Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

doi: 10.3791/54849 Published: February 1, 2017

Summary

Burada HBV yaşam döngüsünün erken aşamalarında izlemek için yeni geliştirilmiş hepatit B virüsü (HBV) muhabiri sistemini açıklar. Vitro sistemde BASİTLEŞTİRİLMİŞ yüksek verimli bir strateji kullanılarak anti-HBV maddelerinin taranması yardımcı olacaktır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hepatit B virüsü (HBV) ile kronik enfeksiyon kronik karaciğer hastalıklarında 1 için önemli bir risk faktörüdür. Mevcut tedavi stratejileri interferon uyarımlı gen fonksiyonlarının 2 ile HBV pol fonksiyonu ve / veya enfekte olmuş bireylerde bağışıklık yanıtlarını aktive tip I interferon verilmesini de dolaylı bastırıcı HBV proliferasyonunu inhibe nükleotid analoglan dayanmasına rağmen, bu tedaviler HBV ortadan kaldırmaz DNA tamamen 3. Ayrıca, bir anti-pol maddeler karşı dirençli olan HBVlerin çıkışı endişe 4 taşımaktadır. şirketinden insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV) veya hepatit C virüsü (HCV), yaşam döngüsünün farklı adımlarını hedefleme kombine anti-viral ajanlar uygulanması başarılı bastırmak ya da virüs (ler) ortadan kaldırmak için gösterilmiştir. Bu fikrin, H farklı aşamalarında doğrudan etki anti-HBV ajan (lar) gelişimine benzerBV yaşam döngüsü gelecek HBV terapileri kurulması için önemlidir.

Genel olarak, hedef virüs in vitro kültür sistemi basit bir kurulması anti-virüs maddelerinin geliştirilmesini kolaylaştırır. Bununla birlikte, anti-HBV maddeleri taramak için in vitro kültür sistemlerinin geliştirilmesi için en az iki engeller bulunmaktadır. İlk HBV enfeksiyonu / proliferasyonu için uygun bir in vitro hücre kültürü sisteminin olmamasıdır. Kurulan hücre hatlarında yayılır, HIV ve HCV gibi diğer virüsler, aksine, bunun nedeni, dar konukçu aralığının içeren deney sınırlamaları in vitro HBV yetiştirmek için zordur. Bu HBV enfeksiyonunun, 5, 6 karşı hassas olan, insan hepatoma hücre hattı HepaRG, belirli hücre kültür sistemlerinin kullanılması, 7, bu problemlerin üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Ayrıca, ürokinaz ty izole PXB hücreleri,PE plazminojen aktivatör transjenik / primer insan hepatosit (Ph) ile aşılanır SCID fareleri, HBV enfeksiyonu ve çoğaltma 8 duyarlı olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, HepaRG HBV replikasyon seviyesi HBV enfeksiyonu / çoğaltma seviyelerinin tutarsız ve 'tekrarı sonuçlara neden olabilir kültürden sonra hücre farklılaşması durum, bağlıdır. PXB yaygın HBV enfeksiyonu deneyleri için kullanılan ama durumu ile sınırlıdır. Bir tetrasiklin uyanlabilir HBV sentezleme hücre soyu, HepAD38, aynı zamanda yaygın HBV replikasyonunu incelemek için kullanılmıştır, ama bu sistem, sadece, transkripsiyon sonrası olup, HBV enfeksiyonu 9 giriş adımında değerlendirme sağlar. Son zamanlarda, HBV için işlevsel bir reseptör olarak, sodyum taurokolat cotransporting polipeptidin tanımlanması (NTCP) değişken bir HBV kültürü sisteminin 10 geliştirilmesine imkan tanımıştır. Gerçekte, bu tür Huh7 olarak duyarlı olmayan hepatokarsinoma hücrelerinin NTCP ekspresyonu veHepG2 HBV enfeksiyonunun 10 sağlar ve bu nedenle, HBV hassas hücre hatlarının seçimi deney sınırlamaları birçok çözme genişletilmiştir. İkinci bir sorun, HBV enfeksiyonu ve çoğaltma değerlendirmek için basit bir deney sisteminin olmamasıdır. HBV enfeksiyonu değerlendirilmesi genellikle HBV DNA, RNA ve proteinler analiz ederek yapılır. Ancak, bu virüs belirteçlerinin ölçümü genellikle masraflı ve zaman basit değil zaman tüketen vardır. Bu nedenle, basit bir deney sisteminin geliştirilmesi, bir raportör gen kullanılarak, HBV deney sistemleri ile ortaya çıkan problemlerin üstesinden gelinebilir.

Bununla birlikte, bir HBV kapsid içinde paketlenebilir genom boyutu sınırlı olduğundan, - en az 3.7 kb 11 - Bir raportör genin boyutu mümkün olduğu kadar kısa olması gerekir. Ayrıca, viral replikasyon için gerekli olan genom boyunca dağılmış birden çok cis elemanlarının varlığı bölgesi için uygun pozisyonlar sınırlar genomuna haberci genin yerleştirilmesine. Çeşitli raporlar, HBV genomunda 11, 12, 13 içine, HIV-1 Tat, yeşil floresan protein ve DsRed dahil olmak üzere yabancı genleri, eklemek için çalıştılar. Bununla birlikte, bu yeniden birleştirici HBVlerin HBV enfeksiyonu / çoğaltma ya da HBV enfeksiyonu / çoğaltma etkileyen faktörler yüksek verimli tarama taranması için kullanışlı değildir. Bu esas olarak bir araya getiren virüslerin, düşük verimlilik ve yetersiz virüs üretiminin neden raportör gen ekspresyonunun düşük yoğunluktadır.

Bu sorunları aşmak için, virüs üretiminin yüksek verim ile bir muhabir HBV inşa. Bu virüs girişinden transkripsiyonu için, HBV replikasyon döngüsünün erken aşamalarında izlenmesi için son derece duyarlıdır. Bu, küçük bir (171 amino asit) lüminesan raportör tasarlanmış olduğu için bu elde etmek için, NanoLuc (NL), bir işaretleyici gen olarak seçilmiştirclass = "xref"> 14. Ayrıca, NL ateşböceği ya Renilla lusiferaz daha parlak 150 kat yaklaşık ve lüminesan Reaksiyon yanlış isabet oranı yüksek verimli tarama düşük olacağını düşündürmektedir ATP'ye bağımsızdır. Rekombinant HBV üretim verimi yaklaşık 1/5 ebeveyn HBV bölgesinin ve önceki HBV yeniden birleştirici virüs rapor seviyelere benzer; anti-HBV maddelerinin kitlesel taranması için kullanılabilir ancak, NL parlaklığı virüsü verimliliği ilgili sorunların üstesinden gelmektedir.

Birincil hepatositleri kullanılarak anti-HBV maddelerinin taranması, HepaRG, HepAD38 ve NTCP-kalıt hepatositler, geleneksel yöntem (ler) anti-HBV maddelerinin taranması için yararlı olabilir. Ancak, burada açıklanan sistem, kolay kullanım, yüksek hassasiyet ve tarama için düşük maliyetli gibi çeşitli avantajlara sahiptir. Bu avantajlar, geliştirmek ve terapötik amaçlar için yeni HBV maddelerin belirlenmesi için kapsamlı incelemeler için uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Reporter protein kodlayan rekombinant HBV 1. Üretim

  1. HepG2 hücrelerinin hazırlanması
    1. Hücre kültürü ortamı hazırlayın (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS ile takviye (DMEM)), 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 100 U / ml esansiyel olmayan amino asitler).
    2. Kültür ortamında 10 ml Transfeksiyondan bir önceki gün içinde 10 cm'lik bir kollajen kaplı tabak Plaka 4 x 10 6 HepG2 hücreleri. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de, HepG2 hücreleri inkübe edin.
      Not: yaklaşık olarak 4 x 10 6 HepG2 hücreleri kültür ortamında 10 ml, 10 cm kollajen kaplı tabak içinde plakalanır, bunlar% 70-90 konfluent ertesi gün olacaktır.
  2. transfeksiyon
    1. PUC1.2HBV ö epsilon 15 5 ug ve pUC1.2HBV / NL 15 5 ug ile transfekt HepG2 hücreleri transfeksiyon kullanılaraküreticinin talimatlarına göre reaktif.
    2. Sonraki gün, kültür ortamı çıkarın ve taze kültür ortamı 10 ml.
    3. Bir hafta sonra transfeksiyon 50 ml tüp rekombinant HBV ihtiva eden kültür ortamı aktarmak 1.3.1 adıma devam edin. transfekte edilmiş hücreleri içeren plaka taze kültür ortamı 10 ml.
      Not: Rekombinant HBV üretimi 4 hafta süre ile muhafaza edilir. Rekombinant HBV ihtiva eden kültür ortamı 1 ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  3. Rekombinant HBV saflaştırılması
    1. santrifüj ile rekombinant HBV (5 dakika boyunca 2300 x g) ihtiva eden kültür ortamından hücre debrisini uzaklaştırmak.
    2. 0.45 um'lik bir membran filtresinden süpernatant geçirin.
    3. Kültür ortamına:% 26 PEG / 1.5M NaCI (130 g, NaCl, 49 g, 0.5 M EDTA, pH 8.0, 1 ml, 1 M HEPES pH 5 ml 7.6 500 ml polietilen glikol 6000) bir eşit hacmi ekleme ihtiva eden rekombinantHBV ve hafifçe karıştırın. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.
    4. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2300 x g'de santrifüjleyin.
    5. Süpernatant atılır ve TNE 0.5 ml (10 mM Tris, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA) içinde pelet çözülür.
    6. 5 dakika için 2300 x g'de santrifüjleme ile çöpleri çıkarın.
    7. TNE içinde 0.8 ml% 20 sükroz üzerinde yük yeniden birleştirici HBV ihtiva TNE 0.5 mi.
    8. 15 ° C'de 3 saat boyunca 100,000 x g'de santrifüjleyin.
    9. mümkün olduğunca süpernatant kadar atmak ve pelet kaydedin. kültür ortamının başlangıç ​​40 ml başına serumsuz DMEM, 1 ml içinde süspanse edin.
    10. 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.
    11. 0.45 um'lik bir filtre ile filtrelenir. -80 ° C de, 0.5 ml alikotları ve mağaza hazırlayın.
      Not: orijinal virüs numunenin raportör proteini kirlenme gözlenirse, 2 saat boyunca 100,000 x g'de TNE içinde% 5-30 sükroz yoğunluk gradyanı ile ultra santrifüj ile virüs arındırmak ya da ileri geri CsCI yoğunluk dengelenmiş santrifüj50 saat boyunca 150.000 x g'de m 1.1-1.6 g / ml olmuştur.

Rekombinant HBV 2. Enfeksiyon

  1. % 10 FBS, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 250 ug / ml G-418 ve 100 U / ml ile takviye edilmiş DMEM içinde HBV enfeksiyonuna duyarlı olan stabil bir şekilde NTCP (HepG2 / NTCP) 15'i ifade eden kültür HepG2 hücreleri nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de gerekli olmayan amino asitler,.
  2. Enfeksiyondan bir gün önce, plaka yaklaşık 5 x 10 4 HepG2 / kültür ortamına 0.1 ml, 96-çukurlu kollajen kaplı plaka NTCP hücreleri 14.
  3. 37 ° C su banyosu içinde çözülme rekombinant HBV şişede kalan buz küçük bir bit olana kadar.
  4. Aşağıdaki birleştirerek bulaşmasına orta hazırlayın: 1X fosfat tamponlu salin (PBS), dimetil sülfoksit, 2 ul (DMSO),% 40 PEG8000 10 ul rekombinant HBV 10 ul ve taze kültür ortamına 78 ul96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğu.
  5. 96 gözlü plakanın bir oyuğuna rekombinant HBV çözeltisi 100 ul ekle.
  6. Enfeksiyondan bir gün sonra, virüs fraksiyondan kirletici raportör proteinini çıkarmak için, göz başına 300 | il PBS ile enfekte edilmiş hücrelerde 3 kez yıkayın.
  7. Bir hafta ya da daha az,% 2 DMSO içeren kültür ortamında 200 ul enfekte hücreler inkübe edin.

3. Analiz

  1. Bir hafta sonra enfeksiyon, PBS ile enfekte edilmiş hücrelerde 3 kez yıkayın.
  2. enfeksiyonlu hücrelere liziz tamponunda 50 ul ekle.
  3. 5 dakika boyunca kültürü plakası sallayın, ve daha sonra 5 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüjlenir.
  4. Luminometre plakasına haberci substratın 50 ul ekle.
  5. raportör alt-tabakayı içeren bir luminometre plakasına hücre lizatının 20 ul ekle. kısaca vorteks ile karıştırın.
  6. Luminometreye plaka koyun ve 15 okuma başlatın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 1 genomu HBV genomu, transkribe edilmiş RNAlar, virüs proteinleri ve kodlama bölgesinin bir şemasını göstermektedir. genomunda raportör geni ve konumu da gösterilir. Şekil 2, raportör genini ihtiva eden HBV raportör plasmidi ve yardımcı plazmit gösterir. PUC1.2HBV / NL raportör pUC1.2HBV 16 prekor mRNA transkripsiyon başlatma sitesinden nükleotid pozisyonları 223-811 silme ve raportör geni sokulması ile yapılmıştır. Enkapsidasyon sinyali dizisi nokta mutasyonlar ile pUC1.2HBVdelta bölgeye yönelik mutajenez, PCR ile elde edilmiştir. Reporter plazmid (pUC1.2HBV / Hollanda) ve yardımcı plazmit (pUC1.2HBVdelta) Hindlll ve EcoRI ile sindirilir ve daha sonra jel elektroforezine tabi tutulmuştur. PUC plazmid 3.0 kb ve 1.2HBV / NL ya 1.2HBVdelta 3.5 kb'dir beklenen şeritleri, Şekil l'de gösterilmektedirure 2B. Şekil 3, yeniden birleştirici HBV ile enfekte NTCP ifade HepG2 hücreleri gösterir. stabil bir şekilde eksprese eden NTCP HepG2 hücreleri oluşturmak için, HepG2 hücreleri pCAN-NTCP-myc kodlayan NTCP-myc ve bir neomisin direnç geni ile transfekte edildi. G418-dirençli hücre klonları seçildi ve genişletildi. HepG2-NTCP-myc-clone22 HBV enfeksiyonuna karşı hassastır. HepG2 ve HepG2-NTCP-myc-clone22 lisatları western blotting tabi tutuldu. NTCP iki N-bağlantılı glikosilasyon (Asn5 ve Asn11) ihtiva eden bir hücre dışı bir N terminaline sahip, 349 amino asitli bir glikoproteindir. Glikosilatlanmamış NTCP 43 kDa bandı ve glikozile 10 65 kDa bandı Şekil 3A gösterilmiştir. NTCP ifade HepG2-NTCP-myc-clone22 hücreleri değil, HepG2 hücreleri, rekombinant HBV enfeksiyonuna duyarlı bulunmuştur. Şekil 4, rekombinant HBV ile enfekte olmuş HepG2-NTCP-myc-klon raportör genin kinetiği (A ve B), virüs RNA ve DNA (A) seviyelerini gösterir22 (A) ya da insan primer hepatosit (Ph) hücreleri (B). HBV RNA ve raportör aktivite düzeyleri HepG2-NTCP-myc-clone22 ya PHH hücrelerinde enfeksiyondan sonra 3 gün daha yüksekti. rekombinan HBV hücre içi DNA replikasyonu yolunda önemli bir role sahip fonksiyonel bir çekirdek ve pol yetersizdir çünkü aksine, enfeksiyondan sonra 9 gün sonra DNA seviyelerinde hiçbir değişiklik yoktu. Şekil 5, hepatit B immün globulin (HBIG), heparin ve IFN-p ile rekombinant HBV önlenmesini gösterir. IFN-β 1000 U / ml den az% 50 oranında raportör etkinliğini bastırılmış ise örneğin HBIG ve heparin gibi giriş inhibitörleri güçlü sırasıyla 75 ml U / 150 U / ml, en az% 10 oranında raportör aktivitesi bastırılır. Bu inhibitörlerin inhibitör etkisi doza bağımlıydı. Şekil 6 HBV'nin yaşam döngüsünü gösteriyor.

Şekil 1
Fi şekil 1: HBV genomunda genom virüs RNA'sı ve proteinlerin nispi konumunun şematik. HBV DNA siyah bir yay ile gösterilir. ark virüs RNA transkripsiyonu için hızlandırıcı ve promoterler yer sarı gösterilir. Viral RNA ve genom üzerinde protein konumu kesikli çizgiler, mavi (RNA) ile, sırasıyla renkli oklar (proteinler) ile ok ile temsil edilmektedir. Virüs RNA'lar boyutuna göre ayrımcılığa: 3.5 kb ve 3.4 kb mRNA'ların sırasıyla prekor / C ve öngenomlu RNA / Çekirdek, işaret, 2.5 ve 2.1 kb RNA'lar sırasıyla preS1 ve preS2 / S, temsil ve 0.8 kb RNA X geni 17 gösterir. Bir raportör gen çekirdek kodlama dizisinin ilgili boyutu ile ikame edilir. haberci gen arttırıcı II ihtiva eden bir çekirdek promotör ile tahrik edilir. Artılar: pro Promoter, EnhI /: Artırıcı I / promotör, EnhII Pro /: EnhancerII / promotör, Pol: Polimeraz S: Yüzey antijeni. target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Rekombinant HBV üretimi için şematik. (A) Mavi çizgiler öngenomunun RNA göstermektedir. "A" streç 3'ucunda poli A temsil eder. Mavi renkli kutular her bir virüs, bir protein için kodlama bölgesini göstermektedir. Kırmızı kutu kendi başlangıç ​​kodonundan çevrilmiş bir raportör geni gösterir. Prekor Pol ve (CTATGTC için CTGTGCC) enkapsidasyon sinyali 2 mutasyonları içeren yardımcı plazmid üretemez raportör plasmidi, tüm HBV proteinleri ifade eder. E: Kapsidasyonu sinyali. (B) raportör plazmid, yardımcı plazmid ve pUC plazmid EcoRI ve Hindlll ile sindirilmiştir. Bu sindirilen plazmid jel elektroforezine tabi tutulmuştur.reklam / 54849 / 54849fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: Rekombinant HBV HepG2 NTCP ifade bozar. (A) NTCP eksprese eden stabil bir hücre soyu 3 hafta boyunca G418 500 ug / ml ile seçim ardından Myc-etiketli NTCP kodlayan bir plasmid ile HepG2 hücrelerinin transfeksiyonu ile kurulmuştur. (: 1000 sulandırma 1) HepG2 hücrelerinde NTCP-Myc seviyesi kararlı bir şekilde NTCP (HepG2-NTCP-myc-clone22) hücreleri ifade eden anti-mik antikorlar kullanılarak Western blot ile belirlenmiştir. (B) HepG2-NTCP-myc-clone22 hücreler% 2 DMSO ve% 4 PEG8000 varlığında yeniden birleştirici HBV ile enfekte edilmiştir. enfeksiyondan sonra 72 saat sonra, bildirici aktivitesinin seviyesi bildirici deneyiyle belirlendi. Sonuçlar Üç bağımsız deneyi temsil etmektedir ve hata çubukları inci göstermektediraraçlarının e standart sapmaları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4: Rekombinan HBV enfeksiyonunun zaman akışı. (A), HepG2-NTCP-myc-clone22 hücreler% 2 DMSO ve% 4 PEG8000 varlığında yeniden birleştirici HBV ile enfekte edilmiştir. HBV enfeksiyonunun düzeyi enfeksiyondan sonra 3, 6 veya 9 gün sonra raportör etkinliği (siyah çizgi) ile tespit edilmiştir. HBV RNA (mavi çizgi) ve DNA (turuncu çizgi) seviyeleri aynı anda her enfeksiyon zaman noktasında, RT-PCR ve sırasıyla, PCR, 15 ile ölçülmüştür. (B) PhH ile aşılanmış ürokinaz tipi plazminojen aktivatörü transjenik / SCID farelerden izole edilmiş, presenc rekombinant HBV ile enfekte edilmiştir Primer insan hepatositleri (Ph),% 2 DMSO ve% 4 PEG8000 e. HBV enfeksiyonunun düzeyi enfeksiyondan sonra 3, 6 veya 9 gün sonra bir raportör etkinliği belirlendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: Rekombinan HBV enfeksiyonu bilinen bir anti-HBV maddelerinin etkisi. HepG2-NTCP-myc-22 hücreleri, yeniden birleştirici HBIG, belirtilen dozlarda heparin ve IFN-p mevcudiyetinde HBV, hem de% 2 DMSO ve% 4 PEG8000 ile enfekte edilmiştir. HBV replikasyonunun (A) ve hücre yaşayabilirliği (B) düzeyi, enfeksiyondan 6 gün sonra raportör etkinliği belirlendi. HBIG HBV enfeksiyonunun nötralize ve heparin zarflı virüslere karşı bir inhibitörü olan bir antikordur. Sonuçlar Üç bağımsız deneyden, ve hata çubukları, temsilcisi ortalamaların standart sapmalar göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6: HBV yaşam döngüsünün şematik. HBV NTCP virüs içeren reseptörler yoluyla hücre içine girer. Kapsid ilişkili rahat dairesel DNA (rcDNA) kaplanmamıştır ve çekirdekte kovalent olarak kapalı dairesel DNA (cccDNA) dönüştürülebilir. mRNA transkripsiyonu için, şablon olarak cccDNA çalışır. genomik RNA çekirdek ve pol proteinleri ile montaj virüs kapsid üzere kapsidlenirler edilir. ayrıca HBS proteinleri ile monte etmeden önce, kapsid bir işlemle HBV DNA'yı katılır cccDNA çoğaltma işlemi denir. HBS proteinleri ile birleştirilmiş virüs parçacıkları sonunda hücre dışına salınır.om / files / ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HBV genomu çekirdeği, polimeraz, yüzey ve X ORF (Şekil 1) dahil olmak üzere dört ana açık okuma çerçevelerini (ORF) sahiptir. Bu dört HBV ORF transkripsiyon sıkıca dört rehberleri tarafından düzenlenir: prekor / çekirdek geliştirici arttırıcı II içeren, S1 promotör, S2 promotör ve X yükseltici zenginleştirici 18 I içeren. 3.5 kb ve 3.4 kb mRNA'ların sırasıyla prekor ve Core proteinler çevrilir. Büyük zarf proteini (L) en büyük alt-genomik mRNA (2.5 kb) için üretilir, ve orta (M) ve küçük yüzey proteinleri (G) daha kısa transkript (2,1 kb) çevrilir. 0.8 kb transkript X proteini 19, 20 çeviri için bir modeldir. Öngenomlu RNA'nın 5've 3'uçları doğrudan tekrarı 1 (DR1), DR2 ve paketleme sinyali 21, 22 içeren çoklu fonksiyonel sis öğeleri içerir. Bu işlevsel elemanlar öngenomlu RNA'ya raporlayıcı veya işaretleyici gen sokulmasını sınırlandırır. İki vektörlerinin raportör geni ve bir yardımcı vektörü içeren bir transfer vektörü, trans-tamamlanmasını kullanılarak rekombinant HBV inşa edilmiştir. Transfer vektörü raportör genin (Şekil 2) ile çekirdek ve pol bölgelerinin değiştirilmesi ile inşa edilmiştir.

NTCP HBV giriş 10 adrenerjik reseptörü olarak tanımlandı. NTCP mRNA'nın sentezlenmesi HBV enfeksiyonuna duyarlı değildir HepG2 hücrelerinde, çok düşük olduğu için, NTCP-myc (Şekil 3A) ifade eden bir stabil HepG2 hücre hattı tesis. HepG2 hücreleri rekombinan HBV enfeksiyonu Resim raportör etkinliğini göstermesine karşın, HepG2 hücrelerinde NTCP ekspresyonu, rekombinant HBV enfeksiyonu (Şekil 3B) duyarlılığı haiz. rekombinant HBV enfeksiyonunun zaman ders analizi muhabiri aktivite ve HBV RNA hem de d olduğunu göstermiştirrekombinant HBV enfeksiyonu 3 gün içinde etectable ve 9 gün İnokulasyonu zirve yaptı; Bununla birlikte, artan HBV DNA seviyeleri (Şekil 4) gözlenmemiştir. Bu HBIG veya heparin, inhibe rekombinant HBV enfeksiyonu (Şekil 5) halinde giriş inhibitörleri. Bu sistemi belirtilmedikçe bu sonuçlar erken transkripsiyon virüs girişinden aşamalı HBV replikasyonunu değil, DNA replikasyonunu ve enfekte hücrelerden salınan virüsün yeniden enfeksiyon (Şekil 6) izlemek için de kullanılabilir.

raportör proteini, genellikle, PBS ile virüs bulaşmış hücrelerin yıkanması, rekombinan HBV fraksiyonu kontamine yana en az üç kat daha yüksek bir arka plan neden olabilir. Nedenle, yeniden birleştirici virüs ile tedavi edilen HBV ile hassas olmayan HepG2 medyumuyla raportör aktivitesini ölçerek arka plan düzeyi kontrol edilmesi çok önemlidir. Arka plan yüksekse, bir yıkama aşaması ile (3 kez, 96 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına 300 ul PBS ile yıkandıktan) günlük bef eklemeCevher 3.1 adım.

Rekombinant HBV üretimi düşükse, örneğin GFP veya DsRed gibi bir floresan protein ifade eden bir kontrol plasmidi ile transfeksiyon kontrol edilmesi. Genel olarak, HepG2 hücrelerinin transfeksiyon etkinliği% 35 daha büyük olması gerekmektedir. transfeksiyon verimi düşük ise, yüksek transfeksiyon verimi elde etmek için belirli bir Transfeksiyon koşulları optimize eder. transfeksiyon verimi yüksek ise, enfeksiyöz rekombinant HBV primer insan hepatositleri enfekte için kullanarak üretilen kontrol edin. Primer insan hepatositleri, HBV'nin enfekte NTCP ifade hepatoma hücre hatları genellikle daha yüksektir. rekombinant HBV etkili bir şekilde enfeksiyonu, primer insan hepatositlerinde elde edilir, bu sorun, rekombinant HBV değil ama hücrelerin enfekte edilmesi. NTCP ifade istikrarlı HepG2 klonlarının bir dizi kurmak ve son derece bulaşıcı hücre klonları seçin. enfeksiyonu zamanında kültürde düşük hücre konflüansa düşük i sonuçlanabilirnfectivity. kültürdeki hücrelerin sayısını arttırmak enfeksiyonun etkinliğini arttırır. HBV enfeksiyonu için, enfeksiyon sırasında NTCP eksprese HepG2 hücreleri% 80-95 konflüansa yüksek enfeksiyon oranını içerir.

Birkaç muhabir HBVlerin gelişimi birçok grup 11, 12, 13 tarafından bildirilen, ancak bu muhabir HBVlerin en kötü verimliliğini göstermek olmuştur. Ayrıca, enfekte olmuş hücreler içinde raportör etkinliği kadar yüksek değildir ve yüksek verimli bir deney kullanılarak anti-HBV maddeler taranması için kullanımı zor olacaktır. Buna karşılık, raportör HBV sistemi, şimdiye kadar bildirilen diğer raportör virüs ile karşılaştırıldığında virüs nispeten az miktarda kullanılarak anti-HBV maddeler için toplu bir taramasının yapılması için kolaylaştırır enfekte edilmiş hücrelerde güçlü bir reporter sinyalini üretir.

Burada, erken aşamalarında izlemek için yeni bir HBV muhabiri sistemi oluşturulurHBV replikasyon döngüsü ve bu enfeksiyondan sonra raportör protein aktivitesini ölçerek doğrulandı. tarif edilen yöntem, bir basit, hızlı ve düşük maliyetli bir HBV vektör sistemi olup, yüksek verimli tarama yöntemleri kullanılarak, HBV ana faktör olarak anti-HBV bileşiklerinin tanımlanması için yararlı olacaktır. Nitekim, biz bütün genom RNAi teknolojisi 15 HBV konakçı faktörleri ve anti-HBV genleri tespit etti. rekombinant HBV fonksiyonel çekirdek ve pol üretimi için yetersizdir, çünkü Not, bu sistem, DNA replikasyonu aşamasında, kapsid ve virüs montajı ve tomurcuklanma HBV replikasyon geç evrelerinde değerlendirilmesi için uygun değildir. rekombinant HBV daha da geliştirilmesi, tüm HBV yaşam döngüsü değerlendirmek için gereklidir.

Özetle, bu sistem, raportör aktivitesini ölçerek HBV enfeksiyonunun değerlendirilmesi için de kullanılabilir. Bu nedenle, PCR, RT-PCR gibi karmaşık deney teknikleri yapmak için bir ihtiyaç vardır,HBV Çekirdek veya S antijeni ELISA HBV infeksiyonu / çoğaltma değerlendirmek. Bu muhabir HBV replikasyon yetersiz olması nedeniyle, son olarak, enfeksiyon riski yoktur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nano-Glo Luciferase Assay Regent Promega N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution Nacalai tesque 09367-34 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific 11140050
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
100 mm/collagen-coated dish Iwaki 4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001 
Polyethylene glycol (PEG) 6000  Sigma-Aldrich 81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000  Sigma-Aldrich 89510
NaCl Nacalai tesque 31319-45 
0.5 mol/L EDTA Solution Nacalai tesque 06894-14
Tris-HCl Nacalai tesque 35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter Merck Millipore SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Collagen coated 96-well plate Corning NO3585
Passive Lysis 5x Buffer Promega E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer Promega E6501
Sucrose Nacalai tesque 30403-55
Luminometer plate Greiner bio-one 655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon - - Reference 15
pUC1.2HBV/NL - - Reference 15
50 ml tube Violamo 1-3500-02
Anti-Myc antibody Sigma-Aldrich C3956
HBIG Japan Blood Products Organization -
IFN-β Mochida Pharmaceutical 14987224005413
Heparin Sigma-Aldrich H3393

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127, (5), Supple 1 35-50 (2004).
  2. Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13, (4), 239-248 (2016).
  3. Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44, (3), 675-684 (2006).
  4. Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33, (3), 751-757 (2001).
  5. Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (6), 1875-1879 (1989).
  6. Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106, (3), 664-673 (1994).
  7. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, (24), 15655-15660 (2002).
  8. Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456, (1), 20-28 (2015).
  9. Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41, (8), 1715-1720 (1997).
  10. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
  11. Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
  12. Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4, (12), 1330-1340 (1997).
  13. Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87, (12), 6615-6624 (2013).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7, (11), 1848-1857 (2012).
  15. Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106, (11), 1616-1624 (2015).
  16. Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44, (4), 915-924 (2006).
  17. Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. Knipe, D., Howley, P. Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).
  18. Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9, (5), 323-331 (2002).
  19. Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3, (9), 2191-2196 (1984).
  20. Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42, (1), 297-308 (1985).
  21. Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370, (3), 471-480 (2007).
  22. Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344, (6266), 552-555 (1990).
Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).More

Nishitsuji, H., Yamamoto, H., Shiina, R., Harada, K., Ujino, S., Shimotohno, K. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (120), e54849, doi:10.3791/54849 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter