यहाँ हम एचबीवी के जीवन चक्र के प्रारंभिक चरणों की निगरानी के लिए एक नव विकसित हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संवाददाता प्रणाली का वर्णन है। यह इन विट्रो प्रणाली में सरल विरोधी एचबीवी एजेंटों एक उच्च throughput रणनीति का उपयोग करने की स्क्रीनिंग में सहायता करेगा।
Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.
हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) के साथ पुराने संक्रमण जीर्ण जिगर की बीमारियों 1 के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है। हालांकि वर्तमान चिकित्सकीय रणनीति न्यूक्लियोटाइड analogs कि रोकना इंटरफेरॉन प्रेरित जीन कार्यों 2 के माध्यम से एचबीवी पोल समारोह और / या के प्रकार मैं इंटरफेरॉन कि संक्रमित व्यक्तियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को सक्रिय प्रशासन के साथ ही परोक्ष रूप से दबा एचबीवी प्रसार के आधार पर कर रहे हैं, इन उपचार एचबीवी खत्म नहीं कर सकते डीएनए पूरी तरह से 3। इसके अलावा, HBVs कि विरोधी नीति एजेंटों के लिए प्रतिरोधी रहे हैं के उद्भव चिंता 4 की है। संयुक्त विरोधी वायरल सीधे मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) या हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) के जीवन चक्र के विभिन्न चरणों को निशाना एजेंटों के प्रशासन सफलतापूर्वक को दबाने या वायरस (ते) उन्मूलन करने के लिए दिखाया गया था। इस विचार, विरोधी एचबीवी एजेंट (s) है कि एच के विभिन्न चरणों पर सीधे कार्रवाई के विकास के लिए भी इसी तरहबी.वी. जीवन चक्र भविष्य एचबीवी के उपचारों की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है।
सामान्य तौर पर, लक्ष्य वायरस के इन विट्रो संस्कृति प्रणाली में एक सरल की स्थापना के विरोधी वायरस एजेंटों के विकास की सुविधा। हालांकि, वहाँ इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों के विकास के विरोधी एचबीवी एजेंटों स्क्रीन करने के लिए कम से कम दो अवरोध कर रहे हैं। पहले एक सुविधाजनक इन विट्रो सेल संस्कृति एचबीवी संक्रमण / प्रसार के लिए इस प्रणाली का अभाव है। इस तरह के एचआईवी और एचसीवी के रूप में अन्य वायरस है, जो स्थापित सेल लाइनों में प्रचारित कर रहे हैं के विपरीत, यह क्योंकि एक संकीर्ण मेजबान रेंज सहित प्रयोगात्मक सीमाओं के इन विट्रो में एचबीवी खेती करने के लिए मुश्किल है। ऐसे मानव hepatoma सेल लाइन HepaRG, जो एचबीवी संक्रमण, 5, 6 की संभावना है के रूप में विशेष सेल संस्कृति सिस्टम के उपयोग, 7 इन समस्याओं को दूर करने के लिए विकसित किया गया है। इसके अलावा, PXB कोशिकाओं, urokinase-ty से अलग-थलगपीई plasminogen उत्प्रेरक ट्रांसजेनिक / SCID चूहों प्राथमिक मानव hepatocyte (PHH) के साथ टीका, एचबीवी संक्रमण और नकल से 8 अतिसंवेदनशील होना दिखाया गया था। हालांकि, HepaRG में एचबीवी प्रतिकृति स्तरों संस्कृति के बाद सेलुलर भेदभाव राज्य है, जो एचबीवी संक्रमण / प्रतिकृति के स्तर के असंगत और irreproducible परिणाम पैदा कर सकता है पर निर्भर हैं। PXB सामान्यतः एचबीवी संक्रमण प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है लेकिन इसकी उपलब्धता द्वारा सीमित है। एक टेट्रासाइक्लिन inducible एचबीवी अभिव्यक्ति सेल लाइन, HepAD38, भी व्यापक रूप से एचबीवी प्रतिकृति अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन इस प्रणाली केवल प्रतिलेखन के बाद और एचबीवी संक्रमण 9 के प्रवेश के कदम पर नहीं मूल्यांकन अनुमति देता है। हाल ही में, सोडियम taurocholate cotransporting पॉलीपेप्टाइड की पहचान (NTCP) एचबीवी के लिए एक कार्यात्मक रिसेप्टर के रूप में एक चर एचबीवी संस्कृति प्रणाली 10 के विकास की अनुमति दी है। दरअसल, इस तरह Huh7 के रूप में गैर अतिसंवेदनशील हिपेटोकार्सिनोमा कोशिकाओं में NTCP अभिव्यक्ति औरHepG2 एचबीवी संक्रमण 10 में सक्षम बनाता है और इस प्रकार, एचबीवी अतिसंवेदनशील सेल लाइनों की पसंद, विस्तारित किया गया है प्रयोगात्मक सीमाओं के कई हल करने। दूसरी समस्या यह एक सरल परख प्रणाली एचबीवी संक्रमण और नकल का मूल्यांकन करने की कमी है। एचबीवी संक्रमण का मूल्यांकन आम तौर पर विश्लेषण करने एचबीवी डीएनए, आरएनए और प्रोटीन द्वारा आयोजित किया जाता है। हालांकि, इन वायरस मार्कर की मात्रा का ठहराव समय लगता है, अक्सर महंगा है और हमेशा आसान नहीं है। इसलिए, एक सरल परख प्रणाली के विकास, इस तरह के एक पत्रकार जीन का उपयोग कर के रूप में, एचबीवी परख प्रणालियों के साथ जुड़े समस्याओं को दूर कर सकता है।
