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Immunology and Infection

एक हेपेटाइटिस बी वायरस संवाददाता प्रणाली का विकास प्रतिकृति चक्र के प्रारंभिक दौर नजर रखने के लिए

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

यहाँ हम एचबीवी के जीवन चक्र के प्रारंभिक चरणों की निगरानी के लिए एक नव विकसित हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संवाददाता प्रणाली का वर्णन है। यह इन विट्रो प्रणाली में सरल विरोधी एचबीवी एजेंटों एक उच्च throughput रणनीति का उपयोग करने की स्क्रीनिंग में सहायता करेगा।

Introduction

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हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) के साथ पुराने संक्रमण जीर्ण जिगर की बीमारियों 1 के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है। हालांकि वर्तमान चिकित्सकीय रणनीति न्यूक्लियोटाइड analogs कि रोकना इंटरफेरॉन प्रेरित जीन कार्यों 2 के माध्यम से एचबीवी पोल समारोह और / या के प्रकार मैं इंटरफेरॉन कि संक्रमित व्यक्तियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय प्रशासन के साथ ही परोक्ष रूप से दबा एचबीवी प्रसार के आधार पर कर रहे हैं, इन उपचार एचबीवी खत्म नहीं कर सकते डीएनए पूरी तरह से 3। इसके अलावा, HBVs कि विरोधी नीति एजेंटों के लिए प्रतिरोधी रहे हैं के उद्भव चिंता 4 की है। संयुक्त विरोधी वायरल सीधे मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) या हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) के जीवन चक्र के विभिन्न चरणों को निशाना एजेंटों के प्रशासन सफलतापूर्वक को दबाने या वायरस (ते) उन्मूलन करने के लिए दिखाया गया था। इस विचार, विरोधी एचबीवी एजेंट (s) है कि एच के विभिन्न चरणों पर सीधे कार्रवाई के विकास के लिए भी इसी तरहबी.वी. जीवन चक्र भविष्य एचबीवी के उपचारों की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है।

सामान्य तौर पर, लक्ष्य वायरस के इन विट्रो संस्कृति प्रणाली में एक सरल की स्थापना के विरोधी वायरस एजेंटों के विकास की सुविधा। हालांकि, वहाँ इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों के विकास के विरोधी एचबीवी एजेंटों स्क्रीन करने के लिए कम से कम दो अवरोध कर रहे हैं। पहले एक सुविधाजनक इन विट्रो सेल संस्कृति एचबीवी संक्रमण / प्रसार के लिए इस प्रणाली का अभाव है। इस तरह के एचआईवी और एचसीवी के रूप में अन्य वायरस है, जो स्थापित सेल लाइनों में प्रचारित कर रहे हैं के विपरीत, यह क्योंकि एक संकीर्ण मेजबान रेंज सहित प्रयोगात्मक सीमाओं के इन विट्रो में एचबीवी खेती करने के लिए मुश्किल है। ऐसे मानव hepatoma सेल लाइन HepaRG, जो एचबीवी संक्रमण, 5, 6 की संभावना है के रूप में विशेष सेल संस्कृति सिस्टम के उपयोग, 7 इन समस्याओं को दूर करने के लिए विकसित किया गया है। इसके अलावा, PXB कोशिकाओं, urokinase-ty से अलग-थलगपीई plasminogen उत्प्रेरक ट्रांसजेनिक / SCID चूहों प्राथमिक मानव hepatocyte (PHH) के साथ टीका, एचबीवी संक्रमण और नकल से 8 अतिसंवेदनशील होना दिखाया गया था। हालांकि, HepaRG में एचबीवी प्रतिकृति स्तरों संस्कृति के बाद सेलुलर भेदभाव राज्य है, जो एचबीवी संक्रमण / प्रतिकृति के स्तर के असंगत और irreproducible परिणाम पैदा कर सकता है पर निर्भर हैं। PXB सामान्यतः एचबीवी संक्रमण प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है लेकिन इसकी उपलब्धता द्वारा सीमित है। एक टेट्रासाइक्लिन inducible एचबीवी अभिव्यक्ति सेल लाइन, HepAD38, भी व्यापक रूप से एचबीवी प्रतिकृति अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन इस प्रणाली केवल प्रतिलेखन के बाद और एचबीवी संक्रमण 9 के प्रवेश के कदम पर नहीं मूल्यांकन अनुमति देता है। हाल ही में, सोडियम taurocholate cotransporting पॉलीपेप्टाइड की पहचान (NTCP) एचबीवी के लिए एक कार्यात्मक रिसेप्टर के रूप में एक चर एचबीवी संस्कृति प्रणाली 10 के विकास की अनुमति दी है। दरअसल, इस तरह Huh7 के रूप में गैर अतिसंवेदनशील हिपेटोकार्सिनोमा कोशिकाओं में NTCP अभिव्यक्ति औरHepG2 एचबीवी संक्रमण 10 में सक्षम बनाता है और इस प्रकार, एचबीवी अतिसंवेदनशील सेल लाइनों की पसंद, विस्तारित किया गया है प्रयोगात्मक सीमाओं के कई हल करने। दूसरी समस्या यह एक सरल परख प्रणाली एचबीवी संक्रमण और नकल का मूल्यांकन करने की कमी है। एचबीवी संक्रमण का मूल्यांकन आम तौर पर विश्लेषण करने एचबीवी डीएनए, आरएनए और प्रोटीन द्वारा आयोजित किया जाता है। हालांकि, इन वायरस मार्कर की मात्रा का ठहराव समय लगता है, अक्सर महंगा है और हमेशा आसान नहीं है। इसलिए, एक सरल परख प्रणाली के विकास, इस तरह के एक पत्रकार जीन का उपयोग कर के रूप में, एचबीवी परख प्रणालियों के साथ जुड़े समस्याओं को दूर कर सकता है।

हालांकि, जीनोम का आकार है कि एक एचबीवी capsid में पैक किया जा सकता है, क्योंकि सीमित है - कम से कम 3.7 केबी 11 - एक पत्रकार जीन के आकार जितना संभव हो कम होना चाहिए। इसके अलावा, जो वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक हैं जीनोम भर में बिखरे हुए कई सीआईएस तत्वों की उपस्थिति, पदों में लिए उपलब्ध की सीमा जीनोम में रिपोर्टर जीन की sertion। कई रिपोर्टों एचबीवी जीनोम 11, 12, 13 में, एचआईवी -1 गूंथना, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और DsRed सहित विदेशी जीन, सम्मिलित करने का प्रयास किया है। हालांकि, इन पुनः संयोजक HBVs स्क्रीनिंग एचबीवी संक्रमण / प्रतिकृति, या एचबीवी संक्रमण / प्रतिकृति प्रभावित करने वाले कारकों के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए के लिए उपयोगी नहीं हैं। यह मुख्य रूप से पुनः संयोजक वायरस की कम उत्पादकता और पत्रकार जीन अभिव्यक्ति की कम तीव्रता अक्षम वायरस की वजह से उत्पादन की वजह से है।

इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए, हम वायरस के उत्पादन का एक उच्च उपज के साथ एक संवाददाता एचबीवी का निर्माण किया। यह वायरस, एचबीवी प्रतिकृति चक्र के प्रारंभिक चरणों की निगरानी के प्रवेश से प्रतिलेखन करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील है। क्योंकि यह एक छोटी सी (171 अमीनो एसिड) luminescent संवाददाता इंजीनियर इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, NanoLuc (NL) एक मार्कर जीन के रूप में चुना गया थावर्ग = "xref"> 14। इसके अलावा, नाथन लगभग जुगनू या Renilla luciferase की तुलना में उज्जवल 150 गुना है, और luminescent प्रतिक्रिया एटीपी स्वतंत्र है, सुझाव है कि झूठी हिट दर उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए कम हो जाएगा। पुनः संयोजक एचबीवी की उत्पादन क्षमता में माता-पिता एचबीवी के लगभग 1/5, और पिछले एचबीवी पुनः संयोजक वायरस के लिए सूचना के स्तर के लिए इसी तरह की है; हालांकि, नाथन की चमक वायरस उत्पादकता मुद्दों पर काबू तो यह विरोधी एचबीवी एजेंटों की बड़े पैमाने पर जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

विरोधी एचबीवी एजेंटों प्राथमिक hepatocytes का उपयोग करने की स्क्रीनिंग, HepaRG, HepAD38 और NTCP-transduced hepatocytes पारंपरिक विधि (ओं) द्वारा विरोधी एचबीवी एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकता है। हालांकि, इस प्रणाली यहाँ वर्णित ऐसे सरल हैंडलिंग, उच्च संवेदनशीलता, और स्क्रीनिंग के लिए कम लागत के रूप में विभिन्न फायदे हैं। ये लाभ उच्च throughput assays विकसित करने और उपचारात्मक उद्देश्यों के लिए नए एचबीवी एजेंटों की पहचान करने के लिए उपयुक्त हैं।

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Protocol

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1. संयोजक एचबीवी के उत्पादन रिपोर्टर प्रोटीन एन्कोडिंग

  1. HepG2 कोशिकाओं की तैयारी
    1. सेल संस्कृति के माध्यम से तैयार (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS के साथ पूरक), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 100 यू / एमएल अनावश्यक अमीनो एसिड)।
    2. प्लेट 4 x 10 6 संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर अभिकर्मक पहले दिन में एक 10 सेमी कोलेजन लेपित पकवान में HepG2 कोशिकाओं। एक humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर HepG2 कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: जब लगभग 4 x 10 6 HepG2 कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर में एक 10 सेमी कोलेजन लेपित पकवान में चढ़ाया जाता है, वे 70-90% मिला हुआ अगले दिन होगा।
  2. अभिकर्मक
    1. Transfect HepG2 pUC1.2HBV डेल्टा एप्सिलॉन 15 के 5 माइक्रोग्राम और pUC1.2HBV / नाथन 15 के 5 ग्राम के साथ कोशिकाओं का उपयोग कर एक अभिकर्मकनिर्माता के निर्देशों के अनुसार अभिकर्मक।
    2. अगले दिन, संस्कृति के माध्यम से हटाने और ताजा संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. एक सप्ताह के अभिकर्मक के बाद, एक 50 मिलीलीटर-ट्यूब के लिए संस्कृति पुनः संयोजक एचबीवी युक्त मध्यम हस्तांतरण और कदम 1.3.1 के लिए आगे बढ़ें। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से युक्त थाली करने के लिए ताजा संस्कृति के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: पुनः संयोजक एचबीवी का उत्पादन 4 सप्ताह के लिए बनाए रखा है। संस्कृति पुनः संयोजक एचबीवी युक्त मध्यम 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  3. पुनः संयोजक एचबीवी की शुद्धि
    1. संस्कृति centrifugation द्वारा पुनः संयोजक एचबीवी (5 मिनट के लिए 2300 XG) युक्त मध्यम से सेल मलबे को हटाने।
    2. एक 0.45 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला गुजरती हैं।
    3. संस्कृति के माध्यम से: 26% खूंटी / 1.5 एम NaCl (130 जी, सोडियम क्लोराइड, 49 ग्राम, 0.5 एम EDTA पीएच 8.0 से 1 मिलीलीटर और 1 एम HEPES पीएच के 5 मिलीलीटर 500 में 7.6 मिलीलीटर पॉलीथीन ग्लाइकोल 6000) की एक समान मात्रा में जोड़ें युक्त पुनः संयोजकएचबीवी और धीरे मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 2300 XG पर अपकेंद्रित्र।
    5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और TNE के 0.5 मिलीलीटर (10 मिमी Tris, 50 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA) में गोली भंग।
    6. 5 मिनट के लिए 2300 XG पर centrifugation द्वारा मलबे निकालें।
    7. TNE में 0.8 20 मिलीलीटर% sucrose पर लोड पुनः संयोजक एचबीवी युक्त TNE के 0.5 मिलीलीटर।
    8. 15 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए 100,000 × छ अपकेंद्रित्र।
    9. संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला के रूप में ज्यादा त्यागें, और गोली बचाने के लिए। संस्कृति के माध्यम से शुरू करने के 40 मिलीलीटर प्रति सीरम मुक्त DMEM के 1 मिलीलीटर में यह Resuspend।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    11. एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर। -80 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिलीलीटर aliquots और दुकान तैयार करें।
      नोट: मूल वायरस के नमूने की रिपोर्टर प्रोटीन संदूषण मनाया जाता है, 2 घंटे के लिए 100,000 XG पर TNE में 5-30% sucrose के घनत्व ढाल अल्ट्रा centrifugation द्वारा वायरस को शुद्ध, या CsCl घनत्व equilibrated centrifugation इधर-उधरएम 1.1-1.6 ग्राम / मिलीलीटर 50 घंटे के लिए 150,000 XG पर।

2. संयोजक एचबीवी के संक्रमण

  1. कि DMEM में एचबीवी संक्रमण 10% FBS, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 250 माइक्रोग्राम / एमएल जी 418 और 100 यू / एमएल के साथ पूरक करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं स्थिरतापूर्वक NTCP (HepG2 / NTCP) 15 व्यक्त संस्कृति HepG2 कोशिकाओं एक humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर अनावश्यक अमीनो एसिड।
  2. एक दिन संक्रमण से पहले, थाली लगभग 5 x 10 4 HepG2 / NTCP कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम से 0.1 मिलीलीटर में एक 96 अच्छी तरह से कोलेजन लेपित थाली में 14।
  3. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलना पुनः संयोजक एचबीवी तक वहां शीशी में शेष बर्फ का एक छोटा सा है।
  4. निम्नलिखित के संयोजन के द्वारा संक्रमण के लिए मध्यम तैयार: (पीबीएस), डाइमिथाइल sulfoxide के 2 μl (DMSO), 1x फॉस्फेट बफर खारा में 40% PEG8000 के 10 μl पुनः संयोजक एचबीवी के 10 μl और ताजा संस्कृति के माध्यम से 78 μlएक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से।
  5. 96 अच्छी तरह से थाली में से एक अच्छी तरह से करने के लिए पुनः संयोजक एचबीवी समाधान के 100 μl जोड़ें।
  6. संक्रमण के बाद एक दिन, संक्रमित कोशिकाओं को वायरस अंश से contaminating संवाददाता प्रोटीन को हटाने के लिए अच्छी तरह से प्रति 300 μl पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
  7. एक सप्ताह या उससे कम के लिए 2% DMSO युक्त संस्कृति के माध्यम से 200 μl में संक्रमित कोशिकाओं को सेते हैं।

3. विश्लेषण

  1. एक सप्ताह के संक्रमण के बाद, पीबीएस के साथ संक्रमित कोशिकाओं 3 बार धोएं।
  2. संक्रमित कोशिकाओं को lysis बफर के 50 μl जोड़ें।
  3. 5 मिनट के लिए संस्कृति की थाली रॉक, और फिर 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  4. luminometer थाली में संवाददाता सब्सट्रेट के 50 μl जोड़ें।
  5. संवाददाता सब्सट्रेट युक्त एक luminometer थाली करने के लिए सेल lysate के 20 μl जोड़ें। संक्षेप में vortexing द्वारा मिक्स।
  6. Luminometer में थाली प्लेस और पढ़ने 15 आरंभ करें।

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Representative Results

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चित्रा 1 एचबीवी जीनोम, लिखित RNAs, वायरस प्रोटीन और उनके कोडिंग क्षेत्र जीनोम पर की एक योजनाबद्ध दिखाता है। पत्रकार जीन और जीनोम में अपने स्थान भी संकेत कर रहे हैं। चित्रा 2 रिपोर्टर जीन से युक्त एचबीवी संवाददाता प्लाज्मिड और सहायक प्लाज्मिड पता चलता है। PUC1.2HBV / नाथन संवाददाता pUC1.2HBV 16 वर्ष की preCore mRNA की प्रतिलेखन दीक्षा साइट से न्यूक्लियोटाइड पदों 223-811 हटाने और फिर पत्रकार जीन डालने से निर्माण किया गया था। encapsidation संकेत अनुक्रम में बिंदु उत्परिवर्तन के साथ pUC1.2HBVdelta साइट निर्देशित mutagenesis पीसीआर द्वारा तैयार की गई थी। रिपोर्टर प्लाज्मिड (pUC1.2HBV / NL) और सहायक प्लाज्मिड (pUC1.2HBVdelta) हिन dIII और पारिस्थितिकी आरआई के साथ पचा, और फिर जेल वैद्युतकणसंचलन के अधीन थे। उम्मीद बैंड, जो पीयूसी प्लाज्मिड के लिए 3.0 केबी और 1.2HBV / नाथन या 1.2HBVdelta के लिए 3.5 केबी कर रहे हैं, छवि में दिखाया जाताUre 2 बी। चित्रा 3 HepG2 कोशिकाओं पुनः संयोजक एचबीवी से संक्रमित NTCP व्यक्त पता चलता है। HepG2 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक NTCP व्यक्त की स्थापना करने के लिए, HepG2 कोशिकाओं pCAN-NTCP-MYC एन्कोडिंग NTCP-MYC और एक neomycin प्रतिरोधी जीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। G418 प्रतिरोधी सेल क्लोन चयनित और विस्तार किया गया। HepG2-NTCP-MYC-clone22 एचबीवी संक्रमण की संभावना है। HepG2 या HepG2-NTCP-MYC-clone22 की lysates पश्चिमी सोख्ता के अधीन थे। NTCP एक बाह्य एन टर्मिनस दो एन से जुड़े ग्लाइकोसिलेशन साइटों (Asn5 और Asn11) युक्त के साथ, 349 अमीनो एसिड की एक ग्लाइकोप्रोटीन है। Unglycosylated NTCP के 43 केडीए बैंड और ग्लाइकोसिलेटेड 10 से 65 केडीए बैंड चित्रा 3 ए में दिखाया जाता है। NTCP व्यक्त HepG2-NTCP-MYC-clone22 कोशिकाओं, लेकिन नहीं HepG2 कोशिकाओं, पुनः संयोजक एचबीवी संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील थे। चित्रा 4 पुनः संयोजक एचबीवी से संक्रमित HepG2-NTCP-MYC-क्लोन में पत्रकार जीन के कैनेटीक्स (ए और बी), वायरस आरएनए और डीएनए (ए) के स्तर से पता चलता है22 (ए) या मानव प्राथमिक hepatocyte (PHH) कोशिकाओं (बी)। एचबीवी शाही सेना और रिपोर्टर गतिविधि के स्तर HepG2-NTCP-MYC-clone22 या PHH कोशिकाओं में संक्रमण के बाद 3 दिन में उठाया गया। इसके विपरीत, वहाँ संक्रमण के बाद 9 दिनों में डीएनए के स्तर में कोई परिवर्तन नहीं किया गया था क्योंकि पुनः संयोजक एचबीवी कार्यात्मक कोर और पोल intracellular डीएनए प्रतिकृति मार्ग में एक महत्वपूर्ण भूमिका है कि के लिए की कमी है। चित्रा 5 हेपेटाइटिस बी प्रतिरक्षा ग्लोब्युलिन (HBIG), हेपरिन और IFN-β द्वारा पुनः संयोजक एचबीवी के निषेध से पता चलता है। ऐसे HBIG और हेपरिन के रूप में प्रवेश अवरोधकों दृढ़ता, 75 यू / एमएल और 150 यू / एमएल क्रमश: कम से कम 10% से रिपोर्टर गतिविधि को दबा दिया, जबकि IFN-β 1,000 यू / एमएल में कम से कम 50% से रिपोर्टर गतिविधि को दबा दिया। इन अवरोधकों की निरोधात्मक प्रभाव खुराक निर्भर था। चित्रा 6 एचबीवी के जीवन चक्र चलता।

आकृति 1
फाई आंकड़ा 1: एचबीवी जीनोम और वायरस आरएनए और जीनोम पर प्रोटीन के रिश्तेदार स्थान के योजनाबद्ध। एचबीवी डीएनए काले रंग में एक चाप से दिखाया गया है। बढ़ाने और चाप पर वायरस RNAs के प्रतिलेखन के लिए प्रमोटरों के स्थान पीले रंग में दिखाया गया है। वायरल RNAs और जीनोम पर प्रोटीन के स्थान बिंदीदार ब्लू लाइन (आरएनए) के साथ और रंग का तीर (प्रोटीन), क्रमशः के साथ तीर से प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। वायरस RNAs आकार से भेदभाव कर रहे हैं: 3.5 और 3.4 केबी केबी mRNAs से संकेत मिलता है PreCore / सी और pregenomic आरएनए / कोर, क्रमश: 2.5 और 2.1 केबी RNAs preS1 और preS2 / एस, क्रमशः प्रतिनिधित्व करते हैं, और 0.8 केबी आरएनए जीन एक्स 17 को इंगित करता है। एक पत्रकार जीन कोर कोडिंग अनुक्रम के प्रासंगिक आकार के द्वारा प्रतिस्थापित है। पत्रकार जीन बढ़ाने द्वितीय युक्त एक कोर प्रमोटर द्वारा संचालित किया जाता है। प्रो: प्रमोटर, EnhI / समर्थक: बढ़ाने मैं / प्रमोटर, EnhII / प्रो: EnhancerII / प्रमोटर, पोल: पोलीमरेज़, एस: सतह प्रतिजन। लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: पुनः संयोजक एचबीवी की पीढ़ी के लिए योजनाबद्ध। (ए) ब्लू लाइनों pregenome आरएनए संकेत मिलता है। 'ए' खिंचाव 3'टर्मिनस पर पाली एक प्रतिनिधित्व करता है। नीले बक्से प्रत्येक वायरस प्रोटीन के लिए कोडिंग क्षेत्र से संकेत मिलता है। लाल बॉक्स एक पत्रकार जीन अपने स्वयं दीक्षा कोडोन से अनुवाद इंगित करता है। संवाददाता प्लाज्मिड PreCore और पोल, और सहायक encapsidation संकेत में 2 म्यूटेशन युक्त (CTATGTC को CTGTGCC) प्लाज्मिड उत्पादन नहीं कर सकते सब एचबीवी प्रोटीन व्यक्त करता है। ई: Encapsidation संकेत। (बी) के संवाददाता प्लाज्मिड, सहायक प्लाज्मिड और पीयूसी प्लाज्मिड पारिस्थितिकी आरआई और हिन dIII के साथ पचा रहे थे। ये पचा plasmids जेल वैद्युतकणसंचलन के अधीन थे।विज्ञापन / 54849 / 54849fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: संयोजक एचबीवी HepG2 NTCP व्यक्त संक्रमित। (ए) एक स्थिर सेल लाइन NTCP व्यक्त एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग Myc टैग NTCP साथ HepG2 कोशिकाओं के अभिकर्मक 500 माइक्रोग्राम / 3 सप्ताह के लिए G418 के मिलीलीटर के साथ चयन के बाद से स्थापित किया गया था। (: 1,000 कमजोर पड़ने 1) HepG2 कोशिकाओं में NTCP-Myc के स्तर पर स्थिरतापूर्वक NTCP (HepG2-NTCP-Myc-clone22) कोशिकाओं को व्यक्त विरोधी Myc एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया गया था। (बी) HepG2-NTCP-Myc-clone22 कोशिकाओं 2% DMSO और 4% PEG8000 की उपस्थिति में पुनः संयोजक एचबीवी से संक्रमित थे। संक्रमण के बाद 72 घंटा पर, संवाददाता गतिविधि के स्तर संवाददाता परख द्वारा निर्धारित किया गया था। परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं, और त्रुटि सलाखों वें दिखानेई का मतलब है की मानक विचलन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: पुनः संयोजक एचबीवी संक्रमण के समय पाठ्यक्रम। (ए) HepG2-NTCP-Myc-clone22 कोशिकाओं 2% DMSO और 4% PEG8000 की उपस्थिति में पुनः संयोजक एचबीवी से संक्रमित थे। एचबीवी संक्रमण का स्तर संक्रमण के बाद 3, 6 या 9 दिनों में रिपोर्टर गतिविधि (काला लाइन) द्वारा निर्धारित किया गया था। एचबीवी आरएनए (नीली रेखा) और डीएनए (नारंगी लाइन) के स्तर को एक साथ एक संक्रमण समय बिंदु पर, आरटी पीसीआर और पीसीआर 15 में क्रमश मापा गया। (बी) प्राथमिक मानव hepatocytes (PHH), urokinase प्रकार plasminogen उत्प्रेरक ट्रांसजेनिक / एस.सी.आई.डी PHH साथ टीका चूहों से अलग, presenc में पुनः संयोजक एचबीवी से संक्रमित थे2% DMSO और 4% PEG8000 के ई। एचबीवी संक्रमण का स्तर संक्रमण के बाद 3, 6, या 9 दिनों में संवाददाता गतिविधि के द्वारा निर्धारित किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: पुनः संयोजक एचबीवी संक्रमण पर ज्ञात विरोधी एचबीवी एजेंटों के प्रभाव। HepG2-NTCP-Myc -22 कोशिकाओं HBIG, खुराक संकेत दिया पर हेपरिन और IFN-β की उपस्थिति में पुनः संयोजक एचबीवी, साथ ही 2% DMSO और 4% PEG8000 से संक्रमित थे। एचबीवी प्रतिकृति (ए) और सेल व्यवहार्यता (बी) के स्तर पर 6 दिनों के संक्रमण के बाद संवाददाता गतिविधि के द्वारा निर्धारित किया गया था। HBIG एक एंटीबॉडी कि एचबीवी संक्रमण neutralizes और हेपरिन छा वायरस के लिए एक अवरोध करनेवाला है। परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों, और त्रुटि सलाखों के प्रतिनिधि हैं साधन के मानक विचलन दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: एचबीवी के जीवन चक्र के योजनाबद्ध। एचबीवी NTCP सहित वायरस रिसेप्टर्स के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश करती है। Capsid जुड़े आराम परिपत्र डीएनए (rcDNA) uncoated है और नाभिक में covalently बंद कर दिया परिपत्र डीएनए (cccDNA) को बदल दिया। mRNA प्रतिलेखन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में cccDNA कार्य करता है। जीनोमिक शाही सेना कोर और पोल के लिए प्रोटीन के साथ संयोजन के द्वारा वायरस कैप्सिड को encapsidated है। आगे HBS प्रोटीन के साथ संयोजन से पहले, कैप्सिड एक प्रक्रिया के द्वारा एचबीवी डीएनए amplifying में शामिल है cccDNA प्रतिकृति प्रक्रिया कहा जाता है। HBS प्रोटीन के साथ इकट्ठे वायरस कणों अंततः सेल के बाहर जारी कर रहे हैं।ओम / फ़ाइलें / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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एचबीवी जीनोम चार प्राथमिक खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs) कोर, पोलीमर्स, सतह और एक्स ORFs (चित्रा 1) भी शामिल है। इन चार एचबीवी ORFs का प्रतिलेखन कसकर चार प्रमोटरों द्वारा नियंत्रित किया जाता है: precore / कोर प्रमोटर बढ़ाने द्वितीय युक्त, एस 1 प्रमोटर, S2 प्रमोटर और प्रमोटर एक्स बढ़ाने मैं 18 से युक्त। 3.5 केबी और 3.4 केबी mRNAs, PreCore और कोर प्रोटीन में अनुवाद कर रहे हैं क्रमशः। बड़े आवृत प्रोटीन (एल) के सबसे बड़े subgenomic mRNA (2.5 केबी) से उत्पादन किया है, और मध्य (एम) और छोटे सतह प्रोटीन (एस) कम प्रतिलेख (2.1 केबी) से अनुवाद कर रहे हैं। 0.8 केबी प्रतिलिपि एक्स प्रोटीन 19, 20 के अनुवाद के लिए टेम्पलेट है। Pregenomic शाही सेना के 5'और 3'सिरों कई कार्यात्मक सीआईएस तत्वों है कि प्रत्यक्ष दोहराने 1 (DR1), DR2 और एक पैकेजिंग संकेत 21, 22 में शामिल होते हैं,। इन कार्यात्मक तत्वों pregenomic आरएनए में पत्रकार या मार्कर जीन की प्रविष्टि की सीमा। हम दो वैक्टर, एक हस्तांतरण पत्रकार जीन और एक सहायक वेक्टर युक्त वेक्टर के पार पूरक का उपयोग करके पुनः संयोजक एचबीवी का निर्माण किया। हस्तांतरण वेक्टर रिपोर्टर जीन (चित्रा 2) के साथ कोर और नीति क्षेत्रों के प्रतिस्थापन के द्वारा निर्माण किया गया था।

NTCP एचबीवी प्रविष्टि 10 के लिए एक सेलुलर रिसेप्टर के रूप में पहचान की थी। क्योंकि NTCP mRNA की अभिव्यक्ति HepG2 कोशिकाओं है, जो एचबीवी संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील नहीं कर रहे हैं में बहुत कम है, हम एक स्थिर HepG2 सेल लाइन NTCP-MYC (चित्रा 3 ए) व्यक्त की स्थापना की। जबकि HepG2 कोशिकाओं की पुनः संयोजक एचबीवी संक्रमण कोई रिपोर्टर गतिविधि दिखाया, HepG2 कोशिकाओं में NTCP अभिव्यक्ति पुनः संयोजक एचबीवी संक्रमण (चित्रा 3 बी) के लिए संवेदनशीलता सम्मानित किया गया। पुनः संयोजक एचबीवी संक्रमण के समय पाठ्यक्रम विश्लेषण प्रदर्शन किया है कि दोनों संवाददाता गतिविधि और एचबीवी आरएनए घ थेपुनः संयोजक एचबीवी संक्रमण के 3 दिन के भीतर etectable और 9 दिनों postinfection पर नुकीला; हालांकि, वृद्धि हुई एचबीवी डीएनए स्तर (चित्रा 4) नहीं मनाया गया। ऐसे HBIG या हेपरिन, हिचकते पुनः संयोजक एचबीवी संक्रमण (चित्रा 5) के रूप में प्रवेश निरोधक,। इस प्रणाली को संकेत दिया इन परिणामों के प्रतिलेखन के लिए वायरस प्रवेश से प्रारंभिक चरण एचबीवी प्रतिकृति, लेकिन नहीं डीएनए प्रतिकृति और चित्रा (6) संक्रमित कोशिकाओं से जारी वायरस के फिर से संक्रमण पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चूंकि संवाददाता प्रोटीन अक्सर पुनः संयोजक एचबीवी अंश contaminates, पीबीएस के साथ वायरस संक्रमित कोशिकाओं को धोने के लिए कम से कम तीन बार एक उच्च पृष्ठभूमि में हो सकता है। इसलिए, यह एचबीवी-असंवेदनशील HepG2 पुनः संयोजक वायरस के साथ इलाज से मध्यम में रिपोर्टर गतिविधि को मापने के द्वारा पृष्ठभूमि के स्तर की जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है। पृष्ठभूमि अधिक है, एक कपड़े धोने कदम (3 बार एक 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 300 μl पीबीएस के साथ धोने) दिवस BEF जोड़नेअयस्क 3.1 कदम।

तो पुनः संयोजक एचबीवी के उत्पादन कम है, एक नियंत्रण प्लाज्मिड ऐसे GFP या DsRed के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन, व्यक्त के साथ अभिकर्मक दक्षता की जाँच करें। सामान्य तौर पर, HepG2 कोशिकाओं के अभिकर्मक की दक्षता में 35% से अधिक होना चाहिए। अगर अभिकर्मक क्षमता कम है, उच्च अभिकर्मक क्षमता हासिल करने के लिए विशिष्ट अभिकर्मक शर्तों का अनुकूलन। अभिकर्मक दक्षता उच्च है, तो जाँच संक्रामक पुनः संयोजक एचबीवी यह प्रयोग कर प्राथमिक मानव hepatocytes को संक्रमित करने के द्वारा उत्पादित है या नहीं। प्राथमिक मानव hepatocytes को एचबीवी की संक्रामकता आमतौर पर hepatoma सेल लाइनों NTCP व्यक्त करने के लिए की तुलना में अधिक है। पुनः संयोजक एचबीवी के कुशल संक्रमण प्राथमिक मानव hepatocytes में हासिल की है, तो समस्या पुनः संयोजक एचबीवी नहीं है, लेकिन कोशिकाओं को संक्रमित होने की। स्थिर HepG2 क्लोन NTCP व्यक्त करने का एक नंबर की स्थापना और अत्यधिक संक्रामक सेल क्लोन का चयन करें। संक्रमण के समय में संस्कृति में कम सेल confluency गरीब मैं में हो सकता हैnfectivity। संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने से संक्रमण दक्षता में सुधार। एचबीवी संक्रमण के लिए, HepG2 कोशिकाओं के संक्रमण के समय में NTCP व्यक्त करने के लिए 80-95% confluency एक उच्च संक्रमण दर प्रदान करता है।

कई रिपोर्टर HBVs के विकास के कई समूहों के 11, 12, 13 से सूचित किया गया है, लेकिन इन रिपोर्टर HBVs के सबसे गरीब उत्पादकता दिखा। इसके अलावा, संक्रमित कोशिकाओं में रिपोर्टर गतिविधि के रूप में उच्च नहीं है, और एक उच्च throughput परख का उपयोग विरोधी एचबीवी एजेंटों स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए मुश्किल होगा। इसके विपरीत, हमारे संवाददाता एचबीवी सिस्टम संक्रमित कोशिकाओं में एक मजबूत संवाददाता संकेत यह विरोधी एचबीवी एजेंटों इस प्रकार अब तक सूचना अन्य रिपोर्टर वायरस की तुलना में वायरस की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि का उपयोग कर के लिए बड़े पैमाने स्क्रीनिंग का संचालन करने के लिए आसान बनाता है कि पैदा करता है।

यहाँ, हम के प्रारंभिक चरणों की निगरानी के लिए एक उपन्यास एचबीवी संवाददाता प्रणाली उत्पन्नएचबीवी प्रतिकृति चक्र और इस संक्रमण के बाद संवाददाता प्रोटीन गतिविधि को मापने के द्वारा मान्य किया गया था। वर्णित विधि एक सरल, तेजी से, और लागत प्रभावी एचबीवी वेक्टर प्रणाली है और उच्च throughput स्क्रीनिंग तरीकों का उपयोग करके एचबीवी मेजबान कारकों के रूप में अच्छी तरह से विरोधी एचबीवी यौगिकों की पहचान के लिए उपयोगी हो जाएगा। दरअसल, हम पूरे जीनोम आरएनएआई प्रौद्योगिकी 15 से एचबीवी मेजबान कारकों और विरोधी एचबीवी जीनों की पहचान की। ध्यान से, इस प्रणाली से न एचबीवी प्रतिकृति की देर चरणों के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त इस तरह के डीएनए प्रतिकृति कदम है, कैप्सिड, और वायरस विधानसभा, और नवोदित रूप में, क्योंकि पुनः संयोजक एचबीवी एक कार्यात्मक कोर और पोल के उत्पादन के लिए की कमी है। पुनः संयोजक एचबीवी के आगे विकास के पूरे एचबीवी के जीवन चक्र का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है।

सारांश में, इस प्रणाली के रिपोर्टर गतिविधि को मापने के द्वारा एचबीवी संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, ऐसे पीसीआर, आरटी पीसीआर के रूप में जटिल परख तकनीक का संचालन करने की कोई जरूरत नहीं है,एचबीवी कोर या एस प्रतिजन एलिसा एचबीवी संक्रमण / प्रतिकृति का मूल्यांकन करने के लिए। अंत में, क्योंकि इस संवाददाता एचबीवी प्रतिकृति अक्षम है, वहाँ संक्रमण का कोई खतरा नहीं है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

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References

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एक हेपेटाइटिस बी वायरस संवाददाता प्रणाली का विकास प्रतिकृति चक्र के प्रारंभिक दौर नजर रखने के लिए
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Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

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