Summary
Prekliniska modeller som utvärderar adjuverande terapi riktade mot metastasering av bröstcancer saknas. För att ta itu med detta utvecklade vi en murin modell av de novo pulmonell adenokarcinommetastas i lungmammar, varvid terapier administrerade i adjuvansinställningen (postoperativ resektion av primära tumörer) kan utvärderas för effektivitet vid påverkan av tidigare utsöndrade pulmonella metastaser.
Introduction
Kvinnor i Nordamerika har en livslängd på 12% för att utveckla bröstcancer 2 ; En majoritet av dessa individer kommer att ha primära tumörer avlägsnas via kirurgi, och beroende på cancer subtyp, kommer då att få riktade, endokrina, kemo- och / eller strålningsterapi i adjuvansinställningen 3 . Exempel är att kvinnor diagnostiserats med hormonreceptor-positiva cancerformer som mottar antiöstrogenterapier och kvinnor med HER2-positiva tumörer som tar emot HER2-riktade terapier med strålning / kemoterapi, medan inga riktade terapier finns tillgängliga för triple negativa tumörer 3 . Trots framsteg inom strålning, kemoterapi, personliga och hormonbaserade terapier som kompletterar kirurgisk resektion uppstår sjukdom hos 30-70% av kvinnor diagnostiserade med stadium II eller III-sjukdom 4 , eftersom behandlingar i stor utsträckning är ineffektiva vid utrotning av metastatisk sjukdom i avlägsna organ, däribland Lunga, ben, bRegn och / eller lever 5 . Detta är särskilt signifikant med tanke på att när metastatisk sjukdom uppstår i frånvaro av primär tumöråterväxt, innebär detta att spridda maligna celler troligen redan var närvarande i sekundära organ vid tidpunkten för den definitiva operationen. Således är behandlingar som kan utrota eller långsam tillväxt av metastatiska tumörer brådskande nödvändiga.
Medan de novo- musmodellerna av mammakarcinogenes har varit anmärkningsvärt informativa i avslöjande mekanismer som reglerar neoplastisk progression 1 , har befintliga modeller också flera begränsningar. En av dessa är det faktum att de novo transgena modellerna typiskt utvecklar primära tumörer i flera bröstkörtlar, där primär tumörbörda begränsar studiens varaktighet. Medan primär tumörcellsflöde och metastatisk utsöndring sannolikt inträffar tidigt i neoplastisk progression i dessa modeller, uppträder frank utveckling av metastatiska tumörer sent och beroende oN musmodellen och belastningsbakgrunden, är ofta delvis penetrerande 1 . Detta begränsar användbarheten hos de novo- modellerna för upptäckt av molekyler som reglerar metastasering i sekundära organ och för utvärdering av preklinisk effekt av terapeutiska medel i adjuvansinställningen.
För att kringgå dessa begränsningar utvecklade vi en de novo autochtonmodell av metastaser i mammakarcinom i lungorna. Parentala transgena kvinnor ( dvs. MMTV-PyMT på FVB / n-stammen bakgrunden för studier som beskrivs häri) bärande de novo mammatumörer med sena stadium är åldrade till ~ 100 dagar 6 , vid vilken tidpunkt deras primära tumörer kirurgiskt återkallas och enzymatiskt dissocieras till Enkelcellsuspensioner. Suspensioner (1 x 10 6 celler) är i sin tur ortotopiskt explanterades i 6-7 veckor gamla mottagande syngena möss av honkön, där enkel primära brösttumörer utvecklas över en 38-60 dagars period ( 3 ) bedöms mottagarmössen och primära tumörer resureras kirurgiskt så att tumörgenväxt på operationsplatsen minimeras, i överensstämmelse med operation hos kvinnor ( kompletterande Figur 1 ). På FVB / n-stambakgrunden utvecklar möss histologiskt detekterbara metastatiska foci i lungorna med 45% penetrering av ~ 115 dagar efter operationen ( Figur 1B ). Med denna förlängda latens av metastatisk tumörtillväxt är modellen unikt positionerad för adjuverande terapiavgivning och för att belysa och utvärdera underliggande biologi som påverkar metastatisk progression efter kirurgisk avlägsnande av primära tumörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur som används i följande protokoll omfattas av Oregon Health and Science University Institutionella djurvård och användningskommitté (IACUC), som är utformad för att överensstämma med djurskyddslagen och PHS-riktlinjerna.
Underhåll av sterila förhållanden: Steriliserade instrument ska användas och mellan möss ska torkas ren med steril gasbindning, sköljas i PBS följt av sterilisering med desinfektionsmedel 70% etanol i minst 15 minuter. En kirurgisk keps, ansiktsmask, klänning och handskar borde användas för överlevnadsoperationer. Preoperativ förberedelse av djuret för överlevnadsoperationer ingår i följande protokoll. Se tabell 1 för en lista över reagenser och utrustning.
1. Isolering och beredning av enkelcellssuspensioner från primära mammaltumörer
- Bedöva donorhona 100 dagars gamla transgena MMTV-PyMT (FVB / n) möss och behåll under cOntinuös sedation genom administrering av 2% isofluran via en anestesimask. Bekräfta att musen är ordentligt bedövad med en frånvarande fotknippreflex.
- I en steril inställning resekverar primära brösttumörer från 100-dagars transgena hona MMTV-PyMT (FVB / n) möss genom att separera brösttumör från överliggande hud och omgivande fettvävnad och / eller lymfkörtlar med steril sax. Euthanize de bedövade mössen genom cervikal dislokation.
- Med steril sax eller en skalpell, primärtarmar i hålan manuellt i små bitar (~ 1,0 mm 3 ). Placera tumörstycken i 3,0 mg / ml kollagenas A och 4,0 U / ml DNas I upplöst i DMEM. Använd ~ 10 ml av ovanstående digestionsmedium per tumör med 1,0 cm diameter.
- Utför matsmältningen i en steril 25 ml flaska med en steril omrörningsstång vid ~ 125 rpm och 37 ° C i 40 minuter.
- Stoppa digestionen genom att tillsätta fetalt bovint serum (FBS) till en slutlig utspädning på 10% och placera hela blandningen på wEn is där den bibehålls.
- Filtrera den uppdelade tumörsuspensionen genom en 0,7 μm nylonfilter i ett 50 ml koniskt rör och kassera eventuell kvarvarande tumör i silen. Centrifugera supernatanten vid 300 xg vid 4 ° C.
- Resuspendera pelleten i 10 ml DMEM per 1,0 cm tumör och återfiltrera genom en 0,7 μm nylonfilter. Räkna cellkoncentrationen, centrifugera sedan vid 300 xg vid 4 ° C.
- Resuspendera pelleten i 10% dimetylsulfoxid med 90% FBS vid en koncentration av 2 x 10 7 levande celler / ml. Förvara encellsuspensioner av hel primärtumör vid -80 ° C.
2. Ortotopisk injektion av mammaltumör
- Partiellt tina frusna primära tumörssuspensioner vid 37 ° C tills den frusna pelleten kan frisättas från det kryogena röret i 20 ml DMEM och räkna cellerna. Centrifugera vid 300 xg vid 4 ° C och resuspendera celler i en 1: 1 DMEM: tillväxtfaktor-reducerad solubiliserad basalmembranberedning eExtraherades från Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mussarkom vid en koncentration av 1 x 107 celler / ml (se Materialetabellen ).
- Placera den bedövade mottagaren kvinnliga syngene musventrala sidan upp och upprätthålla under kontinuerlig sedering genom att administrera 2% isofluran via en anestesimask.
- Sterilisera den högra 4: e bröstkörtelns injektionsstället med aerosoliserad 70% etanol och applicera Poly (vinylpyrrolidon) -Iodin med en steril bomullspinne.
- Injicera 100 μL (1 x 10 6 levande celler från frusna primära tumörssuspensioner) avfasad upp till ocleared höger 4-bröstkörtel hos 6 till 10 veckor gamla kvinnliga FVB / n-mus med en 29 G 0,3 ml insprutningsspruta.
3. Kirurgisk resektion av ortopotopisk mammaltumör
- 38-60 dagar efter injektion av tumörcell, avlivar möss som inte uppvisar ortotopiska tumörvolymer som sträcker sig mellan 172 och 450 mm 3 i volym [längd x (bredd 2
- Placera bedövade möss som visar rätt tumörstorlek ventral sida upp under kontinuerlig sedering genom att administrera 2% isofluran via en anestesimask och bekräfta att musen är ordentligt bedövad med en frånvarande fotknippreflex. Applicera vetsalva i ögonen för att förebygga torrhet under sedering.
- Spraya 70% etanol för att sterilisera det kirurgiska området som omger den primära tumören och applicera sedan poly (vinylpyrrolidon) -iod med en steril bomullspinne.
OBS: Hårborttagning på operationsplatsen resulterade i hudutkrävningar och / eller infektioner för ~ 5% möss och utesluts därför från detta steg (data visas inte). - Såsom visas i Figur 1C , gör en initial hudinsats med hjälp av trubbigt sax medial-caudal till tumören.
- Därefter gör du en överlägsen excision av huden ( Figur 1C ) medial till tumören. Var uppmärksam på behovet av att cauterize någon vaskulär feUtbyta tumören belägen på huden innan du sträcker snittet.
- Fortsätt huden snitt lateralt (bakom tumören), sedan göra en överlägsen hud excision (lateral till tumör) och medial excision (överlägsen tumör) ( Figur 1C ).
- När huden har skurits runt runt tumören ( Figur 1C ), lyfter den överliggande huden som är fäst vid tumören med hjälp av tångar, medan den stumma dissekerar tumören bort från bukväggsmuskulaturen och håller bröstkörtlarna intakta.
- Identifiera (genom trubbig dissektion) och cauterize stora fartyg som löper genom 4: e och 5: e mammokörtlarna.
- Accisera ungefär hälften av den 4: e och femte bröstkörtlarna vid cauteriseringsstället för att frigöra tumören, överliggande huden och segment av bröstkörtlarna ( Figur 1C ).
- Vid blödning identifiera aktivt blödningFartyg och omedelbart cauterize dem. Om mer än 250 μl blod förloras, uteslut musen från studier och avliva den.
- Nära excisionsställen med sårklämmor med hjälp av en sårklämma ( Figur 1C ).
OBS: Ta bort sårklämmorna 10 dagar efter operationen med en sårklämborttagare. - Administrera varm steril saltlösning subkutant (4% av djurets kroppsvikt) och håll djuret varmt med en värmelampa. Kontrollera djuren varje 5-10 min under återhämtning från anestesi.
OBS: Administrering av antingen bupivakain eller lidokain ökade postoperativ mortalitet (data ej visad). Möss som visade tecken på smärta (hunching, ovillig att flytta, brist på brudgummen) 1 h efter operationen blev euthanized.- När musen har återhämtat sig, returnera den till andra möss.
4. Isolering och behandling av blod och lung för flödescytometri och histologi
<ol>OBS: Frysta bestånd av upplöst bromodeoxuridin används inom 1 månad efter beredningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Större än 75% av mottagande möss som tar emot 1 x 10 ^ celler från primära brösttumörer härledda från MMTV-PyMT-möss utvecklar enskilda bröst adenokarcinom som sträcker sig i storlek från 172 till 450 mm 3 inom 38-60 dagar (data ej visade). Möss som är berättigade till randomisering inskrives sedan i studiegrupper efter kirurgisk resektion av primära tumörer som visas ( Figur 1C ). Primär tumörgenväxt identifierades hos mindre än 2% möss som genomgick kirurgisk resektion av primärtumör ( kompletterande Figur 1 ). 45% av mottagande möss utvärderade genom detta protokoll utvecklade histologiskt detekterbara metastatiska foci vid dag 115 efter tumörresektion ( Figur 1B ). För att bekräfta histologi av metastaser i områden identifierade innehållande metastatiska celler genom H & E-färgning utvärderades intilliggande vävnadssektioner av PyMT PCR (data ejvisad).
Figur 1 : Postkirurgisk resektion av primära tumörer och utveckling av de novo pulmonell metastasering. ( A ) Experimentellt schema av murint adenokarcinommetastasmodell. † betecknar att alla möss var hjärtkomprimerade och injicerade med BrdU på dagen för eutanasi. ( B ) Representativ H & E, där detektering av metastatiska foci bedömdes genom seriell sektion av FFPE-lungvävnad med separerade lobes. Metastatiska foci (> 5 celler) bestämdes genom H & E-färgning varje 100 | im som reflekterar 1 300 μm vävnad. Lungor från 11 möss analyserades. ( C ) Schema för kirurgisk resektion av primär brösttumör. Röda siffror och pilar betecknar ordningen och riktningen för hudinsnittGränsar till den primära tumören (vänster). De högsta 4: e och 5: e mammakörtlarna med större kärl visas på den primära tumören (mitten) följt av sårförslutning med sårklämmor (höger). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Isolering, perfusion och fixering av lungor. Bild (vänster) och motsvarande tecknad (höger) visas av lungisolering, perfusion och fixering. ( A ) Ett mittlinjeinsnitt visas med insättningsbild som visar infälld hud och exponerar den högra 4: e och femte bröstkörtlarna (pilen). ( B ) Magsväggen är öppen för membranet. ( C ) Efter retraktion oF intestin, är buken aorta (pilhuvud) identifierad och skärs upp. ( D ) Membran och sidopaneler av ribbburet skärs för att exponera bröstkaviteten. ( E ) Lungen perfunderas genom hjärtats högra hjärtkärl tills lungorna blir helt vita ( F ). ( G ) Den exponerade luftröret identifieras följt av injicering av formalin ( H ) i luftröret tills lungorna har expanderat ( I ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande Figur 1 : Primär tumörgenväxt vid kirurgisk plats. Representativa H & E (topp) och brutto (nedre) bilder av den återstående högra 4: e och 5: e bröstkörteln efter operationen, vilket visar att det inte finns tuMor återväxt med inguinal lymfkörteln ( AB ) och bröstkörteln med primär tumörgenväxt ( CE ). Vänligen klicka här för att ladda ner den här siffran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ändringar och felsökning:
När trubbigt dissekerar tumör bort från bukväggen, kan tumören förbli vidhäftande mot bukväggen. Detta observerades hos <5% möss injicerade med tumör (data ej visad). För möss med tumörer som vidhäftar sig i bukväggen, bör musen euthaniseras eftersom resektion är svår utan primär tumörväxt.
Begränsningar av modell / teknik:
Andra undersökare har rapporterat närvaro av fluorescensmärkta enskilda metastatiska celler, som spridas till lever, njure, mjälte och hjärna, förutom lung, efter reimplantation av mammalterminala ändknoppar som härrör från MMTV-PyMT-möss 7 , förutom lung observerades flera Möss med metastatisk foci i lever, vars penetration ännu inte har bestämts. Andra platser med potentiell metastatisk börda, såsom lymfkörtelnS, mjälte, ben och hjärna, utvärderades inte. En begränsning av denna teknik innefattade också postoperativa excoriationer och infektion i huden vid rakning av operationsplatsen. På grund av detta begränsades det kirurgiska ställets sterilitet till applicering av 70% etanol följt av Poly (vinylpyrrolidon) -jod.
Kritiska steg inom protokollet:
Blunt dissektion av tumören bort från bukväggen är ett kritiskt steg (steg 3.7) där undvikande av kärlen i bröstkörteln bör utföras. Steg 3.8 och 3.9 är också kritiska steg där det finns störst risk för okontrollerad blödning. De okauteriserade proximala och distala delarna av kärlet bör identifieras efter cauterization för att enkelt kunna visualisera blödningskällor.
Betydelse i förhållande till befintliga metoder:
Musmodeller av mänsklig cancer efterliknar sjukdomsstadierProgression, kinetik och histopatologi ger ovärderliga verktyg för att identifiera och utvärdera nya mål för terapi, liksom potentiell effekt av nya terapeutiska medel som riktar sig mot dessa molekyler / vägar. Medan svans- och / eller hjärtinjektion av etablerade cancercellinjer ofta används som experimentella modeller för metastasering, misslyckas dessa att rekapitulera kritiska steg i metastatiseringsprocessen och istället reflektera ektopiska organkoloniseringsanalyser där aspekter av överföring av tumörceller kan utvärderas 8 . Vidare, medan vissa existerande transgena musmodeller av de novo mammakarcinogenesutveckling ger modellsystem som möjliggör studie av steg involverade i metastasering, begränsar signifikant primär tumörbörda typiskt studiens längd. Sålunda har grupper injicerade odlade neoplastiska celler härledda från MMTV-PyMT primära tumörer för att möjliggöra kirurgisk resektion 9 . Vår metod expanderar från dessa tekniker som det dOes inte väljas för neoplastiska cellinjer odlade från tumörer in vitro och introducerar direkt den fullständiga, heterogena primära tumören till mottagande möss. Dessutom möjliggör den långa latensen av lungmetastasbildningen i vår modell ett bättre terapeutiskt fönster för olika behandlingsstudier.
Framtida applikationer:
När det gäller utvärdering av effekten av terapeutiska medel i dessa modeller, eftersom primära tumörer typiskt utvecklas i alla bröstkörtlar, är kirurgisk resektion av alla primära tumörer och adjuvans utvärdering av terapier som syftar till att minimera tillväxten av metastatiska kolonier inte möjligt. På grund av dessa problem utvecklade vi en autochtonisk modell av metastatisk spridning där metastatisk spridning av tumörceller inträffar de novo och efter kirurgisk resektion av primärtumör etableras en förlängd latensperiod som möjliggör identifiering av metastas i lungan. Således, denna modellSpeglar mänsklig bröstcancermetastas och ger ett unikt system för att utvärdera effekten av adjuvanslevererade terapier för inverkan på att reglera sjukdomsfri överlevnad och / eller övergripande överlevnad med definierade slutpunkter enligt IACUCs riktlinjer.
Eftersom en stor andel kvinnor med bröstcancer behandlas genom kirurgisk resektion av primära tumörer 10 , och de som utvecklas senare utvecklar distal metastasin innebär detta att spridning och sådd har inträffat före kirurgisk resektion. Distala organmikroenvironments ger unika nischer för överlevande och / eller prolifererande metastatiska celler 11 . Det är sålunda nödvändigt att modellsystem efterliknar dessa aspekter så att molekyler och vägar som är verksamma på sekundära platser, som sannolikt skiljer sig från primära tumörer, kan identifieras, studeras och terapier som riktar sig till dem exakt utvärderas för effektivitet. Modellen som utvecklas här tillhandahåller dessa aspekter för studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar om konflikt med data som presenteras här.
Acknowledgments
Författarna tackar Jo Hill för histopatologisk hjälp, dr. John Gleysteen för instruktion i kirurgisk teknik, Tessa Diebel för videobistånd, alla medlemmar i Wong and Coussens laboratorier för kritisk inblick och diskussioner och OHSU Knight Cancer Institute för ekonomiskt stöd. Författarna bekräftar stöd från T32GM071388-10 och T32CA106195-11 till CEG, NCI / NIH, Försvarsdepartementet för bröstcancerforskningsprogram, Susan G Komen Foundation, Stiftelsen för bröstcancerforskning och Stativ upp till cancer - Lustgarten Foundation Kankerkonvergensdröm Team Translational Research Grant (SU2C-AACR-DT14-14) till LMC, en kvinnors hälsocirkel att ge Foundation Award till MHW, och Brenden-Colson Center för pankreatisk hälsa till MHW och LMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
References
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. Howlader, N. N. A., Krapcho, M. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. based on November 2010 SEER data submission, posted to the SEER web site. http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/ (2011).
- National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer (Version 3.2014). , Accessed November 25. http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2016).
- Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).
- Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., et al. Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine. Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R., et al. , 6th, BC Decker. Hamilton (ON). (2003).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
- Kouros-Mehr, H., et al. GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model. Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Qian, B. Z., et al. FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis. J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).
- Verkooijen, H. M., et al. Patients' refusal of surgery strongly impairs cancer survival. Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis. Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
