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Immunology and Infection

Desarrollo de un sistema reportero virus de la hepatitis B para supervisar las primeras etapas del ciclo de replicación

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

Aquí se describe un virus de la hepatitis B de nuevo desarrollo sistema indicador (HBV) para supervisar las primeras etapas del ciclo de vida de HBV. Esta simplificado sistema in vitro ayudará en la selección de agentes anti-HBV utilizando una estrategia de alto rendimiento.

Introduction

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La infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB) es un factor de riesgo importante para las enfermedades hepáticas crónicas 1. Aunque las estrategias terapéuticas actuales se basan en análogos de nucleótidos que inhiben la función HBV pol y / o la administración de interferón de tipo I que activa la respuesta inmune en individuos infectados, así como indirectamente la supresión de la proliferación de HBV a través de funciones de genes de interferón-estimulado 2, estos tratamientos no pueden eliminar HBV ADN completo 3. Por otra parte, la aparición de HBVs que son resistentes a los agentes anti-pol es motivo de preocupación 4. La administración de agentes anti-virales combinados dirigidos directamente los diferentes pasos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el ciclo de vida del virus de la hepatitis C (HCV) se demostró con éxito para suprimir o erradicar el virus (es). Similar a esta idea, el desarrollo de anti-HBV agente (s) que actúan directamente sobre las diferentes etapas de la HBV ciclo de vida es importante para el establecimiento de futuras terapias VHB.

En general, el establecimiento de una sencilla en el sistema de cultivo in vitro del virus objetivo facilita el desarrollo de agentes anti-virus. Sin embargo, hay al menos dos barreras para el desarrollo de sistemas de cultivo in vitro para detectar agentes anti-HBV. El primero es la falta de un sistema conveniente in vitro de células de cultivo para el VHB infección / proliferación. A diferencia de otros virus, como el VIH y el VHC, que se propagan en líneas celulares establecidas, es difícil de cultivar HBV in vitro debido a las limitaciones experimentales incluyendo un estrecho rango de huéspedes. El uso de sistemas de cultivo de células específicas, tales como la línea celular de hepatoma humano HepaRG, que es susceptible a la infección por HBV, 5, 6, 7 se han desarrollado para superar estos problemas. Por otra parte, las células PXB, aisladas de uroquinasa-type activador del plasminógeno transgénico / ratones SCID inoculados con hepatocitos humanos primarios (PHH), se demuestra que es susceptible a la infección por HBV y la replicación 8. Sin embargo, los niveles de replicación del VHB en HepaRG dependen del estado de diferenciación celular después del cultivo, lo que puede causar que los resultados inconsistentes e irreproducibles de los niveles de infección / replicación del VHB. PXB se utiliza comúnmente para experimentos de infección de HBV, pero está limitada por su disponibilidad. Una línea celular de expresión VHB inducible de tetraciclina, HepAD38, también ha sido ampliamente utilizado para estudiar la replicación del VHB, pero este sistema sólo permite la evaluación después de la transcripción y no en la etapa de entrada de la infección por HBV 9. Recientemente, la identificación de polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (PNCT) como un receptor funcional para HBV ha permitido el desarrollo de un sistema de cultivo de HBV variable de 10. De hecho, la expresión en células de hepatocarcinoma PNCT no susceptibles tales como Huh7 yHepG2 permite la infección por VHB 10 y por lo tanto, la elección de líneas de células susceptibles de HBV se ha ampliado, la resolución de muchas de las limitaciones experimentales. El segundo problema es la falta de un sistema de ensayo sencillo para evaluar la infección por VHB y la replicación. Evaluación de la infección por VHB se realiza normalmente mediante el análisis VHB ADN, ARN y proteínas. Sin embargo, la cuantificación de estos marcadores de virus es mucho tiempo, a menudo costoso y no siempre es sencillo. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de ensayo simple, como el uso de un gen indicador, podría superar los problemas asociados con sistemas de ensayo de HBV.

Sin embargo, debido a que el tamaño del genoma que puede ser empaquetado en una cápside de HBV se limita - menos de 3,7 kb 11 - el tamaño de un gen indicador debe ser tan corto como sea posible. Por otra parte, la presencia de múltiples elementos cis dispersos por todo el genoma, que son esenciales para la replicación viral, limita las posiciones disponibles en el la inserción del gen informador en el genoma. Varios informes han tratado de insertar genes extraños, incluyendo el VIH-1 Tat, proteína fluorescente verde, y DsRed, en el genoma de HBV 11, 12, 13. Sin embargo, estos HBVs recombinantes no son útiles para la detección de HBV infección / replicación, o para el cribado de alto rendimiento de los factores que afectan a la infección por VHB / replicación. Esto es principalmente debido a la baja productividad de virus recombinantes y la reducción de la intensidad de expresión del gen indicador causada por la producción de virus ineficiente.

Para superar estos problemas, se construyó un reportero de VHB con un alto rendimiento de la producción de virus. Este virus es altamente sensible para el seguimiento de las primeras etapas del ciclo de replicación de HBV, desde la entrada a la transcripción. Para lograr esto, NanoLuc (NL) fue elegido como un gen marcador, ya que es un pequeño (171 aminoácidos) diseñados reportero luminiscenteclass = "xref"> 14. Además, NL es aproximadamente 150 veces más brillante que la luciérnaga o luciferasa de Renilla, y la reacción luminiscente es independiente de ATP, lo que sugiere que la tasa de éxito falsa será baja para cribado de alto rendimiento. La eficiencia de la producción de la HBV recombinante es de aproximadamente 1/5 de los padres HBV, y similar a los niveles reportados para los virus recombinantes de HBV anteriores; sin embargo, el brillo de NL supera problemas de productividad virus para que pueda ser utilizado para el cribado en masa de agentes anti-HBV.

Cribado de agentes anti-HBV utilizando hepatocitos primarios, HepaRG, HepAD38 y hepatocitos PNCT-transducidas podría ser útil para el cribado de agentes anti-VHB por método (s) convencional. Sin embargo, el sistema descrito aquí tiene varias ventajas, tales como el manejo sencillo, alta sensibilidad y bajo costo para el cribado. Estas ventajas son adecuados para ensayos de alto rendimiento para desarrollar e identificar nuevos agentes de HBV con fines terapéuticos.

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Protocol

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1. La producción de recombinante de HBV que codifica la proteína Reportero

  1. Preparación de células HepG2
    1. Preparar medio de cultivo celular (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 100 aminoácidos no esenciales U / ml).
    2. La placa 4 x 10 6 células HepG2 en una placa de 10 cm revestido con colágeno en 10 ml de medio de cultivo el día antes de la transfección. Se incuban las células HepG2 a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO 2.
      NOTA: Al de aproximadamente 4 x 10 6 células HepG2 se sembraron en una placa de colágeno recubiertas de 10 cm en 10 ml de medio de cultivo, que será 70 a 90% de confluencia el día siguiente.
  2. La transfección
    1. Células HepG2 transfectar con 5 g de epsilon pUC1.2HBV delta 15 y 5 g de pUC1.2HBV / NL 15 utilizando una transfecciónreactivo según las instrucciones del fabricante.
    2. Al día siguiente, retire el medio de cultivo y añadir 10 ml de medio de cultivo fresco.
    3. Una semana después de la transfección, transferir el medio de cultivo que contiene el VHB recombinante a un tubo de 50 ml, y continúe con el paso 1.3.1. Añadir 10 ml de medio de cultivo fresco a la placa que contiene las células transfectadas.
      NOTA: La producción del VHB recombinante se mantuvo durante 4 semanas. El medio de cultivo que contiene HBV recombinante se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
  3. Purificación de VHB recombinante
    1. Eliminar los restos celulares del medio de cultivo que contiene HBV recombinante por centrifugación (2.300 xg durante 5 min).
    2. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micras membrana.
    3. Añadir un volumen igual de 26% de PEG / 1,5 M NaCl (polietilenglicol 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0 y 5 ml de 1 M HEPES pH 7,6 en 500 ml) al medio de cultivo que contiene recombinanteVHB y mezclar suavemente. Incubar toda la noche a 4 ° C.
    4. Centrifugar a 2300 xg durante 20 min a 4 ° C.
    5. Descartar el sobrenadante y disolver el precipitado en 0,5 ml de TNE (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM).
    6. Eliminar los restos por centrifugación a 2.300 xg durante 5 min.
    7. Cargar 0,5 ml de TNE que contiene HBV recombinante en 0,8 ml de 20% de sacarosa en TNE.
    8. Se centrifuga a 100.000 xg durante 3 horas a 15 ° C.
    9. Descartar tanto del sobrenadante como sea posible, y guardar el precipitado. Volver a suspender en 1 ml de DMEM libre de suero por 40 ml de medio de cultivo de partida.
    10. Incubar toda la noche a 4 ° C.
    11. Filtrar a través de un filtro de 0,45 micras. Preparar alícuotas de 0,5 ml y se almacena a -80 ° C.
      NOTA: Si se observa contaminación proteína indicadora de la muestra del virus original, purificar el virus mediante gradiente de densidad ultra centrifugación de 5-30% de sacarosa en TNE a 100.000 xg durante 2 horas, o CsCl de densidad equilibrada centrifugación lado a otrom 1,1-1,6 g / ml a 150.000 xg durante 50 h.

2. La infección del VHB recombinante

  1. Células HepG2 Cultura de forma estable que expresan PNCT (HepG2 / PNCT) 15 que son susceptibles a la infección por VHB en DMEM suplementado con 10% FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 250 g / ml de G-418 y 100 U / ml aminoácidos no esenciales a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO 2.
  2. Un día antes de la infección, la placa aproximadamente 5 x 10 4 HepG2 / células Ntcp 14 en una placa recubierta de colágeno de 96 pocillos en 0,1 ml de medio de cultivo.
  3. VHB recombinante deshielo en un baño de agua a 37 ° hasta que haya un poco de hielo que queda en el vial.
  4. Preparar el medio para la infección mediante la combinación de los siguientes: 10 l de 40% PEG8000 en fosfato 1x solución salina tamponada (PBS), 2 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO), 10 l de VHB recombinante y 78 l de medio de cultivo frescopor pocillo de una placa de 96 pocillos.
  5. Añadir 100 l de solución de VHB recombinante a un pocillo de la placa de 96 pocillos.
  6. Un día después de la infección, se lavan las células infectadas 3 veces con 300 l de PBS por pocillo para retirar la proteína indicadora contaminante de la fracción de virus.
  7. Se incuban las células infectadas en 200 l de medio de cultivo que contiene 2% de DMSO durante una semana o menos.

3. Análisis

  1. Una semana después de la infección, se lavan las células infectadas 3 veces con PBS.
  2. Añadir 50 l de tampón de lisis a las células infectadas.
  3. Roca la placa de cultivo durante 5 minutos, y luego centrifugar a 2000 xg durante 5 min.
  4. Añadir 50 l de sustrato reportero en la placa de luminómetro.
  5. Añadir 20 l de lisado celular a una placa de luminómetro que contiene el sustrato indicador. Mezclar mediante agitación brevemente.
  6. Colocar la placa en el luminómetro e iniciar la lectura de 15.

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Representative Results

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La Figura 1 muestra un esquema del genoma HBV, los ARN transcritos, proteínas del virus y su región codificante en el genoma. El gen informador y su ubicación en el genoma también se indican. Figura 2 muestra el plásmido reportero y ayudante plásmido HBV que contiene el gen reportero. El reportero pUC1.2HBV / NL se construyó mediante la supresión de las posiciones de nucleótidos 223 a 811 desde el sitio de iniciación de la transcripción del ARNm de preCore pUC1.2HBV 16 y luego insertando el gen reportero. El pUC1.2HBVdelta con mutaciones puntuales en la secuencia de señal de encapsidación se generó por mutagénesis dirigida PCR. Plásmido reportero (pUC1.2HBV / NL) y el plásmido helper (pUC1.2HBVdelta) se digirieron con Hin dIII y Eco RI, y después se sometieron a electroforesis en gel. Las bandas esperadas, que son 3,0 kb para el plásmido pUC y 3,5 kb para 1.2HBV / NL o 1.2HBVdelta, se muestran en la figura2B Ure. La Figura 3 muestra las células HepG2 expresan PNCT infectados con VHB recombinante. Para establecer las células HepG2 que expresan establemente PNCT, las células HepG2 fueron transfectadas con codificación PCAN-PNCT-myc PNCT-myc y un gen resistente a la neomicina. Se seleccionaron y se expandieron los clones de células resistentes a G418. El HepG2-PNCT-myc-clone22 es susceptible a la infección por HBV. Los lisados ​​de HepG2 o HepG2-PNCT-myc-clone22 se sometieron a transferencia de Western. PNCT es una glicoproteína de 349 aminoácidos, con un N-terminal extracelular que contiene dos sitios de glicosilación unidos a N (Asn5 y Asn11). La banda de 43 kDa de no glicosilada PNCT y la banda de 65 kDa de glicosilada 10 se muestran en la Figura 3A. células HepG2-PNCT-myc-clone22 expresan PNCT, pero no las células HepG2, fueron susceptibles a la infección por el VHB recombinante. La Figura 4 muestra la cinética de gen indicador (A y B), el ARN del virus y el ADN (A) los niveles de HBV infectados HepG2-PNCT-myc-clon recombinante22 (A) o células humanas de hepatocitos primarios (PHH) (B). Los niveles de ARN de HBV y la actividad del indicador fueron elevados a los 3 días después de la infección en las células HepG2 PHH-PNCT-myc-clone22 o. En contraste, no hubo cambios en los niveles de ADN a los 9 días después de la infección porque VHB recombinante es deficiente para el núcleo funcional y pol que tienen un papel importante en la vía de la replicación del ADN intracelular. La Figura 5 muestra la inhibición de VHB recombinante por hepatitis B inmunoglobulina (HBIG), heparina y IFN-β. Los inhibidores de entrada tales como HBIG y heparina suprimen fuertemente la actividad de reportero en menos de un 10% a 75 U / ml y 150 U / ml, respectivamente, mientras que IFN-β suprime la actividad de reportero en menos de un 50% a 1,000 U / ml. El efecto inhibidor de estos inhibidores era dependiente de la dosis. Figura 6 muestra el ciclo de vida de HBV.

Figura 1
Fi figura 1: Representación esquemática del genoma del HBV y la ubicación relativa de ARN del virus y las proteínas en el genoma. ADN HBV se muestra por un arco en negro. La ubicación del potenciador y promotores para la transcripción de ARNs de virus en el arco se muestra en amarillo. La ubicación de los ARN virales y proteínas en el genoma están representados por las flechas con líneas de puntos azules (ARN) y con flechas de colores (proteínas), respectivamente. ARN de virus son discriminadas por tamaño: 3,5 kb y 3,4 kb mRNAs indican precore / C y ARN pregenómico / Core, respectivamente, 2,5 y 2,1 kb ARN representan preS1 y preS2 / S, respectivamente, y el ARN de 0,8 kb indica X gen 17. Un gen informador es sustituido por el tamaño correspondiente de secuencia central de codificación. El gen reportero es impulsado por un promotor de núcleo que contiene potenciador II. Pro: Promotor, EnhI / pro: Potenciador de E / promotor, EnhII / Pro: EnhancerII / promotor, Pol: Polimerasa, S: Antígeno de superficie. target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Representación esquemática para la generación de VHB recombinante. (A) Las líneas azules indican el ARN pregenome. La "A" representa tramo poli A en el extremo 3 '. cajas azules indican la región de codificación para cada proteína virus. El cuadro rojo indica un gen indicador traducido de su propio codón de iniciación. El plásmido reportero no puede producir precentral y Pol, y el plásmido ayudante que contiene 2 mutaciones en la señal de encapsidación (CTGTGCC a CTATGTC) expresa todas las proteínas de HBV. E: señal de encapsidación. (B) El plásmido reportero, el plásmido ayudante y el plásmido pUC se digirieron con Eco RI y Hin dIII. Estos plásmidos digeridos se sometieron a electroforesis en gel.ad / 54849 / 54849fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: VHB recombinante infecta HepG2 expresan PNCT. (A) Una línea celular estable que expresa PNCT fue establecido por la transfección de células HepG2 con un plásmido que codifica etiquetado-Myc PNCT seguido de la selección con 500 g / ml de G418 durante 3 semanas. El nivel de PNCT-Myc en células HepG2 expresan de forma estable células PNCT (HepG2-PNCT-Myc-clone22) se determinó por transferencia de Western usando anticuerpos anti-Myc (dilución 1: 1000). (B) células HepG2-PNCT-Myc-clone22 fueron infectados con VHB recombinante en presencia de 2% de DMSO y 4% PEG8000. En 72 horas después de la infección, el nivel de actividad del indicador se determinó mediante ensayo de indicador. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes, y las barras de error muestran THe desviaciones estándar de las medias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Evolución temporal de la infección por VHB recombinante. Células HepG2-PNCT-Myc-clone22 (A) se infectaron con el VHB recombinante en presencia de 2% de DMSO y 4% PEG8000. El nivel de infección por el VHB se determinó mediante la actividad de reportero (línea de color negro) a los 3, 6 ó 9 días después de la infección. Los niveles de ARN de HBV (línea azul) y ADN (línea naranja) se midieron simultáneamente por RT-PCR y PCR 15, respectivamente, en cada momento de la infección. (B) los hepatocitos humanos primarios (PHH), aislada del activador del plasminógeno transgénicos ratones de tipo uroquinasa / SCID inoculados con PHH, fueron infectados con VHB recombinante en el presence de 2% de DMSO y 4% PEG8000. El nivel de infección por VHB se determinó por la actividad de reportero a los 3, 6, o 9 días después de la infección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Efecto de los agentes anti-VHB conocidos en la infección por VHB recombinante. HepG2-PNCT-Myc-22 células fueron infectadas con VHB recombinante en presencia de HBIG, la heparina y IFN-β a las dosis indicadas, así como 2% de DMSO y 4% PEG8000. El nivel de replicación del VHB (A) y la viabilidad celular (B) se determinó por la actividad del indicador 6 días después de la infección. HBIG es un anticuerpo que neutraliza la infección por VHB y la heparina es un inhibidor para los virus envueltos. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes y las barras de error mostrar las desviaciones estándar de las medias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6: Representación esquemática del ciclo de vida de HBV. HBV entra en las células a través de receptores de virus incluyendo PNCT. Cápside asociada ADN circular relajado (rcDNA) es no recubierto y se convierte en ADN circular cerrado covalentemente (cccDNA) en el núcleo. funciones ADNccc como una plantilla para la transcripción de ARNm. El ARN genómico es encapsidado a la cápside del virus mediante el ensamblaje de las proteínas de núcleo y pol. Antes de volver a montar con proteínas HBS, la cápside está implicada en la amplificación de ADN del VHB por un proceso llamado el proceso de replicación cccDNA. Las partículas de virus combinadas con proteínas HBS finalmente son liberados fuera de la célula.om / archivos / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El genoma HBV tiene cuatro marcos principales de lectura abiertos (ORFs), incluyendo el núcleo, la polimerasa, de superficie y X ORFs (Figura 1). La transcripción de estos cuatro VHB ORFs está estrechamente regulada por cuatro promotores: el promotor precore / núcleo que contiene potenciador II, promotor S1, S2 promotor y X promotor que contiene promotor de I 18. Los ARNm de 3,5 kb y 3,4 kb se traducen en proteínas pre-core y Core, respectivamente. La proteína de la envoltura grande (L) se produce a partir del ARNm subgenómico más grande (2,5 kb) y el medio (M) y proteínas de superficie pequeña (S) se traduce de la transcripción más corto (2,1 kb). La transcripción 0,8 kb es la plantilla para la traducción de la proteína X 19, 20. Los extremos 5 'y 3' del ARN pregenómico contienen múltiples elementos cis funcionales que incluyen repetición directa 1 (DR1), DR2 y una señal de empaquetamiento 21, 22. Estos elementos funcionales limitan la inserción de actas o de los genes marcadores en el ARN pregenómico. Hemos construido VHB recombinante mediante el uso de trans-complementación de dos vectores, un vector de transferencia que contiene el gen reportero y un vector auxiliar. El vector de transferencia se construyó mediante la sustitución de las regiones del núcleo y pol con el gen indicador (Figura 2).

PNCT fue identificado como un receptor celular para la entrada de HBV 10. Debido a que la expresión de mRNA PNCT es muy baja en las células HepG2, que no son susceptibles a la infección por VHB, se estableció una línea celular estable que expresa HepG2 PNCT-myc (Figura 3A). Mientras que la infección por VHB recombinante de células HepG2 no mostró actividad de reportero, la expresión en las células HepG2 PNCT confiere susceptibilidad a la infección por el VHB recombinante (Figura 3B). El análisis del curso de tiempo de la infección por VHB recombinante demostró que tanto la actividad de reportero y el ARN de HBV se detectable plazo de 3 días de la infección por VHB recombinante y alcanzó su punto máximo a las 9 días después de la infección; Sin embargo, el aumento de los niveles de ADN HBV no se observaron (Figura 4). Los inhibidores de entrada, tales como IGHB o heparina, la infección por VHB recombinante inhibido (Figura 5). Estos resultados indican que este sistema puede utilizarse para monitorizar la replicación temprana etapa HBV de la entrada del virus de la transcripción, pero no la replicación del ADN y la re-infección de virus liberado de las células infectadas (Figura 6).

Dado que la proteína reportera menudo contamina la fracción VHB recombinante, lavado de las células infectadas por virus con PBS menos de tres veces pueden resultar en un alto fondo. Por lo tanto, es importante comprobar el nivel de fondo mediante la medición de la actividad del indicador en un medio de HepG2 HBV-susceptible tratados con el virus recombinante. Si el fondo es alto, añadir una etapa de lavado (3 veces el lavado con 300 l de PBS por pocillo en una placa de 96 pocillos) la bef díamineral de paso 3.1.

Si la producción de la HBV recombinante es bajo, comprobar la eficiencia de la transfección con un plásmido de control que expresa una proteína fluorescente, tal como GFP o DsRed. En general, la eficiencia de la transfección de células HepG2 debe ser mayor que 35%. Si la eficacia de transfección es baja, optimizar las condiciones de transfección específicas para lograr altas eficiencias de transfección. Si la eficacia de transfección es alta, comprobar si el VHB recombinante infecciosa se produce por utilizarlo para infectar hepatocitos humanos primarios. Infectividad del VHB a los hepatocitos humanos primarios suele ser mayor que para las líneas celulares de hepatoma que expresan PNCT. Si la infección eficiente de VHB recombinante se logró en hepatocitos humanos primarios, el problema no es el VHB recombinante pero las células infectadas. Establecer un número de clones estables que expresan HepG2 PNCT y seleccionar clones de células altamente infecciosas. confluencia de células en cultivo de baja en el momento de la infección puede causar un mal infectivity. Aumentar el número de células en el cultivo mejora la eficiencia de la infección. Para la infección por VHB, 80-95% de confluencia para las células HepG2 que expresan PNCT en el momento de la infección proporciona una alta tasa de infección.

El desarrollo de varios HBVs reportero ha sido reportado por muchos grupos de 11, 12, 13, pero la mayoría de estos HBVs reportero mostrar una baja productividad. Por otra parte, la actividad del indicador en las células infectadas no es tan alta, y sería difícil de utilizar para el cribado de agentes anti-HBV utilizando un ensayo de alto rendimiento. En contraste, nuestro sistema reportero HBV produce una señal fuerte reportero en las células infectadas que hace que sea fácil de llevar a cabo la detección de masas para los agentes anti-HBV utilizando una cantidad relativamente pequeña del virus en comparación con otros virus reportero notificados hasta la fecha.

Aquí, hemos generado un novedoso sistema reportero HBV para supervisar las primeras etapas deel ciclo de replicación del VHB y esto se validaron mediante la medición de la actividad de la proteína reportera después de la infección. El método descrito es un sistema de HBV vector simple, rápida y rentable y será útil para la identificación de VHB factores del huésped, así como compuestos anti-VHB mediante el uso de métodos de cribado de alto rendimiento. De hecho, hemos identificado VHB factores del huésped y genes anti-VHB por todo el genoma de la tecnología del RNAi 15. Es de destacar que este sistema no es adecuado para la evaluación de las últimas etapas de la replicación del VHB, tales como el paso replicación del ADN, la cápside, y el ensamblaje del virus, y en ciernes, porque VHB recombinante es deficiente para la producción de un núcleo funcional y pol. El mayor desarrollo de VHB recombinante se requiere para evaluar el ciclo de vida del VHB.

En resumen, este sistema se puede utilizar para evaluar la infección por VHB mediante la medición de la actividad del indicador. Por lo tanto, no hay necesidad de llevar a cabo técnicas de ensayo complicados tales como PCR, RT-PCR,HBV Core o S antígeno ELISA para evaluar la infección por VHB / replicación. Finalmente, debido a esta HBV reportero es incompetente de replicación, no hay riesgo de infección.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127, (5), Supple 1 35-50 (2004).
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Desarrollo de un sistema reportero virus de la hepatitis B para supervisar las primeras etapas del ciclo de replicación
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Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

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