Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utveckling av en hepatit B-virus Reporter system för att övervaka de tidiga stadierna av replikationscykeln

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

Här beskriver vi en nyutvecklad hepatit B-virus (HBV) reportersystem för att övervaka de tidiga stadierna av HBV-livscykeln. Denna förenklade in vitro-system kommer att hjälpa till vid screening av anti-HBV-medel med användning av en hög genomströmning strategin.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kronisk infektion med hepatit B-virus (HBV) är en stor riskfaktor för kroniska leversjukdomar 1. Även om nuvarande terapeutiska strategier är baserade på nukleotidanaloger som hämmar HBV pol funktion och / eller administrering av typ I interferon som aktiverar immunsvar i infekterade individer samt indirekt undertrycka HBV spridning genom interferon-stimulerade genfunktioner 2, kan dessa behandlingar inte eliminera HBV DNA helt 3. Dessutom är uppkomsten av HBVs som är resistenta mot anti-pol medel till oro 4. Administrationen av kombinerade antivirala medel direkt inriktade på olika stegen i humant immunbristvirus (HIV) eller hepatit C-virus (HCV) livscykel visades framgångsrikt undertrycka eller utrota viruset (er). Liknar denna idé, utveckling av anti-HBV-agens (er) som verkar direkt på de olika stegen i HBV livscykel är viktigt för att etablera framtida HBV terapier.

I allmänhet, inrättandet av en enkel in vitro-kultursystem av målet viruset underlättar utvecklingen av antivirusmedel. Men det finns åtminstone två hinder för utvecklingen av kultur in vitro-system för att screena anti-HBV-medel. Den första är bristen på en praktisk in vitro cellkultursystem för HBV-infektion / proliferation. Till skillnad från andra virus, såsom HIV och HCV, som fortplantas i etablerade cellinjer, är det svårt att odla HBV in vitro på grund av experimentella begränsningar inklusive ett smalt värdområde. Användning av specifika cellkultursystem, såsom den humana hepatomcellinjen HepaRG, som är känslig för HBV-infektion, 5, 6, har 7 utvecklats för att övervinna dessa problem. Dessutom PxB celler, isolerade från urokinas-type plasminogenaktivator transgena / SCID-möss ympade med primär human hepatocyte (PHH), visade sig vara mottagliga för HBV-infektion och replikering 8. Men HBV-replikation nivåer i HepaRG är beroende av celldifferentiering tillståndet efter kultur, vilket kan orsaka inkonsekventa och reproducerbara resultat av HBV-infektion / replikering nivåer. PxB används vanligen för HBV-infektion experiment, men begränsas av dess tillgänglighet. En tetracyklin inducerbar HBV uttryck cellinje HepAD38 har också använts i stor utsträckning för att studera HBV-replikation, men detta system endast tillåter utvärdering efter transkription och inte på ingångssteget av HBV-infektion 9. Nyligen har identifieringen av natriumtaurokolat cotransporting polypeptid (NTCP) som en funktionell receptor för HBV möjliggjort utvecklingen av en variabel HBV kultursystem 10. I själva verket NTCP uttryck i icke-mottagliga hepatokarcinom celler såsom Huh7 ochHepG2 möjliggör HBV-infektion 10 och därmed har valet av HBV mottagliga cellinjer utökats, lösa många av de experimentella begränsningar. Det andra problemet är bristen på ett enkelt testsystem för att utvärdera HBV-infektion och replikation. Utvärdering av HBV-infektion utförs vanligen genom att analysera HBV-DNA, RNA och proteiner. Men är kvantifiering av dessa virusmarkörer tidskrävande, ofta kostsamma och inte alltid enkelt. Därför är utvecklingen av ett enkelt analyssystem, såsom användning av en reportergen, kan övervinna problem som är associerade med HBV analyssystem.

Emellertid, därför att genomstorleken som kan förpackas i en HBV-kapsid är begränsad - mindre än 3,7 kb 11 - storleken av en reportergen bör vara så kort som möjligt. Vidare, närvaron av multipla cis-element utspridda i genomet, som är väsentliga för viral replikation, begränsas de lediga tjänster för i sertion av reportergenen i genomet. Flera rapporter har försökt att sätta in främmande gener, inklusive HIV-1 Tat, grönt fluorescerande protein, och DsRed, in i HBV-genomet 11, 12, 13. Emellertid är dessa rekombinanta HBVs är inte användbara för screening av HBV-infektion / replikation, eller för high-throughput screening av faktorer som påverkar HBV-infektion / replikation. Detta är främst på grund av den låga produktiviteten av rekombinanta virus och minskad intensitet av reporter genuttryck orsakas av ineffektiv virusproduktionen.

För att övervinna dessa problem, konstruerade vi en reporter HBV med ett högt utbyte av virusproduktion. Detta virus är mycket känslig för att övervaka de tidiga stadierna av HBV-replikationscykeln, från inträde till transkription. För att uppnå detta, var NanoLuc (NL) valdes som en markörgen för att det är en liten (171 aminosyror) engineered luminescent reporterclass = "xref"> 14. Dessutom är NL cirka 150 gånger starkare än eldfluga eller Renilla luciferas, och ljusreaktionen är ATP-oberoende, vilket tyder på att den falska träffsäkerhet kommer att vara låg för high-throughput screening. Produktionseffektiviteten av den rekombinanta HBV är ungefär 1/5 av moder HBV, och liknande till nivåer som rapporterats för tidigare HBV rekombinanta virus; emellertid ljusstyrkan i NL övervinner virusproduktivitetsfrågor så att den kan användas för mass screening av anti-HBV-medel.

Screening av anti-HBV-medel med användning av primära hepatocyter, kanske HepaRG, HepAD38 och NTCP-omvandlade leverceller vara användbara för screening av anti-HBV-medel genom konventionell metod (er). Det system som beskrivs här har olika fördelar, såsom enkel hantering, hög känslighet, och låg kostnad för screening. Dessa fördelar är lämpliga för hög genomströmning analyser för att utveckla och identifiera nya HBV-medel för terapeutiska ändamål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Produktion av rekombinant HBV Kodning av Reporter Protein

  1. Framställning av HepG2-celler
    1. Förbereda cellodlingsmedium (Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 100 U / ml icke-essentiella aminosyror).
    2. Plate 4 x 10 6 HepG2-celler i en 10 cm kollagenbelagda skålen i 10 ml odlingsmedium dagen före transfektion. Inkubera HepG2-celler vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 inkubator.
      ANMÄRKNING: När approximativt 4 x 10 6 HepG2-celler stryks ut i en 10 cm kollagenbelagd skål i 10 ml odlingsmedium, kommer de att vara 70 till 90% konfluenta nästa dag.
  2. transfektion
    1. Transfektera HepG2-celler med 5 pg av pUC1.2HBV delta epsilon 15 och 5 pg av pUC1.2HBV / NL 15 med hjälp av en transfektionreagens enligt tillverkarens anvisningar.
    2. Nästa dag, ta bort odlingsmedium och tillsätt 10 ml färskt odlingsmedium.
    3. En vecka efter transfektion, överföra odlingsmedium som innehåller den rekombinanta HBV till en 50 ml-rör och gå vidare till steg 1.3.1. Tillsätt 10 ml färskt odlingsmedium till plattan innehållande de transfekterade cellerna.
      OBS: Produktion av det rekombinanta HBV upprätthålles under 4 veckor. Odlingsmedium innehållande rekombinant HBV kan lagras vid 4 ° C under en månad.
  3. Rening av rekombinant HBV
    1. Avlägsna cellrester från odlingsmedium innehållande rekombinant HBV genom centrifugering (2300 x g under 5 min).
    2. Passera supernatanten genom ett 0,45 | im membranfilter.
    3. Tillsätt en lika volym av 26% PEG / 1,5 M NaCl (polyetylenglykol 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 och 5 ml 1 M HEPES pH 7,6 i 500 ml) till odlingsmediet innehållande rekombinantHBV och blanda försiktigt. Inkubera över natten vid 4 ° C.
    4. Centrifugera vid 2300 xg under 20 min vid 4 ° C.
    5. Kassera supernatanten och lös pelleten i 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
    6. Ta bort skräpet genom centrifugering vid 2300 x g under 5 min.
    7. Belastning 0,5 ml TNE innehållande rekombinant HBV på 0,8 ml 20% sackaros i TNE.
    8. Centrifugera vid 100000 x g under 3 h vid 15 ° C.
    9. Kassera så mycket av supernatanten som möjligt, och spara pelleten. Återsuspendera det i 1 ml serumfritt DMEM per 40 ml av utgångsodlingsmedium.
    10. Inkubera över natten vid 4 ° C.
    11. Filtrera genom ett 0,45 pm filter. Förbered 0,5 ml alikvoter och förvara vid -80 ° C.
      OBS: Om kontaminering av den ursprungliga virusprov reporterprotein observeras, rena viruset genom densitetsgradient ultra-centrifugering av 5-30% sackaros i TNE vid 100.000 xg under 2 timmar, eller CsCl densitet jämviktad centrifugering tillbakam 1,1-1,6 g / ml vid 150.000 xg under 50 timmar.

2. Infektion av rekombinant HBV

  1. Kultur HepG2-celler som stabilt uttrycker NTCP (HepG2 / NTCP) 15 som är mottagliga för HBV-infektion i DMEM kompletterat med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 250 | ig / ml G-418 och 100 U / ml icke-essentiella aminosyror vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2-inkubator.
  2. En dag före infektion, plattan ungefär 5 x 10 4 HepG2 / Ntcp celler 14 in i en 96-brunnars kollagenbelagd platta i 0,1 ml odlingsmedium.
  3. Tö rekombinant HBV i ett 37 ° C vattenbad tills det finns en liten bit av is kvar i injektionsflaskan.
  4. Förbered medium för infektion genom att kombinera följande: 10 fil av 40% PEG8000 i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 2 pl av dimetylsulfoxid (DMSO), 10 pl av rekombinant HBV och 78 | il av färskt odlingsmediumper brunn i en 96-brunnars platta.
  5. Tillsätt 100 pl av rekombinant HBV-lösningen till en brunn på 96-brunnar.
  6. En dag efter infektion, tvätta de infekterade cellerna 3 gånger med 300 pl PBS per brunn för avlägsnande av den kontaminerande reporterproteinet från viruset fraktionen.
  7. Inkubera infekterade celler i 200 pl odlingsmedium innehållande 2% DMSO för en vecka eller mindre.

3. Analys

  1. En vecka efter infektion, tvätta de infekterade cellerna 3 gånger med PBS.
  2. Tillsätt 50 pl av lyseringsbuffert till de infekterade cellerna.
  3. Vagga odlingsplattan under 5 min, och centrifugera sedan vid 2.000 xg under 5 min.
  4. Tillsätt 50 pl av reportersubstrat i luminometern plattan.
  5. Tillsätt 20 | il cellysat till en luminometer-platta innehållande reportersubstrat. Blanda genom att vortexa kort.
  6. Placera plattan i luminometern och initiera läsning 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 visar en schematisk bild av HBV-genomet, transkriberade RNA, virusproteiner och deras kodande regionen på genomet. Reportergenen och dess läge i genomet är också indikerade. Figur 2 visar den HBV-reporter-plasmid och hjälparfag plasmid innehållande reportergenen. Den pUC1.2HBV / NL reporter konstruerades genom att deletera nukleotidpositioner 223-811 från transkriptionsinitieringsstället av den förkärna mRNA från pUC1.2HBV 16 och sedan föra in den reportergen. Den pUC1.2HBVdelta med punktmutationer i den inkapsidering signalsekvensen genererades genom ställesriktad mutagenes PCR. Reporterplasmid (pUC1.2HBV / NL) och hjälpar-plasmid (pUC1.2HBVdelta) digererades med Hindlll och EcoRI, och utsattes därefter för gelelektrofores. De förväntade band, som är 3,0 kb för pUC-plasmid och 3,5 kb för 1.2HBV / NL eller 1.2HBVdelta, visas i figurure 2B. Figur 3 visar HepG2-celler som uttrycker NTCP infekterade med rekombinant HBV. Att etablera HepG2-celler som stabilt uttrycker NTCP var HepG2-celler transfekterades med pCAN-NTCP-myc kodar NTCP-myc och en neomycin resistent gen. G418-resistenta cellkloner selekterades och expanderades. HepG2-NTCP-myc-clone22 är mottagliga för HBV-infektion. Lysaten av HepG2 eller HepG2-NTCP-myc-clone22 utsattes för western blotting. NTCP är ett glykoprotein av 349 aminosyror, med en extracellulär N-terminal som innehåller två N-länkade glykosyleringsställen (Asn5 och Asn11). 43 kDa-bandet av icke glykosylerat NTCP och 65 kDa band av glykosylerat 10 den visas i figur 3A. HepG2-NTCP-myc-clone22 celler som uttrycker NTCP, men inte HepG2-celler, var känsliga för rekombinant HBV-infektion. Figur 4 visar kinetiken för reportergenen (A och B), virus-RNA och DNA (A) nivåer inom rekombinant HBV-infekterade HepG2-NTCP-myc-klonen22 (A) eller humana primära hepatocyt (PHH) celler (B). Nivåerna av HBV-RNA och reporter aktivitet förhöjd vid 3 dagar efter infektion i HepG2-NTCP-myc-clone22 eller PHH celler. Däremot fanns det ingen förändring i DNA-nivåer vid 9 dagar efter infektion eftersom rekombinant HBV är bristfällig för funktionell kärna och pol som har en viktig roll i den intracellulära DNA-replikation vägen. Figur 5 visar inhiberingen av rekombinant HBV av hepatit B-immunglobulin (HBIG), heparin och IFN-β. Inträdeshämmare såsom HBIG och heparin undertryckte starkt rapportöraktiviteten med mindre än 10% vid 75 U / ml och 150 U / ml, respektive, medan IFN-β tryckte reporteraktivitet med mindre än 50% vid 1000 U / ml. Den inhiberande effekten av dessa inhibitorer var dosberoende. Figur 6 visar livscykel HBV.

Figur 1
fi gur 1: Schematisk bild av HBV-genomet och relativa placeringen av virus-RNA och proteiner på genomet. HBV-DNA visas av en båge i svart. Placeringen av förstärkare och promotorer för transkription av virus RNA på båge visas i gult. Placeringen av virala RNA och proteiner på genomet representeras av pilar med streckade blå linjer (RNA) och med färgade pilar (proteiner), respektive. Virus RNA diskrimineras av storlek: 3,5 kb och 3,4 kb mRNA tyder förkärna / C och pregenomiskt RNA / Core, respektive 2,5 och 2,1 kb RNA representerar preS1 och preS2 / S, respektive, och 0,8 kb RNA indikerar X-gen 17. En reportergen är substituerad med den relevanta storleken av kärn kodande sekvensen. Reportergenen drivs av en kärna-promotor innehållande enhancer II. Pro: Promoter, EnhI / pro: Enhancer I / promotor, EnhII / Pro: EnhancerII / promotor, Pol: polymeras, S: ytantigen. target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Schematisk för generering av rekombinant HBV. (A) Blå linjer indikerar pregenome RNA. "A" stretch representerar poly A vid 3'-terminalen. Blå lådor anger den kodande regionen för varje virusprotein. Den röda rutan indikerar en reportergen översatt från sin egen initieringskodon. Reportern plasmiden kan inte producera förkärna och Pol, och hjälpare plasmid innehållande 2 mutationer i inkapsling signalen (CTGTGCC till CTATGTC) uttrycker alla HBV-proteiner. E: inkapsidering signal. (B) Den reporterplasmid, hjälpar-plasmid och pUC-plasmid digererades med EcoRI och Hindlll. Dessa digererade plasmider utsattes för gelelektrofores.ad / 54.849 / 54849fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Rekombinant HBV infekterar HepG2 uttrycker NTCP. (A) En stabil cellinje som uttrycker NTCP fastställdes genom transfektion av HepG2-celler med en plasmid som kodar Myc-tagged NTCP följt av selektion med 500 ng / ml av G418 under 3 veckor. Nivån av NTCP-Myc i HepG2-celler som stabilt uttrycker NTCP (HepG2-NTCP-Myc-clone22) celler bestämdes genom western blotting med användning av anti-myc-antikroppar (1: 1000 spädning). (B) HepG2-NTCP-Myc-clone22 celler infekterades med rekombinant HBV i närvaro av 2% DMSO och 4% PEG8000. Vid 72 h efter infektion, var nivån av reporteraktivitet bestämdes genom reporteranalys. Resultaten är representativa för tre oberoende experiment, och felstaplar visar the standardavvikelser av medlet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Tidsförlopp för rekombinant HBV-infektion. (A) HepG2-NTCP-Myc-clone22 celler infekterades med rekombinant HBV i närvaro av 2% DMSO och 4% PEG8000. Nivån av HBV-infektion bestämdes genom reporteraktivitet (svart linje) vid 3, 6 eller 9 dagar efter infektion. Nivåer av HBV-RNA (blå linje) och DNA (orange linje) sattes samtidigt mäts med RT-PCR och PCR 15, respektive, vid varje infektion tidpunkt. (B) Primära humana hepatocyter (PHH), isolerad från urokinas-typ-plasminogenaktivator transgena / SCID-möss som inokulerats med PHH, var infekterade med rekombinant HBV i presence av 2% DMSO och 4% PEG8000. Nivån av HBV-infektion bestämdes genom reporteraktivitet vid 3, 6, eller 9 dagar efter infektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Effekt av kända anti-HBV-medel på rekombinant HBV-infektion. HepG2-NTCP-Myc-22-celler infekterades med rekombinant HBV i närvaro av HBIG, heparin och IFN-β i de doser som anges, såväl som 2% DMSO och 4% PEG8000. Nivån av HBV-replikation (A) och cellviabilitet (B) bestämdes genom reporteraktivitet 6 dagar efter infektion. HBIG är en antikropp som neutraliserar HBV-infektion och heparin är en hämmare mot virus med hölje. Resultaten är representativa för tre oberoende experiment, och felstaplar visar standardavvikelserna för de medel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Schematisk av HBV livscykel. HBV träder in i celler genom virusreceptorer inklusive NTCP. Kapsid associerade avslappnad cirkulärt DNA (rcDNA) är obestruket och omvandlas till kovalent slutet cirkulärt DNA (cccDNA) i kärnan. cccDNA fungerar som en mall för mRNA-transkription. Det genomiska RNA inkapslat för viruset kapsiden genom montering med proteiner för kärna och pol. Före ytterligare montering med HBS-proteiner, är kapsiden inblandad vid amplifiering av HBV-DNA genom en process som kallas cccDNA replikeringsprocessen. Viruspartiklar, sammanfogade med HBS proteiner så småningom släpps utanför cellen.om / filer / ftp_upload / 54.849 / 54849fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HBV-genomet har fyra primära öppna läsramar (ORF) inklusive kärnan, polymeras, yta och X ORF (Figur 1). Transkription av dessa fyra HBV ORF är hårt reglerad av fyra promotorer: den förkärna / core promotor som innehåller förstärkare II, S1-promotor, S2 promotorn och X-promotorn innehåller förstärkare I 18. De 3,5 kb och 3,4 kb mRNA översätts till förkärna och kärnproteiner, respektive. Den stora kuvert protein (L) framställs av den största subgenomiska mRNA (2,5 kb), och i mitten (M) och små ytproteiner (S) är översatta från den kortare transkriptet (2,1 kb). 0,8 kb-transkriptet är mallen för översättning av X-proteinet 19, 20. 5 'och 3'ändarna av pregenomiskt RNA innehålla flera funktionella cis-element som inkluderar direkt upprepning 1 (DR1), DR2 och en packningssignal 21, 22. Dessa funktionella element begränsar införandet av reporter eller markörgener i pregenomiskt RNA. Vi konstruerade rekombinant HBV genom trans-komplementering av två vektorer, en överföringsvektor som innehåller reportergenen och en hjälpare vektor. Överföringsvektorn konstruerades genom ersättning av de centrala och pol-regioner med reportergenen (Figur 2).

NTCP identifierades som en cellulär receptor för HBV inträde 10. Eftersom uttrycket av NTCP mRNA är mycket låg i HepG2-celler, som inte är mottagliga för HBV-infektion har vi etablerat en stabil HepG2 cellinje som uttrycker NTCP-myc (Figur 3A). Medan rekombinant HBV-infektion av HepG2-celler visade ingen reporteraktivitet, NTCP expression i HepG2-celler tilldelats mottaglighet för rekombinant HBV-infektion (figur 3B). Tidsförloppet analys av rekombinant HBV-infektion har visat att både reporteraktivitet och HBV RNA detectable inom 3 dagar av rekombinant HBV-infektion och nådde en topp på nio dagar efter infektion; dock ökades HBV-DNA-nivåer som inte observerats (Figur 4). Entry-hämmare, såsom HBIG eller heparin, hämmade rekombinant HBV-infektion (Figur 5). Dessa resultat indikerade detta system kan användas för att övervaka tidigt stadium HBV-replikation från virus inträde till transkription, men inte DNA-replikation och återinfektion av virus frigörs från infekterade celler (fig 6).

Eftersom rapportproteinet förorenar ofta den rekombinanta HBV fraktionen, tvättning av de virusinfekterade cellerna med PBS mindre än tre gånger kan resultera i en hög bakgrund. Därför är det viktigt att kontrollera bakgrundsnivån genom att mäta reporteraktivitet i medium från HBV-okänslig HepG2 som behandlats med det rekombinanta viruset. Om bakgrunden är hög, lägga till en tvättsteg (3 gånger tvättning med 300 pl PBS per brunn i en 96-brunnar) dagen befmalm steg 3,1.

Om produktionen av den rekombinanta HBV är låg, kontrollera transfektionseffektiviteten med en kontrollplasmid som uttrycker ett fluorescerande protein, såsom GFP eller DsRed. I allmänhet bör effektiviteten för transfektion av HepG2-celler vara större än 35%. Om transfektionseffektiviteten är låg, optimera särskilda transfektion villkor för att uppnå höga transfektionseffektivitet. Om transfektionseffektiviteten är hög, kontrollera om infektiöst, rekombinant HBV framställs genom att använda det för att infektera primära humana hepatocyter. Smittsamheten HBV primära humana hepatocyter är vanligtvis högre än hepatomceller cellinjer som uttrycker NTCP. Om effektiv infektion av rekombinant HBV uppnås i primära humana hepatocyter, är problemet inte den rekombinanta HBV men celler som skall infekteras. Fastställa ett antal stabila HepG2 kloner som uttrycker NTCP och välj mycket smittsamma cellkloner. Låg cellsammanflytning i kultur vid tiden för infektion kan leda till dålig infectivity. Öka antalet celler i kulturen förbättrar infektionseffektivitet. För HBV-infektion, 80-95% konfluens för HepG2-celler som uttrycker NTCP vid tidpunkten för infektion ger en hög infektionsfrekvens.

Utvecklingen av flera reporter HBVs har rapporterats av många grupper 11, 12, 13, men de flesta av dessa reporter HBVs visar dålig produktivitet. Dessutom är reporteraktivitet i infekterade celler inte lika hög, och skulle vara svår att använda för screening av anti-HBV-medel med användning av en hög genomströmning analys. Däremot producerar vår reporter HBV systemet en stark reporter signal i de infekterade cellerna som gör det enkelt att utföra massundersökningar med avseende på anti-HBV-medel med användning av en relativt liten mängd av viruset i förhållande till andra reporter virus som rapporterats hittills.

Här har vi genererat en ny HBV reporter system för att övervaka de tidiga stadierna avHBV-replikationscykeln och detta valideras genom mätning av reporterproteinaktivitet efter infektion. Det beskrivna förfarandet är en enkel, snabb och kostnadseffektiv HBV vektorsystem och kommer att vara användbar för identifiering av HBV-värdfaktorer såväl som anti-HBV-föreningar genom användning av high-throughput screening metoder. I själva verket, identifierade vi HBV värdfaktorer och anti-HBV-gener genom hel-genomet RNAi-teknik 15. Notera är detta system inte lämpar sig för utvärdering av sena stadier av HBV-replikation, såsom DNA-replikation steg, kapsid, och virussammansättningen, och knoppande, eftersom rekombinant HBV är bristfällig för framställning av en funktionell kärna och pol. Den fortsatta utvecklingen av rekombinant HBV krävs för att utvärdera hela HBV livscykel.

Sammanfattningsvis kan detta system användas för att utvärdera HBV-infektion genom att mäta reporteraktivitet. Därför finns det inget behov av att utföra komplicerade analystekniker såsom PCR, RT-PCR,HBV Core eller S-antigen-ELISA för att utvärdera HBV-infektion / replikation. Slutligen, på grund denna reporter HBV är replikationsinkompetent, finns det ingen risk för infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127, (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13, (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44, (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33, (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106, (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456, (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4, (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87, (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7, (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106, (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44, (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9, (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3, (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42, (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370, (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344, (6266), 552-555 (1990).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter