Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde hepatitis B-virus (HBV) reportersysteem de vroege stadia van de levenscyclus HBV controleren. Deze vereenvoudigde in vitro systeem zal helpen bij het screenen van anti-HBV middelen met een high-throughput strategie.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Chronische infectie met hepatitis B-virus (HBV) is een belangrijke risicofactor voor chronische leverziekten 1. Hoewel de huidige therapeutische strategieën gebaseerd op nucleotide analogen die HBV pol functie en / of de toediening van type I interferon dat immuunresponsen bij geïnfecteerde individuen geactiveerd als indirect onderdrukt HBV proliferatie doorgaande interferon gestimuleerde genfuncties 2 remmen, kunnen deze behandelingen niet HBV elimineren DNA volledig 3. Bovendien is de opkomst van HBV die resistent zijn tegen anti- pol middelen zijn baart 4. De toediening van gecombineerde antivirale middelen direct gericht de verschillende stappen van humaan immunodeficiëntievirus (HIV) of hepatitis C virus (HCV) levenscyclus bleek succesvol onderdrukken of uitroeien virus (sen). Soortgelijke dit idee, de ontwikkeling van anti-HBV middel (en) die direct aan de verschillende stadia van de H handelenBV life cycle is van belang voor de vaststelling van de toekomstige HBV therapieën.

In het algemeen, het opzetten van een eenvoudige in vitro kweeksysteem van het doelwit virus vergemakkelijkt de ontwikkeling van anti-virus middelen. Er zijn echter ten minste twee belemmeringen voor de ontwikkeling van in vitro kweeksystemen voor het screenen van anti-HBV middelen. De eerste is het ontbreken van een geschikt in vitro celkweeksysteem voor HBV-infectie / proliferatie. In tegenstelling tot andere virussen, zoals HIV en HCV, die zijn gekweekt in gevestigde cellijnen, is het moeilijk om HBV kweken in vitro door experimentele beperkingen waaronder een smal gastheerbereik. Het gebruik van specifieke celkweek systemen zoals het humane hepatoma cellijn HepaRG, dat gevoelig is voor HBV-infectie, 5, 6, 7 zijn ontwikkeld om deze problemen te overwinnen. Bovendien PXB cellen, geïsoleerd van urokinase-type plasminogeenactivator transgene / SCID-muizen geïnoculeerd met primaire humane hepatocyten (PHH), bleken gevoelig voor HBV-infectie en replicatie 8 te zijn. Echter, HBV replicatie niveaus HepaRG zijn afhankelijk van de celdifferentiatie toestand na cultuur die inconsistent en reproduceerbare resultaten van HBV-infectie / replicatie niveaus veroorzaken. PXB wordt gebruikt voor HBV-infectie experimenten maar is beperkt door de beschikbaarheid. Een tetracycline induceerbare HBV expressie cellijn HepAD38 is ook op grote schaal gebruikt voor HBV replicatie studie, maar dit systeem staat slechts evaluatie na transcriptie en niet instaphulp HBV infectie 9. Onlangs heeft de identificatie van natriumtaurocholaat (Ntcp) als een functionele receptor voor HBV kon de ontwikkeling van een variabele HBV kweeksysteem 10. Inderdaad, NTCP expressie in niet-gevoelige hepatocarcinoma cellen zoals Huh7 enHepG2 maakt HBV-infectie 10 en derhalve is de keuze van HBV gevoelige cellijnen uitgebreid, oplossen vele experimentele beperkingen. Het tweede probleem is het gebrek aan een eenvoudig testsysteem HBV-infectie en replicatie evalueren. Evaluatie van HBV-infectie wordt gewoonlijk uitgevoerd door het analyseren van HBV DNA, RNA en eiwitten. Echter, kwantificering van deze markers virus is tijdrovend, duur en vaak niet altijd eenvoudig. Daarom is de ontwikkeling van een eenvoudig testsysteem, zoals het gebruik van een reportergen, kunnen problemen met HBV testsystemen overwinnen.

Omdat het genoom grootte die kan worden verpakt in een HBV capside beperkt - minder dan 3,7 kb 11 - de grootte van een reportergen moeten zo kort mogelijk zijn. Bovendien is de aanwezigheid van meerdere cis- elementen verspreid door het genoom, die essentieel zijn voor virale replicatie, beperkt de beschikbare functies in insertie van het reportergen in het genoom. Verscheidene rapporten hebben geprobeerd om vreemde genen, waaronder HIV-1 Tat, groen fluorescerend eiwit, en DsRed invoegen in het HBV genoom 11, 12, 13. Echter, deze recombinante HBV niet bruikbaar voor het screenen van HBV-infectie / replicatie of voor high-throughput screening van factoren die HBV-infectie / replicatie. Dit komt voornamelijk door de lage productiviteit van recombinante virussen en de verminderde intensiteit van reportergenexpressie veroorzaakt door inefficiënte virusproductie.

Om deze problemen te overwinnen, geconstrueerd we een reporter HBV met een hoge opbrengst van virusproductie. Dit virus is zeer gevoelig voor de controle van de vroege stadia van de replicatiecyclus HBV, from entry transcriptie. Hiervoor NanoLuc (NL) gekozen als een merkergen omdat het een klein (171 aminozuren) ontworpen luminescente reporterclass = "xref"> 14. Bovendien NL is ongeveer 150 maal helderder dan vuurvlieg en Renilla luciferase, en de luminescente reactie ATP-onafhankelijk, wat suggereert dat de valse hit rate laag is voor high-throughput screening zal zijn. De productie-efficiëntie van het recombinante HBV ongeveer 1/5 van de bovenliggende HBV en soortgelijke niveaus over de voorbije HBV recombinante virussen; De helderheid van NL overwint productiviteit virus problemen zodat het kan worden gebruikt voor de massale screening van anti-HBV middelen.

Screening van anti-HBV middelen gebruikmakend van primaire hepatocyten kan HepaRG, HepAD38 en NTCP getransduceerde hepatocyten bruikbaar voor het screenen van anti-HBV middelen met gebruikelijke methode (en). De hier beschreven systeem heeft diverse voordelen, zoals eenvoudige bediening, hoge gevoeligheid en lage kosten voor screening. Deze voordelen zijn geschikt voor high throughput assays te ontwikkelen en identificeren van nieuwe HBV middelen voor therapeutische doeleinden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Productie van recombinant HBV coderen de reporterproteïne

  1. Bereiding van HepG2-cellen
    1. Bereid celkweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 100 U / ml niet-essentiële aminozuren).
    2. Plaat 4 x 10 6 HepG2 cellen in een 10-cm-collageen gecoate schaal in 10 ml kweekmedium de dag voor transfectie. Incubeer HepG2 cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator.
      Opmerking: Als er ongeveer 4 x 10 6 HepG2-cellen uitgeplaat in 10 cm-collageen gecoate schaal in 10 ml kweekmedium, worden ze 70-90% confluent de volgende dag.
  2. transfectie
    1. Transfecteren HepG2 cellen met 5 ug pUC1.2HBV delta epsilon 15 en 5 ug pUC1.2HBV / NL 15 transfectie met eenreagens volgens de instructies van de fabrikant.
    2. De volgende dag, verwijder het kweekmedium en voeg 10 ml vers kweekmedium.
    3. Eén week na transfectie, breng het kweekmedium dat het recombinante HBV een ml-buis 50 en verder met stap 1.3.1. Voeg 10 ml vers kweekmedium aan de plaat die de getransfecteerde cellen.
      OPMERKING: Productie van de recombinante HBV wordt gedurende 4 weken. Het kweekmedium dat recombinant HBV gedurende 1 maand opgeslagen bij 4 ° C.
  3. Zuivering van recombinant HBV
    1. Celafval te verwijderen uit het kweekmedium dat recombinant HBV door centrifugatie (2300 g gedurende 5 minuten).
    2. Passeer de bovenstaande vloeistof door een 0,45 urn membraanfilter.
    3. Voeg een gelijk volume van 26% PEG / 1,5 M NaCl (polyethyleenglycol 6000: 130 g NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 en 5 ml 1 M HEPES pH 7,6 in 500 ml) aan het kweekmedium die recombinanteHBV en meng voorzichtig. Incubeer overnacht bij 4 ° C.
    4. Centrifugeer bij 2300 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
    5. Verwijder het supernatant en los de pellet in 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
    6. Verwijder de resten door centrifugatie bij 2300 xg gedurende 5 minuten.
    7. Load 0,5 ml TNE die recombinante HBV op 0,8 ml van 20% sucrose in TNE.
    8. Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 3 uur bij 15 ° C.
    9. Gooi zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk, en bewaar de pellet. Resuspendeer in 1 ml serumvrij DMEM per 40 ml kweekmedium starten.
    10. Incubeer overnacht bij 4 ° C.
    11. Filtreer door een 0,45 pm filter. Bereid 0,5 ml porties en bewaar bij -80 ° C.
      LET OP: Als reporter eiwit verontreiniging van het oorspronkelijke virus monster wordt waargenomen, te zuiveren van het virus door dichtheidsgradiënt ultra-centrifugeren van 5-30% sucrose in TNE bij 100.000 xg gedurende 2 uur, of CsCl dichtheid evenwicht gebracht centrifugeren weerm 1,1-1,6 g / ml bij 150.000 xg gedurende 50 uur.

2. Infectie van Recombinant HBV

  1. Cultuur HepG2-cellen stabiel tot expressie NTCP (HepG2 / NTCP) 15 die vatbaar zijn voor HBV-infectie in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 250 ug / ml G-418 en 100 U / ml zijn essentiële aminozuren bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator.
  2. Een dag voor infectie, plaat van ongeveer 5 x 10 4 HepG2 / NTCP cellen 14 in een 96-well collageen beklede plaat in 0,1 ml kweekmedium.
  3. Dooi recombinant HBV in een 37 ° C waterbad totdat er een klein stukje in de injectieflacon ijs.
  4. Bereid het medium voor infectie door het volgende te combineren: 10 pl 40% PEG8000 in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 2 pl dimethylsulfoxide (DMSO), 10 gl recombinant HBV en 78 pl vers kweekmediumper putje van een 96-wells plaat.
  5. Voeg 100 gl recombinant HBV oplossing een putje van de 96-well plaat.
  6. Eén dag na infectie was de geïnfecteerde cellen 3 maal met 300 pi PBS per putje om de verontreinigende reporter eiwit van het virus fractie te verwijderen.
  7. Incubeer geïnfecteerde cellen in 200 gl kweekmedium dat 2% DMSO gedurende één week of minder.

3. Analyse

  1. Eén week na infectie was de geïnfecteerde cellen 3 maal met PBS.
  2. Voeg 50 ul lysisbuffer aan de geïnfecteerde cellen.
  3. Rock de cultuur plaat gedurende 5 minuten, en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 5 minuten.
  4. Voeg 50 ul van de verslaggever substraat in de luminometer plaat.
  5. Voeg 20 ul cellysaat een luminometer plaat die het reporter substraat. Meng door vortexen kort.
  6. Plaats de plaat in de luminometer en start het lezen van 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figuur 1 toont een schema van het HBV genoom getranscribeerd RNA, virus eiwitten en hun coderende gebied op het genoom. Het reportergen en de ligging in het genoom zijn ook aangegeven. Figuur 2 toont de HBV reporterplasmide en helper plasmide dat het reporter gen. De pUC1.2HBV / NL reporter werd geconstrueerd door het verwijderen van nucleotideposities 223-811 van de transcriptie initiatie site van de precore mRNA van pUC1.2HBV 16 en vervolgens het plaatsen van de reporter-gen. Het pUC1.2HBVdelta met puntmutaties in het encapsideringssignaal sequentie werd gegenereerd door plaatsgerichte mutagenese PCR. Reporterplasmide (pUC1.2HBV / NL) en helper plasmide (pUC1.2HBVdelta) werden gedigereerd met HindIII en EcoRI en vervolgens onderworpen aan gelelektroforese. De verwachte banden, die 3,0 kb van het pUC plasmide en 3,5 kb voor 1.2HBV / NL of 1.2HBVdelta zijn, worden getoond in Figure 2B. Figuur 3 toont HepG2 cellen die NTCP geïnfecteerd met recombinant HBV. Tot HepG2-cellen stabiel tot expressie NTCP stellen, werden HepG2-cellen getransfecteerd met PCAN-NTCP-myc coderende NTCP-myc en een neomycine resistentiegen. G418-resistente celklonen werden geselecteerd en uitgebreid. De HepG2-NTCP-myc-clone22 gevoelig voor HBV-infectie. De lysaten van HepG2 of HepG2-NTCP-myc-clone22 werden onderworpen aan western blotting. NTCP is een glycoproteïne van 349 aminozuren, met een extracellulair N-terminus met twee N-gekoppelde glycosylatieplaatsen (Asn11 en Asn5). De 43 kDa band van ongeglycosyleerd NTCP en de 65 kDa band van geglycosyleerd 10 zijn weergegeven in figuur 3A. HepG2-NTCP-myc-clone22 cellen die NTCP, maar HepG2-cellen waren gevoelig voor recombinant HBV-infectie. Figuur 4 toont de kinetiek van het reportergen (A en B), RNA en DNA (A) niveaus recombinant-HBV geïnfecteerde HepG2-NTCP-myc-kloon22 (A) of humane primaire hepatocyten (PHH) cellen (B). De niveaus van HBV RNA en reporter activiteiten werden verhoogd in 3 dagen na infectie van HepG2-NTCP-myc-clone22 of PHH cellen. Daarentegen was er geen verandering in DNA niveaus 9 dagen na infectie omdat recombinant HBV deficiënt voor functionele kern en pol die een belangrijke rol in de intracellulaire DNA replicatie reactieketen. Figuur 5 toont de remming van recombinant HBV door het hepatitis B-immunoglobuline (immuunglobulinen), heparine en IFN-β. Entry inhibitoren zoals HBIG en heparine sterk onderdrukt de reporter-activiteit met minder dan 10% bij 75 U / ml en 150 U / ml, respectievelijk, terwijl IFN-β de reporter-activiteit onderdrukt door minder dan 50% bij 1000 U / ml. Het remmende effect van deze remmers was dosisafhankelijk. Figuur 6 toont de levenscyclus van HBV.

Figuur 1
Fi figuur 1: Schema van het HBV genoom en relatieve locatie van RNA en eiwitten op het genoom. HBV-DNA wordt aangegeven met een boog in zwart. De locatie van de enhancer en promoters voor de transcriptie van RNA virus op de boog wordt getoond in geel. De locatie van virale RNA en eiwitten op het genoom zijn weergegeven door pijlen met gestippelde blauwe lijnen (RNA) en met gekleurde pijlen (eiwitten), respectievelijk. Virus RNAs worden gediscrimineerd op grootte: 3,5 kb en 3,4 kb mRNA's geven PreCore / C en pregenome RNA / Core respectievelijk 2,5 en 2,1 kb RNA vertegenwoordigen preS1 en preS2 / S, respectievelijk, en het 0,8 kb RNA geeft X 17 gen. Een reportergen is vervangen door de relevante afmeting van de kern coderende sequentie. Het reportergen wordt aangestuurd door een kernpromoter met enhancer II. Pro: Promotor, EnhI / pro: Enhancer I / promotor, EnhII / Pro: EnhancerII / promotor, Pol: Polymerase, S: Surface-antigeen. target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Schema voor de productie van recombinante HBV. (A) Blauwe lijnen geven de pregenome RNA. De "A" vertegenwoordigt stretch poly A aan het 3'-uiteinde. Blauwe vakken geven het coderende gebied voor elk virus eiwit. Het rode vak geeft een reportergen vertaald uit eigen initiatiecodon. Het reporterplasmide kan geen PreCore en Pol en het helper plasmide bevattende 2 mutaties in het encapsideringssignaal (CTGTGCC tot CTATGTC) drukt alle HBV eiwitten. E: encapsideringssignaal. (B) Het reporterplasmide, helperplasmide en pUC plasmide gedigereerd met EcoRI en HindIII. Deze gedigereerde plasmiden werden onderworpen aan gelelektroforese.ad / 54849 / 54849fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Recombinant HBV infecteert HepG2 uitdrukken NTCP. (A) Een stabiele cellijn die NTCP werd vastgesteld door de transfectie van HepG2-cellen met een plasmide coderend voor Myc-gelabeld NTCP gevolgd door selectie met 500 ug / ml G418 gedurende 3 weken. Het niveau van NTCP-Myc in HepG2-cellen stabiel tot expressie NTCP (HepG2-NTCP-Myc-clone22) cellen werd bepaald door Western blotting met behulp van anti-Myc antilichamen (1: 1000 verdunning). (B) HepG2-NTCP-Myc-clone22 cellen werden geïnfecteerd met recombinant HBV bij aanwezigheid van 2% DMSO en 4% PEG8000. Op 72 uur na infectie, het niveau van de reporter-activiteit werd bepaald door reporter assay. Resultaten zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten, en foutbalken tonen the standaardafwijkingen van de middelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Tijdsverloop van recombinant HBV-infectie. (A) HepG2-NTCP-Myc-clone22 cellen werden geïnfecteerd met recombinant HBV bij aanwezigheid van 2% DMSO en 4% PEG8000. Het niveau van HBV-infectie werd bepaald door reporteractiviteit (zwarte lijn) en 3, 6 of 9 dagen na infectie. Niveaus van HBV RNA (blauwe lijn) en DNA (oranje lijn) werden gelijktijdig gemeten met behulp van RT-PCR en PCR respectievelijk 15, bij elke infectie tijdstip. (B) primaire humane hepatocyten (PHH), geïsoleerd van urokinase-type plasminogeenactivator transgene / SCID-muizen geïnoculeerd met PHH, werden geïnfecteerd met recombinant HBV in de Presence van 2% DMSO en 4% PEG8000. Het niveau van HBV-infectie werd bepaald door reporter activiteit bij 3, 6 of 9 dagen na infectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Effect van bekende anti-HBV middelen op recombinant HBV-infectie. HepG2-NTCP-Myc-22 cellen werden geïnfecteerd met recombinant HBV in aanwezigheid van HBIG, heparine en IFN-β bij de aangegeven doses, en 2% DMSO en 4% PEG8000. Het niveau van HBV replicatie (A) en de cellevensvatbaarheid (B) werd bepaald door reporteractiviteit 6 dagen na infectie. HBIG is een antilichaam dat HBV-infectie neutraliseert en heparine is een remmer voor omhulde virussen. Resultaten zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten, en foutbalken tonen de standaarddeviatie van de middelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6: Schema van de HBV levenscyclus. HBV gaat in cellen door virus receptoren waaronder NTCP. -Capside geassocieerde relaxed circulair DNA (rcDNA) onbekleed en omgezet in covalent gesloten circulair DNA (cccDNA) in de kern. cccDNA functioneert als sjabloon voor mRNA transcriptie. Het genomische RNA wordt ingekapseld met het virus capside is geassembleerd met eiwitten voor kern en pol. Voordat u verder assembleren met HBS-eiwitten, is het capside die betrokken zijn bij het versterken van HBV DNA door een proces genaamd de cccDNA replicatie proces. Virusdeeltjes geassembleerd met HBS eiwitten uiteindelijk vrij buiten de cel.OM / files / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het HBV genoom vier belangrijke open leesramen (ORF's), waaronder de kern, polymerase, oppervlak en X ORF (Figuur 1). Transcriptie van deze vier HBV ORF wordt strak gereguleerd door vier initiatiefnemers: de precore / kern promoter met enhancer II, S1 promotor, S2 promotor en X promoter met enhancer I 18. De 3,5 kb en 3,4 kb mRNA's worden vertaald in PreCore en Core eiwitten, respectievelijk. De grote envelop-eiwit (L) wordt geproduceerd uit de grootste subgenomische mRNA (2,5 kb), en de middelste (M) en de kleine oppervlakte-eiwitten (S) zijn vertaald uit de kortere transcript (2,1 kb). De 0,8 kb transcript is het sjabloon voor de vertaling van de X-eiwit 19, 20. De 5'en 3'uiteinden van pregenome RNA bevatten meerdere functionele cis-elementen die directe herhaling 1 (DR1), DR2 en een verpakkingssignaal 21, 22 omvatten. Deze functionele elementen beperken het inbrengen van reporter of marker genen in de pregenome RNA. Construeerden wij recombinante HBV met trans-complementatie van twee vectoren, een transfervector die het reportergen en een helper vector. De overdrachtsvector werd geconstrueerd door vervanging van de kern en pol gebieden en het reportergen (Figuur 2).

NTCP werd geïdentificeerd als een cellulaire receptor voor HBV nummer 10. Omdat de expressie van mRNA NTCP is zeer laag in HepG2-cellen, die niet gevoelig zijn voor HBV-infectie, hebben we een stabiele cellijn HepG2 NTCP-myc (Figuur 3A). Overwegende dat recombinant HBV infectie van HepG2-cellen vertoonden geen reporter activiteit, NTCP expressie in HepG2-cellen verleende gevoeligheid voor recombinant HBV-infectie (Figuur 3B). Het tijdsverloop analyse van recombinant HBV-infectie aangetoond dat zowel de reporter activiteit en HBV-RNA werden detectable binnen 3 dagen na recombinant HBV-infectie en piekte op 9 dagen na infectie; echter verhoogd HBV DNA niveaus die waargenomen (Figuur 4). Entry inhibitoren, zoals HBIG of heparine, remde recombinant HBV infectie (Figuur 5). Daaruit bleek dit systeem resultaten kunnen worden gebruikt om vroegtijdig HBV replicatie van virussen toegang tot transcriptie, maar niet DNA replicatie en herinfectie van virus vrijgemaakt uit geïnfecteerde cellen (Figuur 6) te volgen.

Aangezien het reporter proteïne vervuilt vaak recombinante HBV fractie, het wassen van de met virus geïnfecteerde cellen met PBS minder dan drie keer kan leiden tot een hoge achtergrond. Daarom is het belangrijk om het achtergrondniveau controleren door reporter-activiteit in medium van HBV-ongevoelig HepG2 behandeld met recombinant virus. Als de achtergrond hoge, voeg een wasstap (3 keer wassen met 300 pl PBS per putje in een 96-wells plaat) de dag beferts stap 3.1.

Als de productie van het recombinante HBV laag is, controleer de transfectie efficiëntie met een controle plasmide tot expressie van een fluorescerend eiwit zoals GFP of DsRed. In het algemeen moet de efficiëntie van transfectie van HepG2-cellen meer dan 35% bedragen. Als de transfectie-efficiëntie is laag, het optimaliseren van specifieke transfectie voorwaarden om hoge transfectie efficiëntie te bereiken. Als de transfectie-efficiëntie hoog is, controleer dan of infectieus recombinant HBV wordt geproduceerd door het te gebruiken om primaire humane hepatocyten te infecteren. Infectiviteit van HBV op primaire humane hepatocyten is meestal hoger dan hepatoma cellijnen NTCP. Indien de efficiënte infectie van recombinant HBV wordt bereikt primaire humane hepatocyten, het probleem is niet het recombinant HBV maar de cellen geïnfecteerd. Opzetten van een aantal stabiele HepG2 klonen die NTCP en selecteer zeer besmettelijke cel klonen. Lage cel confluentie in cultuur ten tijde van de infectie kan leiden tot een slechte infectivity. Verhoging van het aantal cellen in de kweek verbetert de infectie-efficiëntie. HBV-infectie, 80-95% confluentie voor HepG2 cellen die NTCP ten tijde van infectie verschaft een hoge besmettingsgraad.

De ontwikkeling van verschillende reporter HBV is gemeld door vele groepen 11, 12, 13, maar de meeste van deze reporter HBV vertonen lage productiviteit. Bovendien is de reporter-activiteit in geïnfecteerde cellen niet zo hoog en moeilijk te gebruiken voor het screenen van anti-HBV middelen met een high-throughput assay. Daarentegen ons reporter HBV produceert een sterk signaal reporter in de geïnfecteerde cellen die maakt kunnen massale screening uitvoeren van anti-HBV middelen met een betrekkelijk kleine hoeveelheid van het virus in vergelijking met andere reporter virussen tot dusver gerapporteerd.

Hier, genereerden we een nieuw HBV reportersysteem de vroege stadia van toezichthet HBV replicatiecyclus en dit werd gevalideerd door het reportergen activiteit na infectie. De beschreven werkwijze is een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve HBV vectorsysteem en zal nuttig zijn voor de identificatie van HBV gastheerfactoren en anti-HBV verbindingen met high-throughput screening methoden. Sterker nog, we geïdentificeerd HBV gastheer factoren en anti-HBV genen door het hele genoom RNAi-technologie 15. Opmerkelijk is dit systeem niet geschikt voor de evaluatie van de late stadia van HBV replicatie als de DNA-replicatie stap capside en virus montage en ontluikende, omdat recombinant HBV deficiënt is voor de productie van een functionele kern en pol. De verdere ontwikkeling van recombinant HBV moet het gehele HBV levenscyclus evalueren.

Samenvattend, kan dit systeem worden gebruikt om HBV infectie geëvalueerd door het meten van reporter-activiteit. Daarom hoeft ingewikkelde assay technieken zoals PCR, RT-PCR voeren,HBV core of S-antigeen ELISA HBV-infectie / replicatie evalueren. Tenslotte omdat deze reporter HBV replicatie incompetent is er geen besmettingsgevaar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127, (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13, (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44, (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33, (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106, (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456, (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4, (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87, (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7, (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106, (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44, (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9, (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3, (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42, (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370, (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344, (6266), 552-555 (1990).
Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter