Summary
Недоклинические доклинические модели, оценивающие адъювантную терапию, нацеленную на метастазы рака молочной железы. Чтобы решить эту проблему, мы разработали мышиную модель метастаза левожелудочной молочной железы аденокарциномы de novo , где терапию, вводимую в адъювантной обстановке (послеоперационная резекция первичных опухолей), можно оценить для эффективности при воздействии ранее высеваемых легочных метастазов.
Introduction
Женщины в Северной Америке имеют ~ 12% пожизненный риск развития рака молочной железы 2; Большинство из этих людей будут иметь первичные опухоли, удаленные хирургическим путем, и в зависимости от подтипа рака, затем получат целевую, эндокринную, химио- и / или лучевую терапию в адъювантной обстановке 3 . Примеры включают, женщин с диагнозом рака гормон рецептор-положительным , получавших анти-эстроген терапии и женщин с HER2-позитивными опухолями , получающих HER2-мишенью терапии с лучевой / химиотерапии, в то время как нет целевой терапии еще не доступны для тройных негативных опухолей 3. Несмотря на успехи в радиации, химиотерапии, персонализированный и гормонов на основе методов лечения , которые дополняют хирургическую резекцию, болезнь рецидивирует в 30-70% женщин с диагнозом II стадии или III болезни 4, как терапия в значительной степени неэффективны в искоренении метастазирования в отдаленные органы, в том числе Легкие, кости, bДождь и / или печень 5 . Это особенно важно, учитывая, что, когда метастатическая болезнь возникает при отсутствии первичного роста опухоли, это означает, что рассеянные злокачественные клетки, вероятно, уже присутствовали во вторичных органах во время окончательной операции. Таким образом, срочно необходимы терапии, способные искоренить или замедлить рост метастатических опухолей.
В то время как мышиные модели de novo для канцерогенеза молочной железы были чрезвычайно информативны в выявлении механизмов, регулирующих прогрессирование новообразований 1 , существующие модели также имеют несколько ограничений. Одним из них является тот факт, что de novo трансгенные модели обычно развивают первичные опухоли в множественных молочных железах, где первичная опухолевая нагрузка ограничивает продолжительность исследований. В то время как первичный побег опухолевых клеток и метастатическое высевание, вероятно, происходят в начале неопластического прогрессирования в этих моделях, откровенное развитие метастатических опухолей происходит поздно, и в зависимости отN модель мыши и фон деформации часто являются частично проникающими 1 . Это еще больше ограничивает полезность моделей de novo для обнаружения молекул, регулирующих метастазы во вторичных органах, и для оценки доклинической эффективности терапии в условиях адъюванта.
Чтобы обойти эти ограничения, мы разработали автохтонную модель метаноза рака молочной железы в легкие de novo . Родительские трансгенные самок ( т. Е. MMTV-PyMT на фоне штамма FVB / n для исследований, описанных здесь), несущие поздние стадии опухолей молочной железы de novo, составл ют до 100 дней 6 , после чего их первичные опухоли хирургически ресецируют и ферментативно диссоциируют в Одноцепочечные суспензии. Суспензии (1 × 10 6 клеток), в свою очередь, орто-оптически экспрессируются у 6-7-недельных сингенных женских мышей-реципиентов, где одиночные первичные опухоли молочной железы развиваются в течение периода от 38 до 60 дней ( 3 ) мышей-реципиентов анестезируют, а первичные опухоли хирургически подвергают резекции, так что восстановление опухоли на хирургическом участке минимизируется, что согласуется с хирургией у женщин ( фиг. 1 ). На фоне штамма FVB / n мыши развивают гистологически обнаруживаемые метастатические очаги в легких с 45% -ной пенетрантностью через ~ 115 дней после операции ( рис. 1B ). Благодаря этой расширенной латентности роста метастатической опухоли модель уникально позиционируется для доставки адъювантной терапии, а также для выяснения и оценки лежащей в основе биологии, влияющей на метастатическую прогрессию после хирургического удаления первичных опухолей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животные, используемые в следующем протоколе, охватываются Институтом по охране и использованию животных в Университете штата Орегон (IACUC), который призван соответствовать требованиям Закона об охране здоровья животных и политике общественного здравоохранения (PHS).
