Summary

Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor

Published: February 01, 2017
doi:

Summary

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde hepatitis B-virus (HBV) reportersysteem de vroege stadia van de levenscyclus HBV controleren. Deze vereenvoudigde in vitro systeem zal helpen bij het screenen van anti-HBV middelen met een high-throughput strategie.

Abstract

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Introduction

Chronische infectie met hepatitis B-virus (HBV) is een belangrijke risicofactor voor chronische leverziekten 1. Hoewel de huidige therapeutische strategieën gebaseerd op nucleotide analogen die HBV pol functie en / of de toediening van type I interferon dat immuunresponsen bij geïnfecteerde individuen geactiveerd als indirect onderdrukt HBV proliferatie doorgaande interferon gestimuleerde genfuncties 2 remmen, kunnen deze behandelingen niet HBV elimineren DNA volledig 3. Bovendien is de opkomst van HBV die resistent zijn tegen anti- pol middelen zijn baart 4. De toediening van gecombineerde antivirale middelen direct gericht de verschillende stappen van humaan immunodeficiëntievirus (HIV) of hepatitis C virus (HCV) levenscyclus bleek succesvol onderdrukken of uitroeien virus (sen). Soortgelijke dit idee, de ontwikkeling van anti-HBV middel (en) die direct aan de verschillende stadia van de H handelenBV life cycle is van belang voor de vaststelling van de toekomstige HBV therapieën.

In het algemeen, het opzetten van een eenvoudige in vitro kweeksysteem van het doelwit virus vergemakkelijkt de ontwikkeling van anti-virus middelen. Er zijn echter ten minste twee belemmeringen voor de ontwikkeling van in vitro kweeksystemen voor het screenen van anti-HBV middelen. De eerste is het ontbreken van een geschikt in vitro celkweeksysteem voor HBV-infectie / proliferatie. In tegenstelling tot andere virussen, zoals HIV en HCV, die zijn gekweekt in gevestigde cellijnen, is het moeilijk om HBV kweken in vitro door experimentele beperkingen waaronder een smal gastheerbereik. Het gebruik van specifieke celkweek systemen zoals het humane hepatoma cellijn HepaRG, dat gevoelig is voor HBV-infectie, 5, 6, 7 zijn ontwikkeld om deze problemen te overwinnen. Bovendien PXB cellen, geïsoleerd van urokinase-type plasminogeenactivator transgene / SCID-muizen geïnoculeerd met primaire humane hepatocyten (PHH), bleken gevoelig voor HBV-infectie en replicatie 8 te zijn. Echter, HBV replicatie niveaus HepaRG zijn afhankelijk van de celdifferentiatie toestand na cultuur die inconsistent en reproduceerbare resultaten van HBV-infectie / replicatie niveaus veroorzaken. PXB wordt gebruikt voor HBV-infectie experimenten maar is beperkt door de beschikbaarheid. Een tetracycline induceerbare HBV expressie cellijn HepAD38 is ook op grote schaal gebruikt voor HBV replicatie studie, maar dit systeem staat slechts evaluatie na transcriptie en niet instaphulp HBV infectie 9. Onlangs heeft de identificatie van natriumtaurocholaat (Ntcp) als een functionele receptor voor HBV kon de ontwikkeling van een variabele HBV kweeksysteem 10. Inderdaad, NTCP expressie in niet-gevoelige hepatocarcinoma cellen zoals Huh7 enHepG2 maakt HBV-infectie 10 en derhalve is de keuze van HBV gevoelige cellijnen uitgebreid, oplossen vele experimentele beperkingen. Het tweede probleem is het gebrek aan een eenvoudig testsysteem HBV-infectie en replicatie evalueren. Evaluatie van HBV-infectie wordt gewoonlijk uitgevoerd door het analyseren van HBV DNA, RNA en eiwitten. Echter, kwantificering van deze markers virus is tijdrovend, duur en vaak niet altijd eenvoudig. Daarom is de ontwikkeling van een eenvoudig testsysteem, zoals het gebruik van een reportergen, kunnen problemen met HBV testsystemen overwinnen.

Omdat het genoom grootte die kan worden verpakt in een HBV capside beperkt – minder dan 3,7 kb 11 – de grootte van een reportergen moeten zo kort mogelijk zijn. Bovendien is de aanwezigheid van meerdere cis- elementen verspreid door het genoom, die essentieel zijn voor virale replicatie, beperkt de beschikbare functies in insertie van het reportergen in het genoom. Verscheidene rapporten hebben geprobeerd om vreemde genen, waaronder HIV-1 Tat, groen fluorescerend eiwit, en DsRed invoegen in het HBV genoom 11, 12, 13. Echter, deze recombinante HBV niet bruikbaar voor het screenen van HBV-infectie / replicatie of voor high-throughput screening van factoren die HBV-infectie / replicatie. Dit komt voornamelijk door de lage productiviteit van recombinante virussen en de verminderde intensiteit van reportergenexpressie veroorzaakt door inefficiënte virusproductie.

Om deze problemen te overwinnen, geconstrueerd we een reporter HBV met een hoge opbrengst van virusproductie. Dit virus is zeer gevoelig voor de controle van de vroege stadia van de replicatiecyclus HBV, from entry transcriptie. Hiervoor NanoLuc (NL) gekozen als een merkergen omdat het een klein (171 aminozuren) ontworpen luminescente reporterclass = "xref"> 14. Bovendien NL is ongeveer 150 maal helderder dan vuurvlieg en Renilla luciferase, en de luminescente reactie ATP-onafhankelijk, wat suggereert dat de valse hit rate laag is voor high-throughput screening zal zijn. De productie-efficiëntie van het recombinante HBV ongeveer 1/5 van de bovenliggende HBV en soortgelijke niveaus over de voorbije HBV recombinante virussen; De helderheid van NL overwint productiviteit virus problemen zodat het kan worden gebruikt voor de massale screening van anti-HBV middelen.

Screening van anti-HBV middelen gebruikmakend van primaire hepatocyten kan HepaRG, HepAD38 en NTCP getransduceerde hepatocyten bruikbaar voor het screenen van anti-HBV middelen met gebruikelijke methode (en). De hier beschreven systeem heeft diverse voordelen, zoals eenvoudige bediening, hoge gevoeligheid en lage kosten voor screening. Deze voordelen zijn geschikt voor high throughput assays te ontwikkelen en identificeren van nieuwe HBV middelen voor therapeutische doeleinden.

Protocol

1. Productie van recombinant HBV coderen de reporterproteïne Bereiding van HepG2-cellen Bereid celkweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 100 U / ml niet-essentiële aminozuren). Plaat 4 x 10 6 HepG2 cellen in een 10-cm-collageen gecoate schaal in 10 ml kweekmedium de dag voor transfectie. Incubeer HepG2 cellen bij 37 ° C in een bevochti…

Representative Results

Figuur 1 toont een schema van het HBV genoom getranscribeerd RNA, virus eiwitten en hun coderende gebied op het genoom. Het reportergen en de ligging in het genoom zijn ook aangegeven. Figuur 2 toont de HBV reporterplasmide en helper plasmide dat het reporter gen. De pUC1.2HBV / NL reporter werd geconstrueerd door het verwijderen van nucleotideposities 223-811 van de transcriptie initiatie site van de precore mRNA van pUC1.2HBV 16…

Discussion

Het HBV genoom vier belangrijke open leesramen (ORF's), waaronder de kern, polymerase, oppervlak en X ORF (Figuur 1). Transcriptie van deze vier HBV ORF wordt strak gereguleerd door vier initiatiefnemers: de precore / kern promoter met enhancer II, S1 promotor, S2 promotor en X promoter met enhancer I 18. De 3,5 kb en 3,4 kb mRNA's worden vertaald in PreCore en Core eiwitten, respectievelijk. De grote envelop-eiwit (L) wordt geproduceerd uit de grootste subgenomische mRNA…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.

Materials

Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/l-EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14 
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5xBuffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon Reference 15
pUC1.2HBV/NL Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W., Knipe, D., Howley, P. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. , 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).

Play Video

Cite This Article
Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

View Video