हालांकि, जीनोम का आकार है कि एक एचबीवी capsid में पैक किया जा सकता है, क्योंकि सीमित है – कम से कम 3.7 केबी 11 – एक पत्रकार जीन के आकार जितना संभव हो कम होना चाहिए। इसके अलावा, जो वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक हैं जीनोम भर में बिखरे हुए कई सीआईएस तत्वों की उपस्थिति, पदों में लिए उपलब्ध की सीमा जीनोम में रिपोर्टर जीन की sertion। कई रिपोर्टों एचबीवी जीनोम 11, 12, 13 में, एचआईवी -1 गूंथना, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, और DsRed सहित विदेशी जीन, सम्मिलित करने का प्रयास किया है। हालांकि, इन पुनः संयोजक HBVs स्क्रीनिंग एचबीवी संक्रमण / प्रतिकृति, या एचबीवी संक्रमण / प्रतिकृति प्रभावित करने वाले कारकों के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए के लिए उपयोगी नहीं हैं। यह मुख्य रूप से पुनः संयोजक वायरस की कम उत्पादकता और पत्रकार जीन अभिव्यक्ति की कम तीव्रता अक्षम वायरस की वजह से उत्पादन की वजह से है।
इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए, हम वायरस के उत्पादन का एक उच्च उपज के साथ एक संवाददाता एचबीवी का निर्माण किया। यह वायरस, एचबीवी प्रतिकृति चक्र के प्रारंभिक चरणों की निगरानी के प्रवेश से प्रतिलेखन करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील है। क्योंकि यह एक छोटी सी (171 अमीनो एसिड) luminescent संवाददाता इंजीनियर इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, NanoLuc (NL) एक मार्कर जीन के रूप में चुना गया थावर्ग = "xref"> 14। इसके अलावा, नाथन लगभग जुगनू या Renilla luciferase की तुलना में उज्जवल 150 गुना है, और luminescent प्रतिक्रिया एटीपी स्वतंत्र है, सुझाव है कि झूठी हिट दर उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए कम हो जाएगा। पुनः संयोजक एचबीवी की उत्पादन क्षमता में माता-पिता एचबीवी के लगभग 1/5, और पिछले एचबीवी पुनः संयोजक वायरस के लिए सूचना के स्तर के लिए इसी तरह की है; हालांकि, नाथन की चमक वायरस उत्पादकता मुद्दों पर काबू तो यह विरोधी एचबीवी एजेंटों की बड़े पैमाने पर जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
विरोधी एचबीवी एजेंटों प्राथमिक hepatocytes का उपयोग करने की स्क्रीनिंग, HepaRG, HepAD38 और NTCP-transduced hepatocytes पारंपरिक विधि (ओं) द्वारा विरोधी एचबीवी एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकता है। हालांकि, इस प्रणाली यहाँ वर्णित ऐसे सरल हैंडलिंग, उच्च संवेदनशीलता, और स्क्रीनिंग के लिए कम लागत के रूप में विभिन्न फायदे हैं। ये लाभ उच्च throughput assays विकसित करने और उपचारात्मक उद्देश्यों के लिए नए एचबीवी एजेंटों की पहचान करने के लिए उपयुक्त हैं।
एचबीवी जीनोम चार प्राथमिक खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs) कोर, पोलीमर्स, सतह और एक्स ORFs (चित्रा 1) भी शामिल है। इन चार एचबीवी ORFs का प्रतिलेखन कसकर चार प्रमोटरों द्वारा नियंत्रित किया जाता है: precore / कोर प्रमोटर बढ?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.
Nano-Glo Luciferase Assay Regent | Promega | N1110 | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai tesque | 09367-34 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
100 mm/collagen-coated dish | Iwaki | 4020-010 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
Polyethylene glycol (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
Polyethylene glycol (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | |
0.5 mol/l-EDTA Solution | Nacalai tesque | 06894-14 | |
Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | |
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter | Merck Millipore | SLHP033RS | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Collagen coated 96-well plate | Corning | NO3585 | |
Passive Lysis 5xBuffer | Promega | E1941 | |
GloMax 96 Microplate Luminometer | Promega | E6501 | |
Sucrose | Nacalai tesque | 30403-55 | |
Luminometer plate | Greiner bio-one | 655075 | |
HepG2-NTCP1-myc-clone22 | – | – | Reference 15 |
pUC1.2HBV delta epsilon | – | – | Reference 15 |
pUC1.2HBV/NL | – | – | Reference 15 |
50 ml tube | Violamo | 1-3500-02 | |
Anti-Myc antibody | Sigma-Aldrich | C3956 | |
HBIG | Japan Blood Products Organization | – | |
IFN-β | Mochida Pharmaceutical | 14987224005413 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 |