Summary
Mancano modelli pre-clinici che valutano la terapia adiuvante che mirano alla metastasi del cancro al seno. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un modello murino di metastasi adenocarcinomi mammarie polmonari de novo , in cui le terapie somministrate nell'ambiente adiuvante (resezione chirurgica postale dei tumori primari) possono essere valutate per efficacia nell'effetto delle metastasi polmonari precedentemente seminate.
Introduction
Le donne dell'America settentrionale hanno un rischio di vita pari al ~ 12% per lo sviluppo del cancro al seno 2 ; La maggioranza di questi individui avrà i tumori primari rimossi tramite chirurgia e, a seconda del sottotipo del cancro, riceverà terapia mirata, endocrina, chemioterapia e / o radioterapia nell'ambiente adiuvante 3 . Esempi includono, donne con diagnosi di cancro ormonale recettore-positivo che ricevono terapie anti-estrogeno e donne con tumori HER2-positivi che ricevono terapie con targeting HER2 con radiazioni / chemioterapia, mentre non sono disponibili terapie mirate per tumori negativi triplici 3 . Nonostante i progressi in radiazioni, chemioterapia, terapie personalizzate e ormonali che integrano la resezione chirurgica, la malattia si ripete nel 30-70% delle donne diagnosticate con la malattia di stadio II o III 4 , poiché le terapie sono in gran parte inefficaci nell'eradicazione della malattia metastatica negli organi distanti, Polmone, osso, bPioggia e / o fegato 5 . Ciò è particolarmente significativo in quanto quando si verifica una malattia metastatica in assenza di ricrescita tumorale primaria, ciò implica che le cellule maligne disseminate erano già probabilmente presenti negli organi secondari al momento della chirurgia definitiva. Quindi terapie in grado di sradicare o lenta crescita dei tumori metastatici sono urgentemente necessari.
Mentre i modelli de novo di cancro della carcinogenesi mammaria sono stati notevolmente informativi nei meccanismi rivelatori che regolano la progressione neoplastica 1 , i modelli esistenti hanno anche diverse limitazioni. Uno di questi è il fatto che i modelli de novo transgenici sviluppano tipicamente tumori primari in molteplici ghiandole mammarie, in cui il carico tumorale primario limita la durata degli studi. Mentre la fuga di cellule tumorali primarie e la semina metastatica probabilmente si verificano all'inizio della progressione neoplastica in questi modelli, il sincero sviluppo di tumori metastatici si verifica in ritardo eN il modello del mouse e lo sfondo del ceppo, è spesso parzialmente penetrante 1 . Ciò limita ulteriormente l'utilità dei modelli de novo per la scoperta di molecole che regolano la metastasi negli organi secondari e per la valutazione dell'efficacia preclinica dei terapeutici nell'ambiente adiuvante.
Per eludere queste limitazioni, abbiamo sviluppato un modello de novo autochthonous di metastasi del carcinoma mammario ai polmoni. Le femmine transgeniche parentali ( ovvero MMTV-PyMT sullo sfondo del ceppo FVB / n per gli studi qui descritti) che portano tumori mammari di tarda fase de novo sono invecchiati a ~ 100 giorni 6 , a quel punto i loro tumori primari sono resettati chirurgicamente e dissociati enzimaticamente in Sospensioni singole cellule. Le sospensioni (1 x 10 6 cellule) sono a loro volta esplorate ortotropicamente in topi femmine singenici riceventi di 6-7 settimane, dove tumori mammari primari singoli si sviluppano in un periodo di 38-60 giorni ( 3), topi riceventi sono anestetizzati e tumori primari sono chirurgicamente resecati tale che la ricrescita del tumore al sito chirurgico è minimizzato, coerente con la chirurgia nelle donne (figura complementare 1). Sullo sfondo del ceppo FVB / n, i topi sviluppano foci metastatiche rilevabili istologicamente nei polmoni con 45% di penetranza per ~ 115 giorni dopo la chirurgia ( Figura 1B ). Con questa lunga latenza di crescita tumorale metastatica, il modello è posizionato in modo univoco per la consegna di terapie adiuvante e per chiarire e valutare la biologia sottostante che influenza la progressione metastatica dopo la rimozione chirurgica dei tumori primari.
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Protocol
Gli animali utilizzati nel protocollo seguente sono coperti dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Oregon Health & Science, che è stato progettato per essere conforme alle normative vigenti in materia di benessere degli animali e della politica sanitaria pubblica (PHS).
Manutenzione delle condizioni sterili: devono essere utilizzati strumenti sterilizzati e tra i topi devono essere puliti con garza sterile, sciacquati in PBS e sterilizzati con disinfettante al 70% di etanolo per almeno 15 minuti. È necessario indossare un cappello chirurgico, una maschera facciale, un abito e guanti per gli interventi di sopravvivenza. La preparazione pre-operativa dell'animale per interventi di sopravvivenza è inclusa nel seguente protocollo. Fare riferimento alla tabella 1 per un elenco di reagenti e attrezzature.
1. Isolamento e preparazione di sospensioni di cellule singole da tumori primari del mammario
- Anestetizzare i topi transgenici MMTV-PyMT (FVB / n) femmina donatrice di 100 giorni e mantenere sotto cOntinuosa sedazione somministrando 2% di isoflurano attraverso una maschera di anestesia. Confermare che il mouse sia correttamente anestetizzato con un riflesso a pinza assente.
- In un ambiente sterile, i respirazione di tumori mammari primari da topi femmina transgenici MMTV-PyMT (FVB / n) di 100 giorni, separando il tumore mammario dalla pelle sovrapposta e dai tessuti adiposi circostanti e / o dai linfonodi usando forbici sterili. Eutanizzare i topi anestetizzati per dislocazione cervicale.
- Con forbici sterili o un bisturi, sminuzzare tumori primari manualmente in piccoli pezzi (~ 1,0 millimetri 3). Posizionare i tumori in 3,0 mg / mL collagenasi A e 4,0 U / mL DNasi I sciolti in DMEM. Utilizzare ~ 10 mL del suddetto mezzo di digestione per un tumore di diametro di 1,0 cm.
- Effettuare la digestione in una bottiglia sterile da 25 ml con una barra di stirata sterile a ~ 125 giri / min e 37 ° C per 40 min.
- Fermare la digestione aggiungendo il siero fetale fetale (FBS) ad una diluizione finale del 10% e collocare l'intera miscela su wDove si mantiene.
- Filtrare la sospensione tumorale digerita attraverso un filtro in nylon da 0,7 μm in un tubo conico da 50 ml e scartare qualsiasi tumore rimasto nel filtro. Centrifugare il surnatante a 300 xg a 4 ° C.
- Resuspendere il pellet in 10 mL di DMEM per 1,0 cm di tumore e ri-filtrare attraverso un filtro in nylon da 0,7 μm. Conta concentrazione delle cellule, quindi centrifugare a 300 xg a 4 ° C.
- Resuspendere il pellet nel 10% dimetilsolfossido con il 90% di FBS ad una concentrazione di 2 x 10 7 cellule vive / mL. Conservare le sospensioni a cellule singole di intero tumore primario a -80 ° C.
2. Iniezione ortotopica del tumore mammario
- Parzialmente scongelare le sospensioni tumorali primarie congelate a 37 ° C fino a quando il pellet congelato può essere rilasciato dal tubo criogenico in 20 mL di DMEM e contare le cellule. Centrifugare a 300 xg a 4 ° C e risospendere le cellule in 1: 1 DMEM: preparazione solubilizzata di membrana basale a fattore di crescita ridottaEstratto dal sarcoma del mouse di Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ad una concentrazione di 1 x 10 7 cellule / ml (vedi tabella dei materiali ).
- Mettere il lato ventrale femminile sinergico del ricevente anestetizzato e mantenere in sedazione continua somministrando 2% di isoflurano tramite una maschera di anestesia.
- Sterilizzare il 4 ° sito di iniezione della ghiandola mammaria usando etanolo al 70% aerosolizzato e applicando Poly (vinilpirrolidone) -Iodina con un tampone sterile in cotone.
- Iniettare 100 μL (1 x 10 6 cellule vive dalle sospensioni tumorali primarie congelate) in senso inverso verso l'alto fino alla 4a ghiandola mammaria destra del 6- 10 settimane FVB / n femminile utilizzando una siringa da 29 g 0,3 ml di insulina.
3. Resezione chirurgica del tumore ortotopico del mammario
- 38-60 giorni dopo l'iniezione delle cellule tumorali, eutanizzano i topi che non presentavano volumi tumorali ortotopici che vanno da 172 a 450 mm 3 in volume [lunghezza x (larghezza 2
- Posizionare i topi anestetizzati visualizzando il lato ventrale appropriato del tumore fino alla sedazione continua somministrando 2% di isoflurano tramite una maschera di anestesia e confermare che il mouse è correttamente anestetizzato con un riflesso a pinza assente. Applicare unguento veterinario agli occhi per prevenire la secchezza durante la sedazione.
- Spruzzare il 70% di etanolo per sterilizzare l'area chirurgica che circonda il tumore primario, quindi applicare Poly (vinilpirrolidone) -Iodina con un tampone sterile di cotone.
NOTA: La rimozione dei capelli presso il sito chirurgico ha provocato estrazioni cutanee e / o infezioni per topi del ~ 5% e fu pertanto escluso da questo passaggio (dati non mostrati). - Come mostrato in Figura 1C , effettuare un'incisione iniziale della pelle usando forbici sbarrate medial-caudali al tumore.
- Successivamente, fare un'escissione superiore della pelle ( Figura 1C ) mediale al tumore. Prestate attenzione alla necessità di cauterizzare qualsiasi vascolarizzazioneIl tumore posto sulla pelle prima di estendere l'incisione.
- Continuare l'incisione della pelle lateralmente (posteriormente al tumore), quindi fare un'escisione superiore della pelle (laterale al tumore) e l'escissione mediale (superiore al tumore) ( Figura 1C ).
- Dopo che la pelle è stata tagliata circonferenzialmente intorno al tumore ( Figura 1C ), sollevare la pelle sovrapposta attaccata al tumore utilizzando le pinze, mentre sbucchiando il tumore lontano dalla muscolatura della parete addominale e mantenendo intatte le ghiandole mammarie.
- Identificare (per via smussa) e cauterizzare grandi vasi che attraversano i 4 ° e 5 ° ghiandola mammaria.
- Excise circa la metà dei 4 ° e 5 ° ghiandole mammarie nel sito cauterizzazione per liberare il tumore, pelle sovrastante, e segmenti delle ghiandole mammarie (Figura 1C).
- In caso di sanguinamento, identificare attivamente il sanguinamentoImbarcazioni e immediatamente cauterizzarle. Se si perde più di 250 μL di sangue, escludere il topo da studi e eutanizzarlo.
- Chiudere i siti di escissione con le clip della ferita utilizzando un applicatore a clip ferito ( Figura 1C ).
NOTA: Rimuovere le clip della ferita 10 giorni dopo l'intervento chirurgico con un rimontaggio della ferita. - Amministrare salina sterile calda subcutanea (4% del peso corporeo dell'animale) e mantenere l'animale caldo con una lampada di calore. Controllare gli animali ogni 5-10 minuti durante il recupero dall'anestesia.
NOTA: L'amministrazione di bupivacaina o lidocaina ha aumentato la mortalità post-operatoria (dati non mostrati). I topi che mostravano segni di dolore (colpi, mancanza di spostamento, mancanza di sposo) sono stati eutanizzati 1 h dopo la chirurgia.- Una volta che il mouse è completamente recuperato, restituirlo alla compagnia di altri topi.
4. Isolamento e trattamento di sangue e polmone per la citometria e l'istologia di flusso
<ol>NOTA: Le scorte congelate di bromodeossiridina sciolte vengono utilizzate entro un mese dalla preparazione.
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Representative Results
Più del 75% dei topi riceventi che ricevono 1 x 10 6 cellule da tumori mammari primari derivati da topi MMTV-PyMT, sviluppano singoli adenocarcinomi mammari che vanno da 172 a 450 mm 3 entro 38-60 giorni (dati non mostrati). I topi ammessi alla randomizzazione sono quindi iscritti in gruppi di studio dopo la resezione chirurgica dei tumori primari come mostrato ( Figura 1C ). La ricrescita tumorale primaria è stata identificata in meno del 2% dei topi sottoposti a resezione chirurgica del tumore primario ( Figura 1 supplementare ). Il 45% dei topi riceventi valutati con questo protocollo sviluppa foci metastatiche rilevabili istologicamente entro il giorno 115 la resezione post-tumorale ( Figura 1B ). Per affermare l'istologia delle metastasi in aree identificate contenenti cellule metastatiche mediante la colorazione di H & E, le sezioni dei tessuti adiacenti sono state valutate da PyMT PCR (dati nonmostrato).
Figura 1 : Resezione post-chirurgica dei tumori primari e sviluppo di metastasi polmonari de novo . ( A ) Schema sperimentale del modello di metastasi adenocarcinoma mammaria murina. † significa che tutti i topi sono stati perfezionati cardiaci ed iniettati con BrdU il giorno dell'eutanasia. ( B ) Rappresentante H & E dove è stata valutata la rilevazione di focolai metastatici mediante sequenza seriale del tessuto polmonare FFPE con lobi separati. Foci metastatiche (> 5 cellule) sono state determinate con H & E colorazione ogni 100 μm che riflette 1300 μm di tessuto. Sono stati analizzati polmoni da 11 topi. ( C ) Schema di resezione chirurgica del tumore primario mammario. I numeri rossi e le frecce indicano l'ordine e la direzione delle incisioni della pelleConfinante con il tumore primario (a sinistra). Il giusto 4 ° e 5 ° ghiandole mammarie con grandi vasi sono mostrati attaccato al tumore primario (mezzo) seguito dalla chiusura della ferita con clip ferita (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Isolamento, perfusione e fissazione del polmone. L'immagine (a sinistra) e il fumetto corrispondente (a destra) sono mostrati di isolamento polmonare, perfusione e fissazione. (A) Un incisione mediana è mostrata con immagine inserto visualizzazione di pelle ritratta esponendo l'esimo destra 4 e 5 ° ghiandole mammarie (freccia). ( B ) La parete addominale è mostrata aperta al diaframma. ( C ) Dopo la retrazione oF intestinale, l'aorta addominale (punta di freccia) è identificata e tagliata aperta. ( D ) I diaframmi ei lati laterali della gabbia sono stati tagliati per esporre la cavità toracica. ( E ) Il polmone viene perfuso attraverso il ventricolo destro del cuore fino a quando i polmoni sono completamente bianchi ( F ). ( G ) La trachea esposta viene identificata seguita da iniettare formalina ( H ) nella trachea fino a quando i polmoni sono espansi ( I ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare Figura 1 : Ricrescita tumorale primaria nel sito chirurgico. Rappresentante H & E (in alto) e (in basso) immagini lordi del restante right 4 ° e 5 ° ghiandola mammaria post-operatorio, che mostra assenza di tuRicrescita morale con linfonodo inguinale ( AB ) e ghiandola mammaria con ricrescita tumorale primaria ( CE ). Clicca qui per scaricare questa figura.
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Discussion
Modifiche e risoluzione dei problemi:
Quando il tumore sbarrato dissezione dalla parete addominale, il tumore può rimanere aderente alla parete addominale. Questo è stato osservato in <5% di topi iniettati con tumore (dati non mostrati). Per i topi con tumori aderenti alla parete addominale, il topo deve essere eutanizzato in quanto la resezione è difficile senza ricrescita del tumore primario.
Limitazioni del modello / tecnica:
Mentre altri ricercatori hanno segnalato la presenza di cellule singole metastatiche a fluorescenza diffuse a fegato, rene, milza e cervello, oltre al polmone, a seguito di reimpianto di mammiferi terminali terminali derivanti da topi MMTV-PyMT 7 , a parte il polmone, abbiamo osservato diversi Topi con foci metastatiche nel fegato, la cui penetranza deve ancora essere determinata. Altri siti di potenziale carico metastatico, come il linfonodoS, la milza, l'osso e il cervello, non sono stati valutati. Una limitazione di questa tecnica comprendeva anche le estrazioni post-operatoria e l'infezione della pelle durante la rasatura del sito chirurgico. A causa di questo, la sterilità del sito chirurgico è stata limitata all'applicazione del 70% di etanolo seguito da Poly (vinilpirrolidone) -Iodina.
Fasi critiche all'interno del protocollo:
La dissezione sbarrata del tumore lontano dalla parete addominale è un passo critico (punto 3.7) in cui è necessario eseguire l'evasione dei vasi all'interno della ghiandola mammaria. Le fasi 3.8 e 3.9 sono anche punti critici dove esiste il maggior rischio di sanguinamento incontrollato. Le porzioni proximal e distali non cauterate del vaso dovrebbero essere identificate dopo cauterizzazione per visualizzare facilmente fonti di sanguinamento.
Significato rispetto ai metodi esistenti:
Mouse modelli di cancro umano che imitano stadi di malattiaLa progressione, la cinetica e l'istopatologia forniscono strumenti preziosi per individuare e valutare nuovi obiettivi per la terapia, nonché la potenziale efficacia di nuovi agenti terapeutici che mirano a queste molecole / percorsi. Mentre l'iniezione coda e / o cardiaca di linee di cellule tumorali stabilite vengono spesso utilizzate come modelli sperimentali di metastasi, questi non riescono a ricapitolare passi critici nel processo metastatico e riflettono invece i dosaggi di colonizzazione degli organi ectopici dove possono essere valutati aspetti della sopravvivenza delle cellule tumorali 8 . Inoltre, mentre alcuni modelli esistenti di topi transgenici del de novo sviluppo della carcinogenesi mammaria forniscono sistemi di modello che permettono lo studio di passi coinvolti nella metastasi, un notevole peso tumorale primario limita tipicamente la durata dello studio. Così i gruppi hanno iniettato cellule neoplastiche coltivate derivate da tumori primari MMTV-PyMT per consentire la resezione chirurgica 9 . Il nostro metodo si espande da queste tecniche dNon è selezionato per linee cellulari neoplastiche coltivate da tumori in vitro e introduce direttamente il tumore primario completo eterogeneo ai topi riceventi. Inoltre, la lunga latenza della formazione di metastasi polmonari nel nostro modello consente una migliore finestra terapeutica per vari studi di trattamento.
Applicazioni future:
Per quanto riguarda la valutazione dell'efficacia delle terapie in questi modelli, poiché i tumori primari sviluppano tipicamente in tutte le ghiandole mammarie, non è possibile la resezione chirurgica di tutti i tumori primari e la valutazione adiuvante delle terapie volte a ridurre al minimo la crescita delle colonie metastatiche. A causa di questi problemi abbiamo sviluppato un modello autoctono di disseminazione metastatica in cui si verifica de novo la disseminazione metastatica delle cellule tumorali e dopo la resezione chirurgica del tumore primario viene stabilito un periodo di latenza esteso che consente l'identificazione delle metastasi nel polmone. Così, questo modelloRiflette la metastasi umana del cancro al seno e fornisce un sistema unico per valutare l'efficacia delle terapie fornite da adiuvanti per l'impatto sulla regolazione della sopravvivenza libera da malattie e / o della sopravvivenza globale con endpoint definiti per linee IACUC.
Poiché una gran parte delle donne affette da cancro al seno viene trattata mediante resezione chirurgica dei tumori primari 10 e quelli che progressivamente sviluppano metastasi distali, ciò implica che la disseminazione e la semina siano avvenuti prima della resezione chirurgica. I microambienti distali dell'organo forniscono nicchie uniche per sopravvivere e / o proliferare le cellule metastatiche 11 . Pertanto, è indispensabile che i sistemi di modelli imitino queste sfaccettature in modo tale che le molecole ei percorsi operativi nei siti secondari, che siano probabilmente distinti dai tumori primari, possano essere identificati, studiati e le terapie che li puntano a valutare accuratamente l'efficacia. Il modello sviluppato nel presente documento fornisce questi aspetti per lo studio.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcuna dichiarazione di conflitto con i dati presentati.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Jo Hill per l'assistenza istopatologica, il Dr. John Gleysteen per l'istruzione in tecnica chirurgica, Tessa Diebel per l'assistenza video, tutti i membri dei laboratori Wong e Coussens per una visione e discussioni critiche e l'OHSU Knight Cancer Institute per il sostegno finanziario. Gli autori riconoscono il supporto di T32GM071388-10 e T32CA106195-11 a CEG, il NCI / NIH, il Dipartimento della Difesa, il programma per la ricerca sul seno del seno, la Fondazione Susan G Komen, la Fondazione per la Ricerca sul Cancro del seno e una Fondazione per il Cancro - Lustgarten (SU2C-AACR-DT14-14) a LMC, un premio alla Fondazione per la Salute delle Donne di Salute a MHW e al Centro Brenden-Colson per la Salute Pancreatica a MHW e LMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
References
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