Summary

Desarrollo de un sistema reportero virus de la hepatitis B para supervisar las primeras etapas del ciclo de replicación

Published: February 01, 2017
doi:

Summary

Aquí se describe un virus de la hepatitis B de nuevo desarrollo sistema indicador (HBV) para supervisar las primeras etapas del ciclo de vida de HBV. Esta simplificado sistema in vitro ayudará en la selección de agentes anti-HBV utilizando una estrategia de alto rendimiento.

Abstract

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Introduction

La infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB) es un factor de riesgo importante para las enfermedades hepáticas crónicas 1. Aunque las estrategias terapéuticas actuales se basan en análogos de nucleótidos que inhiben la función HBV pol y / o la administración de interferón de tipo I que activa la respuesta inmune en individuos infectados, así como indirectamente la supresión de la proliferación de HBV a través de funciones de genes de interferón-estimulado 2, estos tratamientos no pueden eliminar HBV ADN completo 3. Por otra parte, la aparición de HBVs que son resistentes a los agentes anti-pol es motivo de preocupación 4. La administración de agentes anti-virales combinados dirigidos directamente los diferentes pasos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el ciclo de vida del virus de la hepatitis C (HCV) se demostró con éxito para suprimir o erradicar el virus (es). Similar a esta idea, el desarrollo de anti-HBV agente (s) que actúan directamente sobre las diferentes etapas de la HBV ciclo de vida es importante para el establecimiento de futuras terapias VHB.

En general, el establecimiento de una sencilla en el sistema de cultivo in vitro del virus objetivo facilita el desarrollo de agentes anti-virus. Sin embargo, hay al menos dos barreras para el desarrollo de sistemas de cultivo in vitro para detectar agentes anti-HBV. El primero es la falta de un sistema conveniente in vitro de células de cultivo para el VHB infección / proliferación. A diferencia de otros virus, como el VIH y el VHC, que se propagan en líneas celulares establecidas, es difícil de cultivar HBV in vitro debido a las limitaciones experimentales incluyendo un estrecho rango de huéspedes. El uso de sistemas de cultivo de células específicas, tales como la línea celular de hepatoma humano HepaRG, que es susceptible a la infección por HBV, 5, 6, 7 se han desarrollado para superar estos problemas. Por otra parte, las células PXB, aisladas de uroquinasa-type activador del plasminógeno transgénico / ratones SCID inoculados con hepatocitos humanos primarios (PHH), se demuestra que es susceptible a la infección por HBV y la replicación 8. Sin embargo, los niveles de replicación del VHB en HepaRG dependen del estado de diferenciación celular después del cultivo, lo que puede causar que los resultados inconsistentes e irreproducibles de los niveles de infección / replicación del VHB. PXB se utiliza comúnmente para experimentos de infección de HBV, pero está limitada por su disponibilidad. Una línea celular de expresión VHB inducible de tetraciclina, HepAD38, también ha sido ampliamente utilizado para estudiar la replicación del VHB, pero este sistema sólo permite la evaluación después de la transcripción y no en la etapa de entrada de la infección por HBV 9. Recientemente, la identificación de polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (PNCT) como un receptor funcional para HBV ha permitido el desarrollo de un sistema de cultivo de HBV variable de 10. De hecho, la expresión en células de hepatocarcinoma PNCT no susceptibles tales como Huh7 yHepG2 permite la infección por VHB 10 y por lo tanto, la elección de líneas de células susceptibles de HBV se ha ampliado, la resolución de muchas de las limitaciones experimentales. El segundo problema es la falta de un sistema de ensayo sencillo para evaluar la infección por VHB y la replicación. Evaluación de la infección por VHB se realiza normalmente mediante el análisis VHB ADN, ARN y proteínas. Sin embargo, la cuantificación de estos marcadores de virus es mucho tiempo, a menudo costoso y no siempre es sencillo. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de ensayo simple, como el uso de un gen indicador, podría superar los problemas asociados con sistemas de ensayo de HBV.

Sin embargo, debido a que el tamaño del genoma que puede ser empaquetado en una cápside de HBV se limita – menos de 3,7 kb 11 – el tamaño de un gen indicador debe ser tan corto como sea posible. Por otra parte, la presencia de múltiples elementos cis dispersos por todo el genoma, que son esenciales para la replicación viral, limita las posiciones disponibles en el la inserción del gen informador en el genoma. Varios informes han tratado de insertar genes extraños, incluyendo el VIH-1 Tat, proteína fluorescente verde, y DsRed, en el genoma de HBV 11, 12, 13. Sin embargo, estos HBVs recombinantes no son útiles para la detección de HBV infección / replicación, o para el cribado de alto rendimiento de los factores que afectan a la infección por VHB / replicación. Esto es principalmente debido a la baja productividad de virus recombinantes y la reducción de la intensidad de expresión del gen indicador causada por la producción de virus ineficiente.

Para superar estos problemas, se construyó un reportero de VHB con un alto rendimiento de la producción de virus. Este virus es altamente sensible para el seguimiento de las primeras etapas del ciclo de replicación de HBV, desde la entrada a la transcripción. Para lograr esto, NanoLuc (NL) fue elegido como un gen marcador, ya que es un pequeño (171 aminoácidos) diseñados reportero luminiscenteclass = "xref"> 14. Además, NL es aproximadamente 150 veces más brillante que la luciérnaga o luciferasa de Renilla, y la reacción luminiscente es independiente de ATP, lo que sugiere que la tasa de éxito falsa será baja para cribado de alto rendimiento. La eficiencia de la producción de la HBV recombinante es de aproximadamente 1/5 de los padres HBV, y similar a los niveles reportados para los virus recombinantes de HBV anteriores; sin embargo, el brillo de NL supera problemas de productividad virus para que pueda ser utilizado para el cribado en masa de agentes anti-HBV.

Cribado de agentes anti-HBV utilizando hepatocitos primarios, HepaRG, HepAD38 y hepatocitos PNCT-transducidas podría ser útil para el cribado de agentes anti-VHB por método (s) convencional. Sin embargo, el sistema descrito aquí tiene varias ventajas, tales como el manejo sencillo, alta sensibilidad y bajo costo para el cribado. Estas ventajas son adecuados para ensayos de alto rendimiento para desarrollar e identificar nuevos agentes de HBV con fines terapéuticos.

Protocol

1. La producción de recombinante de HBV que codifica la proteína Reportero Preparación de células HepG2 Preparar medio de cultivo celular (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 100 aminoácidos no esenciales U / ml). La placa 4 x 10 6 células HepG2 en una placa de 10 cm revestido con colágeno en 10 ml de medio de cultivo el día antes de la tr…

Representative Results

La Figura 1 muestra un esquema del genoma HBV, los ARN transcritos, proteínas del virus y su región codificante en el genoma. El gen informador y su ubicación en el genoma también se indican. Figura 2 muestra el plásmido reportero y ayudante plásmido HBV que contiene el gen reportero. El reportero pUC1.2HBV / NL se construyó mediante la supresión de las posiciones de nucleótidos 223 a 811 desde el sitio de iniciación de la transcripción del AR…

Discussion

El genoma HBV tiene cuatro marcos principales de lectura abiertos (ORFs), incluyendo el núcleo, la polimerasa, de superficie y X ORFs (Figura 1). La transcripción de estos cuatro VHB ORFs está estrechamente regulada por cuatro promotores: el promotor precore / núcleo que contiene potenciador II, promotor S1, S2 promotor y X promotor que contiene promotor de I 18. Los ARNm de 3,5 kb y 3,4 kb se traducen en proteínas pre-core y Core, respectivamente. La proteína de la envoltu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.

Materials

Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/l-EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14 
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5xBuffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon Reference 15
pUC1.2HBV/NL Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W., Knipe, D., Howley, P. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. , 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).

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Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

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