Обслуживание стерильных условий: Стерилизованные инструменты следует использовать, а между мышами следует протирать стерильной марлей, промыть в PBS, а затем стерилизовать 70% -ным этанолом дезинфицирующим средством в течение как минимум 15 минут. Хирургический колпачок, маска для лица, мантия и перчатки должны носить для выживания. Предварительная подготовка животного для операций по выживанию включена в следующий протокол. См. Таблицу 1 для списка реагентов и оборудования.
1. Выделение и подготовка суспензий одиночных клеток от первичных опухолей молочной железы
- Анестезируйте донорскую женскую 100-летнюю трансгенную мышь MMTV-PyMT (FVB / n) и поддерживайте ее под cOntinuous sedation путем введения 2% изофлурана через анестезию. Убедитесь, что мышь правильно анестезирована отсутствующим рефлексом стопы.
- В стерильной обстановке рассеивают первичные опухоли молочной железы у 100-летних трансгенных мышей MMTV-PyMT (FVB / n), выделяя опухоль молочной железы из кожи и окружающей жировой ткани и / или лимфатических узлов, используя стерильные ножницы. Усыпьте анестезированных мышей шейным дислокацией.
- С помощью стерильных ножниц или скальпеля вручную перенесите первичные опухоли на мелкие кусочки (~ 1,0 мм 3 ). Поместите опухолевые кусочки в 3,0 мг / мл коллагеназы А и 4,0 ед. / Мл ДНКазы I, растворенной в DMEM. Используйте ~ 10 мл вышеуказанной пищеварительной среды на опухоль диаметром 1,0 см.
- Выполните переваривание в стерильной бутылке емкостью 25 мл со стерильной мешалкой при температуре ~ 125 об / мин и 37 ° C в течение 40 минут.
- Остановите переваривание, добавив фетальную сыворотку крупного рогатого скота (FBS) до конечного разведения 10% и поместите всю смесь на wEt ice, где он поддерживается.
- Отфильтруйте переваренную суспензию опухоли через нейлоновый фильтр 0,7 мкм в коническую трубку объемом 50 мл и отбросьте любую опухоль, оставшуюся в сетчатке. Центрифугируют супернатант при 300 × g при 4 ° C.
- Ресуспендируют гранулу в 10 мл DMEM на 1,0 см опухоли и повторно фильтруют через 0,7 мкм нейлоновый фильтр. Считайте концентрацию клеток, затем центрифугируйте при 300 xg при 4 ° C.
- Ресуспендированный осадок в 10% диметилсульфоксиде с 90% FBS в концентрации 2 × 10 7 живых клеток / мл. Хранить одноклеточные суспензии цельной первичной опухоли при -80 ° C.
2. Ортотопическая инъекция опухоли молочной железы
- Частично оттаивают замороженные первичные опухолевые суспензии при 37 ° С, пока замороженный осадок не может быть высвобожден из криогенной трубки в 20 мл DMEM и подсчет клеток. Центрифуга при 300 xg при 4 ° C и ресуспендирующие клетки в 1: 1 DMEM: восстановленный фактор-солюбилизированный препарат мембраны основания eXtracted от саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) в концентрации 1 × 10 7 клеток / мл (см. Таблицу материалов ).
- Поместите поджелудочную женскую абсентологическую вентральную сторону пациента и поддерживайте при непрерывном седативном воздействии путем введения 2% изофлурана через анестезию.
- Стерилизуйте правую четвертую область инъекции молочной железы с использованием аэрозольного 70% этанола и применяя поли (винилпирролидон) -один с стерильным ватным тампоном.
- Внесите 100 мкл (1 × 10 6 живых клеток из замороженных первичных опухолевых суспензий), скошенную вверх в нечистую правую четвертую молочную железу 6-10-недельной мышиной мыши FVB / n, используя шприц для инъекций на 29 G 0,3 мл.
