووي الريبي والنشاط الصحفي في 3 أيام بعد الإصابة في HepG2-NTCP-MYC-clone22 أو خلايا PHH. في المقابل، لم يكن هناك تغيير في مستويات الحمض النووي في 9 أيام بعد الإصابة بسبب الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف هو ناقص لالأساسية وظيفي وبول التي لها دور مهم في الخلايا مسار تكرار الحمض النووي. ويبين الشكل 5 تثبيط الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف من التهاب الكبد B الغلوبولين المناعي (HBIG)، الهيبارين وIFN-β. مثبطات دخول مثل HBIG والهيبارين قمعت بشدة النشاط مراسل بنسبة أقل من 10٪ في 75 U / مل و 150 U / مل، على التوالي، في حين قمعت الإنترفيرون β النشاط مراسل بنسبة أقل من 50٪ في 1000 U / مل. وكان تأثير كابح بشكل خاص من هذه المثبطات تعتمد الجرعة. ويبين الشكل 6 دورة حياة الالتهاب الكبدي الوبائي.

شكل 1
فاي جوري 1: رسم تخطيطي للجينوم فيروس الالتهاب الكبدى ب والموقع النسبي من الحمض النووي الريبي فيروس والبروتينات على الجينوم. يظهر الالتهاب الكبدي الوبائي الحمض النووي عن طريق قوس باللون الأسود. يظهر الموقع الجغرافي للمحسن والمروجين لنسخ من الرنا فيروس على قوس باللون الأصفر. ويمثل موقع الرنا الفيروسي والبروتينات على الجينوم من السهام مع خطوط زرقاء منقطة (RNA) ومع السهام الملونة (البروتينات)، على التوالي. يتم التمييز الرنا الفيروس عن طريق حجم: 3.5 كيلو بايت و 3.4 كيلوبايت من mRNAs تشير PreCore / C و RNA pregenomic / الأساسية، على التوالي، 2.5 و 2.1 الرنا كيلوبايت تمثل preS1 وpreS2 / S، على التوالي، والحمض النووي الريبي 0.8 كيلوبايت يشير X الجين 17. يتم استبدال الجين مراسل حسب حجم ذات الصلة من تسلسل الترميز الأساسية. هو الدافع وراء هذا الجين مراسل التي كتبها مروج الأساسية التي تحتوي على محسن الثاني. برو: منظم، EnhI / المؤيد: محسن I / المروج، EnhII / برو: EnhancerII / المروج، بول: البلمرة، S: المستضد السطحي. الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: رسم تخطيطي لتوليد HBV المؤتلف. (أ) خطوط زرقاء تشير إلى الحمض النووي الريبي pregenome. يمثل "أ" تمتد بولي وفي محطة 3'. وتشير الصناديق الزرقاء المنطقة الترميز لكل بروتين الفيروس. يشير مربع أحمر الجين مراسل ترجم من كودون بدء الخاصة بها. البلازميد مراسل لا يمكن ان تنتج PreCore وبول، والبلازميد المساعد يحتوي على 2 طفرات في إشارة encapsidation (CTGTGCC إلى CTATGTC) يعبر عن بروتينات الالتهاب الكبدي الوبائي. E: إشارة Encapsidation. تم هضمها (ب) البلازميد مراسل البلازميد المساعد وتقوم تقنية البلازميد مع ايكو RI وهين dIII. وتعرض هذه البلازميدات هضمها لالكهربائي للهلام.إعلان / 54849 / 54849fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): HBV المؤتلف يصيب HepG2 معربا عن NTCP. (A) وأنشئ خط الخلية مستقرة التعبير عن NTCP من قبل ترنسفكأيشن من خلايا HepG2 مع ترميز البلازميد الموسومة Myc على-NTCP تليها التحديد مع 500 ميكروغرام / مل من G418 لمدة 3 أسابيع. مستوى NTCP. Myc على خلايا HepG2 يعبرون عن مستقر NTCP (HepG2-NTCP. Myc على-clone22) خلايا تم تحديدها من قبل النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة Myc على (1: 1000 تمييع). أصيب (ب) خلايا HepG2-NTCP. Myc على-clone22 مع الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف في وجود 2٪ DMSO و 4٪ PEG8000. في 72 ساعة بعد الإصابة، تم تحديد مستوى النشاط مراسل بواسطة فحص المراسل. النتائج هي ممثل لثلاث تجارب مستقلة، وأشرطة الخطأ تظهر الالانحرافات الإلكترونية القياسية وسائل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: دورة الوقت من العدوى المؤتلف. أصيب (أ) الخلايا HepG2-NTCP. Myc على-clone22 مع الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف في وجود 2٪ DMSO و 4٪ PEG8000. تم تحديد مستوى العدوى عن طريق النشاط مراسل (الخط الأسود) في 3 أو 6 أو 9 أيام بعد الإصابة. تم قياس مستويات HBV الحمض النووي الريبي (الخط الأزرق) والحمض النووي (الخط البرتقالي) في وقت واحد من قبل RT-PCR و PCR 15، على التوالي، في كل نقطة زمنية العدوى. (ب) خلايا الكبد البشرية الابتدائية (PHH)، معزولة عن يوروكيناز من نوع المنشط plasminogen المعدلة وراثيا / الفئران SCID تلقيح مع PHH، كانوا مصابين بفيروس الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف في presenc(ه) من 2٪ DMSO و 4٪ PEG8000. تم تحديد مستوى العدوى من النشاط الصحفي في 3 أو 6 أو 9 أيام بعد الإصابة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: تأثير يعرف وكلاء مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي في العدوى المؤتلف. أصيب HepG2-NTCP. Myc على 22 خلايا مع الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف في وجود HBIG، الهيبارين والإنترفيرون β في الجرعات المشار إليها، فضلا عن 2٪ DMSO و 4٪ PEG8000. تم تحديد مستوى تكرار الالتهاب الكبدي الوبائي (A) وبقاء الخلية (ب) حسب النشاط الصحفي بعد 6 أيام من العدوى. HBIG هي الأجسام المضادة التي يحيد عدوى الالتهاب الكبدي الوبائي والهيبارين هو المانع للبحث عن الفيروسات يلفها. النتائج هي ممثل لثلاث تجارب مستقلة، وأشرطة الخطأ تظهر الانحرافات المعيارية من وسائل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: رسم تخطيطي لدورة الحياة الالتهاب الكبدي الوبائي. يدخل الالتهاب الكبدي الوبائي في الخلايا من خلال مستقبلات الفيروس بما في ذلك NTCP. ، القفيصة المرتبطة DNA دائري استرخاء (rcDNA) هي غير المصقول وتحويلها إلى إغلاق تساهميا DNA دائري (cccDNA) في النواة. وظائف cccDNA كنموذج لنسخ الرنا المرسال. وencapsidated الحمض النووي الريبي الجيني لقفيصة الفيروس عن طريق تجميع مع البروتينات لالأساسية وبول. قبل مواصلة تجميع مع البروتينات HBS، وتشارك القفيصة في تضخيم HBV الحمض النووي عن طريق عملية تسمى عملية النسخ المتماثل cccDNA. يتم إطلاق جزيئات الفيروس تجميعها مع البروتينات HBS في نهاية المطاف خارج الخلية.ام / ملفات / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الجينوم HBV أربعة إطارات الابتدائية مفتوحة القراءة (ORFS) بما في ذلك النواة، البلمرة، السطحية وX ORFS (الشكل 1). وينظم النسخ من هذه ORFS أربعة HBV بإحكام من قبل أربعة مروجين: المروج precore / الأساسية التي تحتوي على محسن الثاني، S1 المروج، والمروج S2 وX المروج التي تحتوي على محسن عمري 18 سنة. وترجم من mRNAs 3.5 كيلو بايت و 3.4 كيلوبايت إلى PreCore والأساسية البروتينات، على التوالي. يتم إنتاج بروتين ظرف كبير (L) من أكبر مرنا subgenomic (2.5 كيلوبايت)، والوسط (M) والبروتينات السطحية الصغيرة (S) يتم تحويل من نص أقصر (2.1 كيلوبايت). نص 0.8 كيلوبايت هو القالب لترجمة X البروتين 19، 20. نهايات 5'و3'من الحمض النووي الريبي pregenomic تحتوي على عدة عناصر رابطة الدول المستقلة الفنية التي تشمل تكرار المباشر 1 (DR1)، DR2 وإشارة التعبئة والتغليف 21، 22. هذه العناصر الوظيفية تحد من إدخال جينات مراسل أو علامة في الحمض النووي الريبي pregenomic. بنينا HBV المؤتلف باستخدام العابرة للتكامل من متجهين، ناقل نقل تحتوي على الجين مراسل وناقلات المساعد. تم بناء ناقلات نقل عن طريق استبدال المناطق الأساسية وبول مع الجين مراسل (الشكل 2).

وقد تم تحديد NTCP بمثابة مستقبلات الخلوية للدخول HBV 10. لأن التعبير عن NTCP مرنا منخفضة جدا في خلايا HepG2، التي ليست عرضة للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي، وضعنا مستقر خط الخلية HepG2 معربا عن NTCP-MYC (الشكل 3A). في حين العدوى المؤتلف من خلايا HepG2 أظهر أي نشاط المراسل، NTCP التعبير في الخلايا HepG2 يمنحها قابلية للعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف (الشكل 3B). أظهر تحليل الوقت أثناء العدوى المؤتلف أن كلا من النشاط الصحفي وHBV الحمض النووي الريبي ودetectable خلال 3 أيام من العدوى المؤتلف وبلغت ذروتها في 9 أيام بعد العدوى. ومع ذلك، لم تراع زيادة مستويات HBV DNA (الشكل 4). مثبطات دخول، مثل HBIG أو الهيبارين، تحول دون العدوى المؤتلف (الشكل 5). هذه النتائج المشار إليها هذا النظام يمكن أن تستخدم لرصد المبكر تكرار مرحلة الالتهاب الكبدي الوبائي من دخول الفيروس إلى النسخ، ولكن ليس تكرار الحمض النووي وإعادة العدوى من فيروس صدر من الخلايا المصابة (الشكل 6).

منذ البروتين مراسل غالبا ما يلوث جزء HBV المؤتلف، وغسل الفيروس الخلايا مع برنامج تلفزيوني قد ينتج أقل من ثلاث مرات في خلفية عالية. وبالتالي، فمن المهم للتحقق من مستوى الخلفية من خلال قياس النشاط الصحفي في المتوسط ​​من HepG2-HBV غير سريع التأثير تعامل مع الفيروس المؤتلف. إذا كانت الخلفية عالية، إضافة خطوة الغسيل (3 مرات غسيل مع 300 ميكرولتر PBS لكل بئر في لوحة 96-جيدا) للفرنكا اليومخام خطوة 3.1.

إذا كان إنتاج HBV المؤتلف منخفض، والتحقق من كفاءة ترنسفكأيشن مع البلازميد السيطرة التعبير عن بروتين فلوري مثل GFP أو عن dsRed. بشكل عام، يجب أن تكون كفاءة ترنسفكأيشن من خلايا HepG2 أكبر من 35٪. اذا كانت كفاءة ترنسفكأيشن منخفضة، وتحسين ظروف ترنسفكأيشن محددة لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن عالية. اذا كانت كفاءة ترنسفكأيشن عالية، تحقق ما إذا كان ينتج الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف المعدية عن طريق استخدامه لتصيب خلايا الكبد البشرية الأساسية. العدوى من فيروس التهاب الكبد B لخلايا الكبد البشرية الأولية عادة ما يكون أعلى من أن خطوط الخلايا الكبدي معربا عن NTCP. في حال تحقق العدوى كفاءة HBV المؤتلف في خلايا الكبد البشرية الأساسية، والمشكلة ليست في HBV المؤتلف ولكن الخلايا للإصابة. إنشاء عدد من الحيوانات المستنسخة HepG2 مستقرة التعبير عن NTCP وحدد استنساخ الخلايا شديدة العدوى. انخفاض confluency خلية في الثقافة في ذلك الوقت من العدوى قد يؤدي ذلك إلى ضعف طnfectivity. زيادة عدد الخلايا في الثقافة يحسن كفاءة العدوى. لعدوى الالتهاب الكبدي الوبائي، 80-95٪ confluency للخلايا HepG2 معربا عن NTCP في وقت العدوى يوفر نسبة الإصابة عالية.

تم الإبلاغ عن تطوير العديد HBVs مراسل العديد من المجموعات 11 و 12 و 13، ولكن معظم هذه HBVs مراسل اظهار ضعف إنتاجية. وعلاوة على ذلك، فإن النشاط الصحفي في الخلايا المصابة ليست عالية كما، وسيكون من الصعب استخدام لفحص مضادات الالتهاب الكبدي الوبائي باستخدام فحص عالية الإنتاجية. في المقابل، لدينا نظام مراسل HBV تنتج إشارة مراسل قوية في الخلايا المصابة التي تجعل من السهل لإجراء فحص شامل لوكلاء مكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي باستخدام كمية صغيرة نسبيا من الفيروس مقارنة للفيروسات مراسل الأخرى التي ذكرت حتى الآن.

هنا، ولدت لنا نظام مراسل HBV رواية لمراقبة المراحل المبكرة منتم التحقق دورة النسخ المتماثل الالتهاب الكبدي الوبائي وذلك من خلال قياس نشاط البروتين مراسل بعد الإصابة. وصف الأسلوب هو نظام ناقل HBV بسيطة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة، وسوف يكون من المفيد لتحديد العوامل المضيفة الالتهاب الكبدي الوبائي وكذلك المركبات المضادة للفيروس التهاب الكبد B باستخدام أساليب الفحص الإنتاجية العالية. في الواقع، حددنا العوامل المضيفة الالتهاب الكبدي الوبائي والجينات لمكافحة الالتهاب الكبدي الوبائي من كامل الجينوم تكنولوجيا رني 15. من المذكرة، وهذا النظام غير مناسب لتقييم المراحل المتأخرة من تكرار HBV مثل خطوة تكرار الحمض النووي، القفيصة، والتجمع فيروس، وفي مهدها، لأن الالتهاب الكبدي الوبائي المؤتلف هو ناقص لإنتاج نواة وظيفي وبول. مطلوب مزيد من تطوير HBV المؤتلف لتقييم كامل دورة حياة الالتهاب الكبدي الوبائي.

باختصار، هذا النظام يمكن أن تستخدم لتقييم العدوى عن طريق قياس النشاط الصحفي. لذلك، ليست هناك حاجة لإجراء فحص تقنيات معقدة مثل PCR، RT-PCR،HBV الأساسية أو S مستضد ELISA لتقييم العدوى / النسخ المتماثل. وأخيرا، لأن هذا الالتهاب الكبدي الوبائي المراسل هو غير كفء تكرارها، ليس هناك خطر من العدوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127, (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13, (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44, (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33, (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106, (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456, (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4, (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87, (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7, (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106, (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44, (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9, (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3, (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42, (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370, (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344, (6266), 552-555 (1990).
تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter