Summary
Los modelos preclínicos que evalúan la terapia adyuvante dirigida a la metástasis del cáncer de mama están ausentes. Para tratar esto, se desarrolló un modelo murino de metástasis de adenocarcinoma mamario pulmonar de novo , en el que se pueden evaluar las terapias administradas en la configuración adyuvante (resección postquirúrgica de tumores primarios) en cuanto a eficacia en el impacto de metástasis pulmonares previamente sembradas.
Introduction
Las mujeres en América del Norte tienen un 12% de riesgo de por vida ~ de desarrollar cáncer de mama 2; Una mayoría de estos individuos tendrán tumores primarios quitados vía cirugía, y dependiendo del subtipo del cáncer, recibirán entonces endocrino, endocrino, quimioterapia y / o radioterapia en el ajuste adyuvante 3 . Entre los ejemplos se incluyen las mujeres diagnosticadas con cánceres receptores hormonales positivos que reciben terapias anti-estrógenos y las mujeres con tumores positivos a HER2 que reciben terapias dirigidas a HER2 con radiación / quimioterapia, mientras que todavía no se dispone de terapias dirigidas para tumores triples negativos 3 . A pesar de los avances en radioterapia, quimioterapia, terapias personalizadas y basadas en hormonas que complementan la resección quirúrgica, la enfermedad se repite en el 30-70% de las mujeres diagnosticadas con enfermedad en estadio II o III 4 , ya que las terapias son en gran medida ineficaces para erradicar la enfermedad metastásica en órganos distantes, Pulmón, hueso, bLluvia y / o hígado 5 . Esto es especialmente significativo dado que cuando la enfermedad metastásica se produce en ausencia de rebrote del tumor primario, esto implica que las células malignas diseminadas probablemente ya estaban presentes en los órganos secundarios en el momento de la cirugía definitiva. Por lo tanto, se necesitan urgentemente terapias capaces de erradicar o retardar el crecimiento de tumores metastásicos.
Mientras que los modelos de ratón de novo de la carcinogénesis mamaria han sido notablemente informativos en revelar mecanismos que regulan la progresión neoplásica 1 , los modelos existentes también tienen varias limitaciones. Uno de ellos es el hecho de que los modelos transgénicos de novo típicamente desarrollan tumores primarios en múltiples glándulas mamarias, donde la carga tumoral primaria limita la duración de los estudios. Mientras que el escape de células tumorales primarias y la siembra metastásica probablemente ocurren temprano en la progresión neoplásica en estos modelos, el desarrollo franco de los tumores metastásicos ocurre tarde y dependiendoN el modelo del ratón y el fondo de la cepa, a menudo es parcialmente penetrante 1 . Esto limita aún más la utilidad de los modelos de novo para el descubrimiento de moléculas que regulan la metástasis en los órganos secundarios y para evaluar la eficacia preclínica de los agentes terapéuticos en el contexto del adyuvante.
Para eludir estas limitaciones, se desarrolló un nuevo modelo autóctono de metástasis de carcinoma mamario a los pulmones. Las hembras transgénicas parentales ( es decir , MMTV-PyMT en el fondo de la cepa FVB / n para los estudios descritos en la presente memoria) que llevan tumores mamarios de novo de fase tardía se envejecen a ~ 100 días 6 , momento en el que sus tumores primarios son resecados quirúrgicamente y disociados enzimáticamente en Suspensiones de células individuales. Las suspensiones (1 x 10 ^ { 6} células) a su vez se explantan ortotópicamente en ratones hembra singénicos receptores de 6-7 semanas de edad, en los que se desarrollan tumores mamarios primarios únicos durante un periodo de 38 a 60 días 3), los ratones receptores son anestesiados y los tumores primarios se quirúrgicamente resecados de tal manera que el nuevo crecimiento del tumor en el sitio quirúrgico se reduce al mínimo, en consonancia con la cirugía en mujeres (Figura 1). En el fondo de la cepa FVB / n, los ratones desarrollan focos metastásicos detectables histológicamente en los pulmones con una penetración del 45% por ~ 115 días después de la cirugía ( Figura 1B ). Con esta latencia extendida de crecimiento tumoral metastático, el modelo está posicionado de forma única para la administración de terapia adyuvante y para elucidar y evaluar la biología subyacente que influye en la progresión metastásica después de la extirpación quirúrgica de tumores primarios.
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Protocol
Los animales utilizados en el siguiente protocolo están cubiertos por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregon, diseñado para cumplir con las regulaciones de la Ley de Bienestar Animal y la Política del Servicio de Salud Pública (PHS).
Mantenimiento de las condiciones estériles: Se deben usar instrumentos esterilizados y entre ratones, deben limpiarse con gasa estéril, enjuagarse con PBS y esterilizar con etanol al 70% durante al menos 15 minutos. Se debe usar una gorra quirúrgica, mascarilla, bata y guantes para las cirugías de supervivencia. La preparación preoperatoria del animal para cirugías de supervivencia se incluye en el siguiente protocolo. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de reactivos y equipos.
1. Aislamiento y preparación de suspensiones de células individuales de tumores mamarios primarios
- Anestesiar a los ratones transgénicos MMTV-PyMT (FVB / n) femeninos 100 días de edad y mantener bajo cSedación continua mediante la administración de isoflurano al 2% a través de una máscara de anestesia. Confirme que el ratón está correctamente anestesiado con un reflejo ausente del pellizco del pie.
- En un entorno estéril, se resecan tumores mamarios primarios de ratones transgénicos MMTV-PyMT (FVB / n) de 100 días de edad separando el tumor mamario de la piel su- perativa y del tejido adiposo circundante y / o los nódulos linfáticos usando tijeras estériles. Eutanasia de los ratones anestesiados por dislocación cervical.
- Con tijeras estériles o un bisturí, pique los tumores primarios manualmente en pequeños trozos (~ 1,0 mm 3 ). Coloque las piezas tumorales en 3,0 mg / ml de colagenasa A y 4,0 U / ml de DNasa I disueltas en DMEM. Utilizar ~ 10 ml del medio de digestión anterior por tumor de 1,0 cm de diámetro.
- Realizar la digestión en una botella estéril de 25 ml con una barra de agitación estéril a ~ 125 rpm y 37 ° C durante 40 min.
- Detener la digestión añadiendo suero bovino fetal (FBS) a una dilución final del 10% y colocar toda la mezcla sobre wY el hielo donde se mantiene.
- Filtrar la suspensión del tumor digerido a través de un filtro de nylon de 0,7 μm en un tubo cónico de 50 ml y descartar cualquier tumor que permanezca en el colador. Centrifugar el sobrenadante a 300 xg a 4 ° C.
- Resuspender el gránulo en 10 mL de DMEM por tumor de 1,0 cm y volver a filtrar a través de un colador de nylon de 0,7 mu m. Contar la concentración celular, luego centrifugar a 300 xg a 4 ° C.
- Resuspender el sedimento en 10% de sulfóxido de dimetilo con 90% de FBS a una concentración de 2 x 10 7 células vivas / ml. Almacenar las suspensiones de células únicas de todo el tumor primario a -80 ° C.
2. Inyección ortotópica del tumor mamario
- Descongele parcialmente las suspensiones de tumor primario congeladas a 37 ° C hasta que el sedimento congelado pueda ser liberado desde el tubo criogénico en 20 ml de DMEM y contar las células. Centrifugar a 300 xg a 4 ° C y resuspender las células en un 1: 1 DMEM: factor de crecimiento reducido solubilizado preparación de la membrana basal eExtraído del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) a una concentración de 1 x 10 7 células / ml (véase la Tabla de Materiales ).
- Colocar el lado anastésico del ventrículo femenino del ratón singénico receptor anestesiado y mantener bajo sedación continua administrando isoflurano al 2% a través de una máscara de anestesia.
- Esterilice el sitio de inyección de 4ª glándula mamaria derecho usando etanol 70% en aerosol y aplicando Poli (vinilpirrolidona) -Iodo con un hisopo de algodón estéril.
- Inyectar 100 μl (1 x 10 6 células vivas de suspensiones tumorales primarias congeladas) con el lado biselado hacia arriba en la 4ª glándula mamaria no eliminada del ratón femoral FVB / n de 6 a 10 semanas de edad usando una jeringa de insulina de 0,9 ml.
3. Resección quirúrgica del tumor mamario ortotópico
- 38-60 días después de la inyección de células tumorales, la eutanasia a los ratones que no presentan volúmenes de los tumores ortotópicos que oscilan entre 172 450 mm 3 en volumen [longitud x (anchura 2
- Colocar los ratones anestesiados que muestran el tamaño ventral del tumor apropiado hacia arriba bajo sedación continua mediante la administración de isoflurano al 2% a través de una máscara de anestesia y confirmar que el ratón está anestesiado correctamente con un reflejo ausente del pellizco del pie. Aplique el ungüento del veterinario a los ojos para la prevención de la sequedad mientras que bajo sedación.
- Rocíe 70% de etanol para esterilizar el área quirúrgica que rodea al tumor primario, luego aplique Poly (vinilpirrolidona) -Iodo con un hisopo de algodón estéril.
NOTA: La depilación en el sitio quirúrgico resultó en excoriaciones cutáneas y / o infecciones en ratones al 5% y, por lo tanto, fue excluida de este paso (datos no mostrados). - Como se muestra en la Figura 1C , realice una incisión inicial de la piel utilizando tijeras romas medial-caudales al tumor.
- A continuación, realizar una excisión superior de la piel ( Figura 1C ) medial al tumor. Preste atención a la necesidad de cauterizar cualquier vasculatura.Eding el tumor localizado en la piel antes de extender la incisión.
- Continuar la incisión de la piel lateralmente (posterior al tumor), luego realizar una excisión superior de la piel (lateral al tumor), y la excisión medial (superior al tumor) ( Figura 1C ).
- Después de que la piel ha sido extirpada circunferencialmente alrededor del tumor ( Figura 1C ), levante la piel superpuesta unida al tumor usando un fórceps mientras se disecciona romo el tumor lejos de la musculatura de la pared abdominal y manteniendo las glándulas mamarias intactas.
- Identificar (por disección romo) y cauterizar grandes vasos que atraviesan las glándulas mamarias 4 ª y 5 ª .
- Excise aproximadamente la mitad de la 4ª y 5ª glándulas mamarias en el sitio de cauterización para liberar el tumor, la piel y segmentos de las glándulas mamarias ( Figura 1C ).
- En caso de sangrado, identifique la hemorragia activaLos vasos sanguíneos y cauterizarlos inmediatamente. Si se pierde más de 250 μl de sangre, excluir al ratón del estudio y eutanasiarlo.
- Cerrar los sitios de escisión con clips de herida utilizando un aplicador de clip de herida ( Figura 1C ).
NOTA: Retire los clips de herida 10 días después de la cirugía con un removedor de pinza herida. - Administrar solución salina estéril caliente por vía subcutánea (4% del peso corporal del animal) y mantener al animal caliente con una lámpara de calor. Compruebe los animales cada 5-10 minutos durante la recuperación de la anestesia.
NOTA: La administración de bupivacaína o lidocaína aumentó la mortalidad postoperatoria (datos no presentados). Ratones que mostraron signos de dolor (hunching, poco dispuesto a moverse, falta de novio) 1 h después de la cirugía fueron eutanasiados.- Una vez que el ratón se ha recuperado completamente, devuélvalo a la compañía de otros ratones.
4. Aislamiento y procesamiento de sangre y pulmón para citometría de flujo e histología
<OlNOTA: Las existencias congeladas de bromodesoxiuridina disuelta se usan dentro de un mes después de la preparación.
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Representative Results
Mayor que 75% de los ratones receptores recibieron 1 x 10 6 células de tumores mamarios primarios derivados de ratones MMTV-PYMT, desarrollar adenocarcinomas mamarios individuales varían en tamaño de 172 450 mm 3 dentro de 38-60 días (datos no mostrados). Ratones elegibles para la asignación al azar se inscribieron en grupos de estudio después de la resección quirúrgica de los tumores primarios, como se muestra ( Figura 1C ]. Recrecimiento del tumor primario se identificó en menos de 2% de los ratones que fueron sometidos a resección quirúrgica del tumor primario (Figura 1). El 45% de los ratones receptores evaluados mediante este protocolo desarrollaron focos metastásicos histológicamente detectables al día 115 después de la resección tumoral ( Figura 1B ). Para afirmar la histología de metástasis en áreas identificadas que contenían células metastásicas por tinción de H & E, las secciones de tejido adyacentes fueron evaluadas por PyMT PCR (datos nomostrado).
Figura 1 : Resección postquirúrgica de tumores primarios y desarrollo de metástasis pulmonar de novo . ( A ) Esquema experimental del modelo de metástasis de adenocarcinoma mamario murino. † indica que todos los ratones fueron perfundidos cardíacos y se les inyectó BrdU el día de la eutanasia. ( B ) H & E representativo donde la detección de focos metastásicos se evaluó por seccionamiento en serie de tejido pulmonar FFPE con lóbulos separados. Los focos metastásicos (> 5 células) se determinaron mediante tinción con H & E cada 100 mu m que refleja 1.300 mu m de tejido. Se analizaron los pulmones de 11 ratones. ( C ) Esquema de resección quirúrgica del tumor mamario primario. Los números rojos y las flechas indican el orden y la dirección de las incisiones cutáneasBordeando el tumor primario (izquierda). Las 4 ª y 5 ª glándulas mamarias derecha con los vasos principales se muestran unidas al tumor primario (centro) seguido por el cierre de la herida con clips de la herida (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Aislamiento, perfusión y fijación de pulmón. Se muestra la imagen (izquierda) y el dibujo animado correspondiente (derecha) del aislamiento pulmonar, perfusión y fijación. (A) Se hace una incisión en la línea media se muestra con imagen de la inserción se presentan piel retraída exponiendo la ésimo derecho 4 y 5 de las glándulas mamarias (flecha). ( B ) La pared abdominal se muestra abierta al diafragma. ( C ) Después de la retracción oF intestino, la aorta abdominal (punta de flecha) se identifica y se abre. ( D ) El diafragma y los lados laterales de la caja torácica se cortan para exponer la cavidad torácica. ( E ) El pulmón es perfundido a través del ventrículo derecho del corazón hasta que los pulmones se vuelven totalmente blancos ( F ). ( G ) Se identifica la tráquea expuesta seguida de la inyección de formalina ( H ) en la tráquea hasta que los pulmones se han expandido ( I ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementaria Figura 1: el nuevo crecimiento del tumor primario en el sitio quirúrgico. Imágenes representativas H & E (arriba) y gruesas (abajo) de la 4ª y 5ª glándula mamaria restantes posteriores a la cirugía, mostrando ausencia de tuRebrote de mor con ganglio linfático inguinal ( AB ) y glándula mamaria con rebrote de tumor primario ( CE ). Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Modificaciones y solución de problemas:
Cuando el tumor de disección romo se aleja de la pared abdominal, el tumor puede permanecer adherente a la pared abdominal. Esto se observó en <5% de ratones inyectados con tumor (datos no mostrados). Para ratones con tumores adherentes a la pared abdominal, el ratón debe ser sacrificado ya que la resección es difícil sin rebrote de tumor primario.
Limitaciones del modelo / técnica:
Mientras que otros investigadores han informado de la presencia de células monosaturales marcadas fluorescentemente y diseminadas al hígado, riñón, bazo y cerebro, además del pulmón, tras el reimplante de brotes terminales de mamarias derivadas de MMTV-PyMT 7 , aparte del pulmón, Ratones con focos metastásicos en el hígado, cuya penetración aún no se ha determinado. Otros sitios de carga metastásica potencial, como el ganglio linfáticoS, bazo, hueso y cerebro, no fueron evaluados. Una limitación de esta técnica también incluyó escoriaciones postoperatorias e infección de la piel al afeitar el sitio quirúrgico. Debido a esto, la esterilidad del sitio quirúrgico se limitó a la aplicación de etanol al 70% seguido por poli (vinilpirrolidona) - yodo.
Pasos críticos dentro del protocolo:
La disección roma del tumor lejos de la pared abdominal es un paso crítico (paso 3.7) en el que se debe realizar la evitación de los vasos dentro de la glándula mamaria. Los pasos 3,8 y 3,9 son también pasos críticos donde hay mayor riesgo de sangrado incontrolado. Las porciones proximal y distal no acobardadas del vaso deben ser identificadas después de la cauterización para visualizar fácilmente las fuentes de sangrado.
Significado con respecto a los métodos existentes:
Modelos de ratón de cáncer humano que imitan etapas de la enfermedadLa progresión, la cinética y la histopatología proporcionan herramientas invaluables dentro de las cuales identificar y evaluar nuevos objetivos terapéuticos, así como la eficacia potencial de nuevos agentes terapéuticos dirigidos a esas moléculas / vías. Aunque la vena de la cola y / o la inyección cardíaca de líneas celulares de cáncer establecidas se usan a menudo como modelos experimentales de metástasis, éstas fallan en recapitular etapas críticas en el proceso metastásico y en cambio reflejan ensayos de colonización de órganos ectópicos donde se pueden evaluar aspectos de supervivencia de células tumorales 8 . Por otra parte, mientras que algunos modelos de ratón transgénicos existentes de nuevo de mama carcinogénesis desarrollo proporcionan sistemas modelo que permite el estudio de los pasos involucrados en la metástasis, la carga de tumor primario significativo normalmente limita la duración del estudio. Así, los grupos han inyectado cultivos de células neoplásicas derivadas de MMTV-PyMT tumores primarios para permitir la resección quirúrgica [ 9] . Nuestro método se expande a partir de estas técnicas, ya que dNo se seleccionan para líneas celulares neoplásicas creadas a partir de tumores in vitro e introducen directamente el tumor primario heterogéneo completo a los ratones receptores. Además, la larga latencia de la formación de metástasis pulmonares en nuestro modelo permite una mejor ventana terapéutica para diversos estudios de tratamiento.
Aplicaciones futuras:
En cuanto a la evaluación de la eficacia de la terapéutica en estos modelos, ya que los tumores primarios se desarrollan típicamente en todas las glándulas mamarias, la resección quirúrgica de todos los tumores primarios y la evaluación adyuvante de terapias dirigidas a minimizar el crecimiento de colonias metastásicas no es posible. Debido a estos problemas, se desarrolló un modelo autóctono de diseminación metastásica en el que se produce diseminación metastásica de células tumorales de novo , y tras la resección quirúrgica del tumor primario, se establece un período de latencia prolongado que permite la identificación de metástasis en el pulmón. Así, este modeloRefleja la metástasis del cáncer de mama humano y proporciona un sistema único para evaluar la eficacia de las terapias administradas con adyuvante para el impacto en la regulación de la supervivencia libre de enfermedad y / o la supervivencia global con puntos finales definidos según las directrices de IACUC.
Dado que una gran proporción de mujeres con cáncer de mama son tratadas mediante resección quirúrgica de tumores primarios 10 , y las que progresan posteriormente desarrollan metástasis distal, esto implica que la diseminación y la siembra ocurrieron antes de la resección quirúrgica. Los microambientes de órganos distales proporcionan nichos únicos para sobrevivir y / o proliferar células metastásticas 11 . Por lo tanto, es imperativo que los sistemas modelo imitar estas facetas de tal manera que las moléculas y las vías operativas en sitios secundarios, que son probablemente distintos de los tumores primarios, pueden ser identificados, estudiados, y las terapias dirigidas a ellos evaluados con precisión para la eficacia. El modelo desarrollado aquí proporciona estos aspectos para el estudio.
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones de conflicto con los datos presentados aquí.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Jo Hill por su asistencia en histopatología, al Dr. John Gleysteen por la instrucción en técnica quirúrgica, a Tessa Diebel por la asistencia videográfica, a todos los miembros de los laboratorios Wong y Coussens por discusiones críticas y al OHSU Knight Cancer Institute por su apoyo financiero. Los autores reconocen el apoyo de T32GM071388-10 y T32CA106195-11 a CEG, el NCI / NIH, el Departamento de Defensa del Programa de Investigación del Cáncer de Mama, la Fundación Susan G Komen, la Fundación de Investigación del Cáncer de Mama y un Stand Up To Cancer - Lustgarten Foundation (SU2C-AACR-DT14-14) a LMC, el premio de la Fundación de Círculo de Salud de la Mujer a la MHW, y el Centro Brenden-Colson para la Salud del Páncreas a MHW y LMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
References
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. Howlader, N. N. A., Krapcho, M. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. based on November 2010 SEER data submission, posted to the SEER web site. http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/ (2011).
- National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer (Version 3.2014). , Accessed November 25. http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2016).
- Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).
- Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., et al. Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine. Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R., et al. , 6th, BC Decker. Hamilton (ON). (2003).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
- Kouros-Mehr, H., et al. GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model. Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Qian, B. Z., et al. FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis. J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).
- Verkooijen, H. M., et al. Patients' refusal of surgery strongly impairs cancer survival. Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis. Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