3. Хирургическая резекция ортотопической опухоли молочной железы
- Через 38-60 дней после инъекции опухолевых клеток мышей эвтаназии, не имеющих объем ортотопических опухолей, в пределах от 172 до 450 мм 3 в объеме [длина х (ширина 2
- Поместите обезболивающих мышей, имеющих надлежащую размерность опухоли вентральной стороной под непрерывным седативным эффектом, путем введения 2% изофлурана с помощью маски для анестезии и подтвердите, что мышь должным образом анестезирована отсутствующим рефлексом стопы. Нанесите ветеринарную мазь на глаза для предотвращения сухости во время седации.
- Распылите 70% этанола для стерилизации хирургической области, окружающей первичную опухоль, затем нанесите Poly (винилпирролидон) -один с стерильным ватным тампоном.
ПРИМЕЧАНИЕ. Удаление волос на хирургическом участке приводило к эксорсированию и / или инфекциям кожи у мышей ~ 5% и поэтому исключалось из этого этапа (данные не показаны). - Как показано на рисунке 1С , сделайте начальный разрез кожи, используя тупые ножницы медиально-каудальные для опухоли.
- Затем сделайте превосходное удаление кожи ( рис. 1C ) медиальной опухоли. Обратите внимание на необходимость прижигания любой сосудистой сетиУдаляя опухоль, расположенную на коже, перед расширением разреза.
- Продолжите разрез кожи сбоку (позади опухоли), затем сделайте превосходное удаление кожи (поперечное к опухоли) и медиальное удаление (выше опухоли) ( рис. 1C ).
- После того, как кожа была вырезана по окружности вокруг опухоли ( рис. 1C ), поднимите поверх кожи, прикрепленную к опухоли, используя щипцы, в то время как тупые рассекают опухоль от мускулатуры брюшной стенки и сохраняют целостность молочных желез.
- Определите (путем тупой диссекции) и прижигайте крупные сосуды, проходящие через 4- ю и 5- ю молочные железы.
- Акцизируйте приблизительно половину 4- й и 5- й молочных желез на участке прижигания, чтобы освободить опухоль, покрывающую кожу и сегменты молочных желез ( рис. 1С ).
- В случае кровотечения, выявить активное кровотечениеСосудов и немедленно прижигать их. Если потеряно более 250 мкл крови, исключить мышь из исследования и усыпить ее.
- Закройте участки эксцизии с помощью раневых зажимов с помощью раневого клипса ( рисунок 1С ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Удалите зажимы для раны через 10 дней после операции с помощью средства для снятия зажимов. - Администрировать теплый стерильный физиологический раствор подкожно (4% от веса тела животного) и держать животное в тепле с помощью тепловой лампы. Проверяйте животных каждые 5-10 минут во время выздоровления от анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ. Администрация либо бупивакаина, либо лидокаина увеличивала послеоперационную смертность (данные не показаны). Мыши, которые проявляли признаки боли (головокружение, нежелание двигаться, отказ жениха) через 1 ч после операции были подвергнуты эвтаназии.- Как только мышь полностью восстановится, верните ее в компанию других мышей.
4. Изоляция и обработка крови и легких для проточной цитометрии и гистологии
<ол>ПРИМЕЧАНИЕ. Замороженные запасы растворенного бромдезоксиуридина используются в течение 1 месяца после приготовления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Более 75% мышей-реципиентов, получавших 1 × 10 6 клеток от первичных опухолей молочной железы, полученных от мышей MMTV-PyMT, развивали одиночные аденокарциномы молочной железы размером от 172 до 450 мм 3 в течение 38-60 дней (данные не показаны). Мыши, имеющие право на рандомизацию, затем регистрируются в исследовательских группах после хирургической резекции первичных опухолей, как показано ( рис. 1C ). Первичный рост опухоли выявлялся менее чем у 2% мышей, которым была проведена хирургическая резекция первичной опухоли ( дополнительный рисунок 1 ). 45% мышей-реципиентов, оцененных по этому протоколу, разработали гистологически обнаружимые метастатические очаги на пост-опухолевую резекцию на 115 дней ( рисунок 1B ). Чтобы подтвердить гистологию метастазов в областях, содержащих метастатические клетки, путем окрашивания H и E, смежные участки ткани оценивали с помощью PyMT PCR (данные непоказано).
Рисунок 1: Пост-хирургическое удаление первичных опухолей и развития De Novo легких метастазов. ( A ) Экспериментальная схема модели метастазирования аденокарциномы молочной железы у мышей. † означает, что все мыши были перфузированы и введены BrdU в день эвтаназии. ( B ) Представитель H & E, где обнаружение метастатических очагов оценивали путем последовательного секвенирования легочной ткани FFPE с разделенными долями. Метастатические очаги (> 5 клеток) определяли окрашиванием H & E каждые 100 мкм, отражающими 1300 мкм ткани. Проанализированы легкие от 11 мышей. ( C ) Схема хирургической резекции первичной опухоли молочной железы. Красные цифры и стрелки обозначают порядок и направление разрезов кожиГраничащих с первичной опухолью (слева). Правые 4- я и 5- я молочные железы с крупными сосудами показаны прикрепленными к первичной опухоли (средняя) с последующим раневым зажимом с раневыми зажимами (справа). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Изоляция, перфузия и фиксация легких. На снимке (слева) и соответствующем мультфильме (справа) показаны изоляция легких, перфузия и фиксация. ( A ) Вырез срединной линии показан с вложенным изображением, отображающим втянутую кожу, подвергая правую 4- ю и 5- ю молочные железы (стрелка). ( B ) Брюшная стенка показана открытой для диафрагмы. ( C ) После отвода oКишечника, аорта брюшной полости (стрелка) идентифицирована и разрезана. ( D ) Диафрагма и боковые стороны грудной клетки разрезаются, чтобы обнажить грудную полость. ( E ) Легкое перфузируется через правый желудочек сердца, пока легкие полностью не станут белыми ( F ). ( G ) Выявленная трахея идентифицируется с последующим введением формалина ( H ) в трахею до тех пор, пока легкие не увеличатся ( I ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1 : Первичный рост опухоли на хирургическом участке. Представитель H & E (сверху) и грубые (нижние) образы оставшихся правых 4- й и 5- й молочных желез после операции, показывая отсутствие tuМорфологический рост с паховым лимфатическим узлом ( AB ) и молочной железой с первичной опухолью роста ( CE ). Нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модификации и устранение неполадок:
Когда тупой рассекающий опухоль удаляется от брюшной стенки, опухоль может оставаться прикрепленной к брюшной стенке. Это наблюдалось у <5% мышей, которым вводили опухоль (данные не показаны). Для мышей с опухолями, прилипшими к брюшной стенке, мышь должна быть подвергнута эвтаназии, поскольку резекция затруднена без первичного роста опухоли.
Ограничения модели / техники:
В то время как другие исследователи сообщали о наличии флуоресцентно меченных единичных метастатических клеток, распределенных в печени, почках, селезенке и головном мозге, в дополнение к легким, после реимплантации почек конечного конца молочной железы, полученных из мышей MMTV-PyMT 7 , кроме легких, мы наблюдали несколько Мышей с метастатическими очагами в печени, проницаемость которых еще не определена. Другие сайты потенциальной метастатической нагрузки, такие как лимфатический узелС, селезенка, кость и мозг, не оценивались. Ограничение этой методики также включало послеоперационные эксорции и инфекцию кожи при бритье хирургического участка. Из-за этого стерильность хирургического сайта ограничивалась применением 70% этанола, за которым следовал Poly (винилпирролидон) -йодин.
Критические шаги в протоколе:
Глубокое рассечение опухоли от брюшной стенки является критическим этапом (шаг 3.7), где необходимо избегать сосудов в молочной железе. Шаги 3.8 и 3.9 также являются критическими шагами, где существует наибольший риск неконтролируемого кровотечения. Неаутеризированные проксимальные и дистальные части сосуда должны быть идентифицированы после прижигания, чтобы легко визуализировать источники кровотечения.
Значение в отношении существующих методов:
Модели мышц рака человека, имитирующие стадии заболеванияПрогрессирование, кинетика и гистопатология предоставляют неоценимые инструменты, позволяющие идентифицировать и оценивать новые цели для терапии, а также потенциальную эффективность новых терапевтических агентов, нацеленных на эти молекулы / пути. Хотя хвостовая вена и / или сердечная инъекция установленных линий раковых клеток часто используются в качестве экспериментальных моделей метастазов, они не могут повторить критические шаги в метастатическом процессе и вместо этого отражают анализы колонизации эктопических органов, в которых можно оценить аспекты выживаемости опухолевых клеток 8 . Более того, в то время как некоторые существующие модели трансгенных мышей для развития рака канцерогенеза de novo действительно предоставляют модельные системы, позволяющие изучать стадии, участвующие в метастазировании, значительная первичная опухоль обычно ограничивает продолжительность исследования. Таким образом, группы инъецировали культивированные неопластические клетки, полученные из первичных опухолей MMTV-PyMT, чтобы обеспечить хирургическую резекцию 9 . Наш метод расширяется из этих методов, поскольку dOes не выбирают для неопластических клеточных линий, выращенных из опухолей in vitro, и непосредственно вводят полную гетерогенную первичную опухоль мышам-реципиентам. Кроме того, длительная латентность образования метастазов легких в нашей модели позволяет улучшить терапевтическое окно для различных исследований лечения.
Будущие приложения:
Что касается оценки эффективности терапии в этих моделях, поскольку первичные опухоли обычно развиваются во всех молочных железах, хирургическая резекция всех первичных опухолей и адъювантная оценка методов лечения, направленных на минимизацию роста метастатических колоний, невозможны. Из-за этих проблем мы разработали автохтонную модель метастатического распространения, в которой метастатическое распространение опухолевых клеток происходит de novo , и после хирургической резекции первичной опухоли установлен расширенный латентный период, который позволяет идентифицировать метастазы в легких. Таким образом, эта модельОтражает метастаз рака молочной железы человека и дает уникальную систему для оценки эффективности применяемых адъювантов терапии для воздействия на регулирование безрецидивной выживаемости и / или общей выживаемости с определенными конечными точками в соответствии с руководящими принципами IACUC.
Поскольку значительная часть женщин с раком молочной железы лечится хирургической резекцией первичных опухолей 10 , а те, которые прогрессируют впоследствии, развивают дистальный метастаз, это означает, что распространение и посев произошли до хирургической резекции. Микроэлементы дистального органа обеспечивают уникальные ниши для выживших и / или пролиферирующих метастатических клеток 11 . Таким образом, крайне важно, чтобы модельные системы имитировали эти грани так, что молекулы и пути, действующие на вторичных сайтах, которые, вероятно, отличаются от первичных опухолей, могут быть идентифицированы, изучены и методы лечения, нацеленные на их точность оценки эффективности. Модель, разработанная здесь, обеспечивает эти аспекты для изучения,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не раскрывают информацию о конфликте с данными, представленными здесь.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Джо Хилу за помощь в гистопатологии, д-р Джон Глейстин за обучение в хирургической технике, Тесса Дибел за помощь в видеографии, все члены лабораторий Вонг и Куссенс за критическую проницательность и дискуссии и Институт рака им. OHSU для финансовой поддержки. Авторы признают поддержку от T32GM071388-10 и T32CA106195-11 до КЭГ, NCI / NIH, Программы исследований рака молочной железы Министерства обороны, Фонда Сьюзан Г. Комен, Фонда исследований рака молочной железы и Фонда «Встать в рак - Люстгартен» Рак поджелудочной железы. Сонная трансплантация. Трансформационный исследовательский грант (SU2C-AACR-DT14-14) в LMC, награду Фонда здоровья женщин за предоставление MHW и центр здоровья поджелудочной железы Брендена-Колсона для MHW и LMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
References
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. Howlader, N. N. A., Krapcho, M. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. based on November 2010 SEER data submission, posted to the SEER web site. http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/ (2011).
- National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer (Version 3.2014). , Accessed November 25. http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2016).
- Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).
- Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., et al. Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine. Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R., et al. , 6th, BC Decker. Hamilton (ON). (2003).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
- Kouros-Mehr, H., et al. GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model. Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Qian, B. Z., et al. FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis. J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).
- Verkooijen, H. M., et al. Patients' refusal of surgery strongly impairs cancer survival. Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis. Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
