Summary
פרוטוקול זה משתמש בשני Coexpression למקטע ו למקטע postlysis ערבוב לבדיקה יסודית יותר של הרכבת הפרוטאזום רקומביננטי.
Abstract
הפרוטאזומים נמצאים בכל תחומי החיים. הם מספקים את המסלול העיקרי של פירוק חלבונים תאיים אאוקריוטים, אם כי הרכבה שלהם אינה מובנת לחלוטין. כל פרוטאזומים מכילים חלקיק הליבה נשמרת מבנית (CP), או הפרוטאזום 20S, המכיל שתי טבעות למקטע β heptameric דחוקה בין שתי טבעות למקטע α heptameric. פרוטאזומים 20S Archaeal פשוטים לעומת בעלי הרכב לעמיתיהם איקריוטיים שלהם, בעודם חולקים מנגנון הרכבה משותף. כתוצאה מכך, פרוטאזומים 20S archaeal להמשיך להיות מודל חשוב להרכבת הפרוטאזום איקריוטיים. באופן ספציפי, ביטוי רקומביננטי של פרוטאזומים 20S archaeal בשילוב עם ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide nondenaturing (עמוד) הניב תובנות חשובות רבות לתוך biogenesis הפרוטאזום. כאן, אנו דנים אמצעי לשפר את האסטרטגיה הרגילה של Coexpression של α הפרוטאזום archaeal ובטא יחידות משנה לפני nondenaturing עמוד. אנו מראים כי למרות מהירים ויעילים, גישת Coexpression לבדו יכולה לפספס ביניים הרכבת מפתח. במקרה של הפרוטאזום, Coexpression לא יכול לאפשר זיהוי של-הפרוטאזום וחצי, טבעת-α מלאה המכילה ביניים אחת β-טבעת אחד שלם. עם זאת, ביניים זו מזוהה בקלות באמצעות ערבוב lysate. אנו מציעים שילוב Coexpression עם ערבוב lysate מניב גישה יותר יסודית בניתוח הרכבה, עדיין נותר העבודה nonintensive. גישה זו עשויה להיות שימושית לחקר מתחמי multiprotein רקומביננטי אחרים.
Introduction
מתחמי multiprotein לבצע פעילות הסלולר קריטית רבה 1. עבור רבי קומפלקסים אלה, הרבה יותר ידוע על המבנה שלהם ותפקוד מאשר על ההרכבה שלהם 2,3. הפרוטאזום הוא מורכב אחד כזה והוא נמצא בכל תחומי החיים. אאוקריוטים, מכונה מולקולרית זה הוא הליבה של המערכת הפרוטסומית / יוביקוויטין (UPS) ומספק את המסלול העיקרי של פירוק חלבונים תאיים 4. הפרוטאזום איקריוטיים (המכונה הפרוטאזום 26s) מורכב משני מכלולים תת מרכזיים: א הפרוטאזום 20S, או חלקיקי Core (CP) 5, שניתן כתרים על קצוות אחד או שניהם על ידי חלקיק 19S תקין (RP) 6.
הפרוטאזום 20S הוא פרוטאז מידור גדול. המבנה הרביעון שלה נשמר לחלוטין בכל תחומי חיים והוא מורכב ערימה של ארבע טבעות שבע membered המכיל שני סוגים של יחידות משנה הקשורות מבני, α; ובטא 5,7,8. אאוקריוטים, שתי הטבעות החיצוניות כל מונה שבע יחידות משנת α ברורות ואת שתי הטבעות פנימיות כל מונה שבע יחידות משנת β ברורות; פעילות פרוטאוליטים מתגוררת בתוך שלוש של יחידות מהשנה β. לעומת זאת, טבעות CP של קדומים וחיידקים הן בדרך כלל מורכבות רק סוג אחד של α וסוג אחד של למקטע β. פרוטאזומים Archaeal סיפקו מערכת מודל חשוב ללמוד הרכבה הפרוטאזום הן בשל פשטות ההלחנה שלהם ושיתוף שלהם מנגנון הרכבה משותף עם עמיתיהם איקריוטיים שלהם 9-13. בקיצור, יחידות משנה α להרכיב לטבעות α ראשונה, אשר לשמש פיגום שעליו בטא יחידות משנה להרכיב. וכתוצאה מכך חצי פרוטאזומים (α 7 β 7) dimerize, והוליד התאספו מלא CP (α 7 β 7 β 7 α 7). במהלך dimerization, את propeptides להציג על יחידות משנה בטאיוסרו autocatalytically, חשיפת threonines N-terminal קטליטי. השימוש פרוטאזומים archaeal מודל הרכבה לעתים קרובות מנצל את הייצור של חלבונים הפרוטאזום archaeal רקומביננטי coli Escherichia. זוהי גישה כדאית משום שהוא מאפשר יחידות משנה להיות מיוצר בצירופים שונים, כמו גם WT וגרסאות מוטציה, בתוך הפונדקאי כי אינו מייצר פרוטאזומים משלה.
ניטור ההרכבה של קומפלקסי חלבונים רבים ביוכימית דורש סוג כלשהו של שיטת חלוקת המפריד מתחמים מורכבים במלואו מן ביניים ומבשרי הרכבה. בשל יכולת בפתרון מעולה, nondenaturing polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) הוכיח להיות שימושי במיוחד החלוקה של מתחמי multiprotein גדולים השונים 14-17. השילוב של ייצור הפרוטאזום archaeal רקומביננטי עמוד nondenaturing הפכה גישה חזקה ב dissectinהפרוטאזום גרם הרכבת 9,11,12,18. עם זאת, השיטה הרגילה על ידי איזו גישה זו מיושמת (כלומר. דרך Coexpression רקומביננטי של יחידות משנת α ו β) יש חסרון חשוב. תגובות עצרת מאורגנות על בסיס שיתופיות וריכוז-תלוי מאוד 3. בהתחשב בכך את ריכוז החלבון בתוך התאים הוא גבוה מאוד 19, בשל תופעות נפח נשלל, תגובות הרכבה להמשיך במהירות in vivo. מכאן אפשר לפספס ביניים הרכבה חשובים כאשר יחידות משנת α ו β הן coexpressed.
כאן, אנו טוענים בגישה המשולבת במחקר של הרכבה הפרוטאזום באמצעות יחידות משנה הפרוטאזום archaeal רקומביננטי. לפי גישה זו, הן שיטות ערבוב Coexpression ו lysate מועסקים. הראשון מאפשר ניתוח מהיר של הרכבה כי Coexpression הוא פחות עבודה אינטנסיבית. זה האחרון תלוי ביטוי נפרד של תת-יחידות α ו β, ואחריו ערבוב. למרות requi זהמיל קצת יותר מאמץ מאשר Coexpression, זה בהחלט פיצו על ידי היכולת לזהות ביניים כי הם הפסידו במהלך Coexpression. יחד, שתי שיטות יכולות לספק תמונה שלמה יותר של הרכבה הפרוטאזום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ביטוי חיידקית.
הערה: פלסמידים הביטוי השתמשו במחקר זה מתוארים בטבלה 1. פתרונות, תקשורת, או מאגר השתמשו במחקר זה מתוארים בטבלה 2. שיבוט של גנים למקטע הפרוטאזום archaeal והדור של פלסמידים ביטוי מתוארים במקומות אחרים 18,20. בקיצור, פלסמידים עבור Coexpression רקומביננטי של יחידות משנה להעסיק אסטרטגיה אופרון bicistronic שעוזר בהשגת רמות ביטוי דומה של יחידות משנה הפרט 18,20. פרמטרי הביטוי המפורטים להלן היו לקבוע באופן אמפירי להיות אופטימלי עבור היחידות מהשנה הפרוטאזום במחקר זה. זה עשוי להיות נחוץ כדי לייעל ביטוי מוטציות הפרוטאזום אחרים, עבור פרוטאזומים ממיני archaeal אחרים, או עבור קומפלקסי חלבונים רקומביננטיים אחרים (ראה דיון).
- Transform הביטוי פלסמיד עניין לתוך BL21 E.coli המוסמכות כימית (DE3) תאים.
- להוסיף 1 - 2 μL של פלסמיד (בדרך כלל 50 - 100 ng) כדי aliquot של תאים DE3 שהיו מופשר טרי על הקרח, ולהמשיך לדגור על קרח למשך 20 דקות.
- הלם חום התאים ב 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות ולחזור צינור קרח דק 2 additionl.
- הוסף 1 מ"ל של מדיום LB ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (150 סל"ד) במשך שעה 1.
- מורחים 100 - 200 μL של תערובת הטרנספורמציה לצלחות LB-kan (צלחות המכילות מדיה LB מוצק, בתוספת kanamycin (כל פלסמידים המשמשים התנגדות לקודד את המחקר הזה כדי אנטיביוטי זה)). דגירה צלחות ב 37 ºC O / N.
- למחרת בבוקר, לחסן מושבה אחת מהצלחת LB-kan לתוך 3 מ"ל של התקשורת LB-kan נוזל בתוך שפופרת זכוכית תרבות. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (150 סל"ד) במשך 2.5 כ - הוא ציין 3 שעות, או עד עכירות.
- מדוד את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD 600) ב ספקטרופוטומטר. לדלל את פולחן התאיור עם כמות מתאימה של התקשורת LB-kan prewarmed ל OD 600 של 0.4 בנפח סופי של 6 מ"ל. קורות חיים רועד ב 37 ºC במשך 40 דקות.
- להשרות ביטוי חלבון התרבויות הנוזלות על ידי הוספת IPTG מפתרון מניות לריכוז סופי של 1 מ"מ. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (150 סל"ד) במשך 6 כ - 7 שעות.
- קציר תרבויות תא החיידק בשלמותן לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge.
- הוסף 1.5 מ"ל של תרבות לתוך צינור microcentrifuge. צנטריפוגה ב g 10,000 × 1 דקות.
- בטל supernatant ולהוסיף 1.5 מיליליטר של אותה התרבות של הגלולה. צנטריפוגה ב g 10,000 × 1 דקות.
- חזור על שלב 1.11 עד שהתרבות כולה נאסף לתוך צינור microcentrifuge.
- אחסן את כדורי המושרה ב -80 ° C עד תמוגה.
2. בקטריאלי תמוגה Lysate ערבוב.
הערה: (כלומר היא מאמתת החלבון בא לידי ביטוי ומסיס). לפיכך, אנו ממליצים בחום כולל ניתוח TSP בתחילה. לאחר פרוטוקול אופטימלי הושג עבור שילוב למקטע מסוים, ניתוח TSP אינו נדרש הקפדה ולכן היא מתוארת אופציונלית להלן.
- תמוגה של תאים חיידקיים והכנת שברים מסיסים.
- להפשיר את התא גלול המושרה על קרח למשך 5 דקות. Resuspend גלולה ב 600 μL של חיץ תמוגה.
- Incאובאטה ההשעיה 30 ºC עם רועד (150 סל"ד) למשך 30 דקות כדי ליצור lysate גולמי בסך הכל.
הערה: השלב הבא ואת הקטן העוקב הם אופציונליים. - הסר שני 25 aliquots μL מן lysate הכולל גולמי 1.5 מ"ל microcentrifuge צינורות נפרדים ולבצע ניתוח TSP כדלקמן.
- לאחד aliquots שני 25 μL, להוסיף למאגר מדגם 5X SDS לריכוז סופי של 1X. לייבל הצינור עם "T" עבור "lysate הגולמי הכולל".
- דגירה מדגם "T" ב -100 ºC למשך 5 דקות כדי לפגל חלבונים לחלוטין.
- בינתיים, לקחת את aliquot השני 25 μL צנטריפוגות אותו ב 10,000 g × במשך 10 דקות. מוציאים בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה זעירה, ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש. לייבל צינור חדש זה "S" עבור "חלק מסיס".
- כדי גלולה זעירה behi עזבnd בשלב הקודם, להוסיף 25 μL של חיץ תמוגה מערבולת כדי resuspend. לייבל הצינור הזה "P" עבור "חלק גלול".
- הוסף 6 μL של 5X SDS מדגם חיץ הצינורות "S" ו- "P" לדגור על 100 ºC כמתואר לעיל.
הערה: אם דגימות TSP לא תשמשנה באותו היום לנתח ביטוי, הם עשויים להיות קפוא ב -20 ºC עד צורך. לאחר מופשר, הם חייבים להיות reincubated ב -100 ºC, כמתואר לעיל, מיד לפני טעינת על 12% ו / או 15% ג'ל SDS-PAGE סטנדרטי.
- בעוד ניתוח TSP מתבצע, צנטריפוגה הנותר 550 μL של lysate הגולמי כולל (או כולו 600 μL של lysate הגולמי סך אם ניתוח TSP לא מתבצע) ב g 10,000 × במשך 10 דקות. אסוף את supernatant בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge טרי. זהו lysate המסיס אשר ישמש לטיהור.
- ערבוב lysate.
- לבצע תמוגה כמתואר בשלבים 2.1.1 ו 2.1.2 לעיל.
- מערבבים 600 μL של lysate גולמי סך מחיידקים להביע למקטע α הרצוי עם 600 μL של lysate גולמי סך מחיידקים להביע למקטע β הרצוי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רעד איטי למשך 30 דקות.
הערה: זה עשוי להיות נחוץ כדי לייעל את זמן הדגירה להשלים את התכנסותו מקסימלית במהלך lysate ערבוב (ראה דיון). השעה והטמפרטורה המוצגים כאן הם אופטימליים עבור חלבונים רקומביננטיים במחקר זה והיו נחושים במקום אחר 18. - צנטריפוגה lysate המעורבת ב g 10,000 × במשך 10 דקות כדי להפריד חומר מסיס מן הגלולה מסיסה. מעבירים את supernatant לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש. השתמש lysate המסיס המעורב זו לטיהור חלבון.
3. טיהור חלבון באמצעות שרף משותק קובלט זיקה(קואליציית עיקר).
- לאזן את השרף.
- ביסודיות resuspend שרף על ידי היפוך בקבוק ולהעביר 50 μL של תרחיף לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. צנטריפוגה ב g 700 × 2 דקות כדי שרף גלול. בזהירות לשאוב supernatant.
הערה: אנו מבצעים השאיפה פיפטה באמצעות קצה פיפטה כחול 1 מ"ל כדי להסיר את חלק הארי של הנוזל. טיפ 2 μL לבן משמש לשליטה קנס של הסרת supernatant הנותרים, משאיר שכבה דקה מאוד של נוזל מכסה את החרוזים. - הוסף 1 מ"ל של הצפת א מערבבים בעדינות כדי resuspend שרף צנטריפוגות ב g 700 × 2 דקות עד גלולה שרף. בזהירות לשאוב supernatant וחזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
- ביסודיות resuspend שרף על ידי היפוך בקבוק ולהעביר 50 μL של תרחיף לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. צנטריפוגה ב g 700 × 2 דקות כדי שרף גלול. בזהירות לשאוב supernatant.
- החל lysate המסיס שהושג בעבר בסעיף 2.1 או 2.2 שרף equilibrated. דגירת הצינור עם סיבוב עדין ב 4 ºC למשך 60 דקות. צנטריפוגה הצינור ב 700 × גרם </ Em> במשך 5 דקות ובזהירות לשאוב supernatant.
- שטוף את השרף כדלקמן להסיר חלבונים מחויבים nonspecifically.
- שרף גלולה עם 1 מ"ל של הצפת דגירה עם נדנדה עדין ב 4 ºC למשך 10 דקות. צנטריפוגה הצינור ב g 700 × 5 דקות ובזהירות לשאוב supernatant. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
- שרף גלולה עם 1 מ"ל של הצפת B (חיץ עם 5 מ"מ Imidazole) דגירה עם נדנדה עדין ב 4 ºC למשך 5 דקות. צנטריפוגה הצינור ב g 700 × 5 דקות ובזהירות לשאוב supernatant. חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
- שרף גלולה עם 1 מ"ל של חיץ C (חיץ עם 10 מ"מ Imidazole) דגירה עם נדנדה עדין ב 4 ºC למשך 5 דקות. צנטריפוגה הצינור ב g 700 × 5 דקות ובזהירות לשאוב supernatant.
- Elute החלבון על ידי הוספת 400 μL של הצפת E (הצפת עם 200 מ"מ Imidazole) to שרף. דגירה עם נדנדה עדין ב 4 ºC למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב g 700 × למשך 5 דקות.
- העברת supernatant המכיל חלבון מטוהר אל צינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגות חדש.
- Desalt החלבון מטוהר על ידי צנטריפוגה סדר כדלקמן.
- 400 μL של חלבונים מטוהרים, להוסיף 100 μL הצפת (זה מפחית ריכוז Imidazole מ -200 מ"מ ל -160 מ"מ). החל חלבון מטוהר 0.5 מסנני ultracentrifugal מיליליטר עם חתוך משקל מולקולרי 10 kDa. צנטריפוגה ב g 14,000 × למשך 5 דקות.
- מחק את התסנין ולהוסיף 400 μL הציף לדלל את retentate צנטריפוגות שוב. המשך מחזורי צנטריפוגה / דילול עד ריכוז imidazole נופל מתחת ל -4 מ"מ. כדוגמא, אם כל צנטריפוגה מתרכז 500 μl אל ~ 70 μl (או כ פי 7), אז שני מחזורים יפחיתו את ריכוז imidazole 160 מ"מ החל (7 × 7 = 49-פי) כדי approximately 3.3 מ"מ.
- למדוד את ריכוז החלבון של המדגם desalted באמצעות assay BCA 21.
הערה: Desalting נדרש להפחית את רמות Imidazole מתחת לגבול הסובלנות עבור assay BCA, כמתואר הוראות היצרן. המעבדה שלנו מעדיף את assay BCA כי הוא רגיש, יש טווח דינמי גדול, ותערוכות הרבה פחות וריאציה חלבון לחלבון. עם זאת, שיטות אחרות כדי לקבוע ריכוז החלבון ניתן להחליף עבור assay BCA. המפתח הוא להיות מודע לכל היתרונות והמגבלות של שיטה.
- הוסף חוצץ מדגם 5X יליד לריכוז סופי של 1X והמשך אלקטרופורזה. לחלופין, לאחסן דגימות ב -20 ºC לצורך ניתוח מאוחר יותר.
4. ג'ל אלקטרופורזה Nondenaturing polyacrylamide (עמוד).
זהירות: acrylamide Unpolymerized הוא עצבי. תלבש GEA הגנה המתאימהr.
- הכן את ג'ל עמוד nondenaturing כדלקמן.
- הכן את קלטת ג'ל ליציקה באמצעות לוחות זכוכית נקיים ליהוק עמדה. מניחים יצרנית שיפוע על גבי בוחש מגנטי קטן ומניחים בר ומערבבים זעירים לתוך כל תא.
- באמצעות 40% (w / v) acrylamide ו -2% (w / v) פתרונות המניות bisacrylamide, להכין 5% ו -10% (w / v) פתרונות ג'ל acrylamide חיץ בפתרון הילידים. ודא כי היחס של acrylamide סך bisacrylamide הוא 37.5: 1. צ'יל על הקרח לפני המזיגה.
הערה: מערכת עמוד nondenaturing משמשת כאן היא כמעט זהה למערכת SDS-PAGE Laemmli, עם SDS השמיט 22. - להוסיף אמוניום persulfate (מתוך 10% (w / v) פתרון המניות מוכן במים) כדי הפתרונות acrylamide ליזום פילמור. ריכוז סופי של אמוניום persulfate הוא 0.1% (w / v).
- יוצקי פתרונות acrylamide לתוך שתי לשכות יצרנית השיפוע. עם B לשקע צינורות המוכנסיםetween הצלחות של קלטת ג'ל, להפעיל את הבוחש המגנטי ולפתוח את השסתומים יצרני שיפוע. יוצקים את 5 - ג'ל שיפוע nondenaturing 10%.
- לאחר שפך, כיסוי ג'ל עם שכבה דקה של Isopropanol ולאפשר הג'ל לפלמר למשך 30 דקות. במהלך תקופה זו, להכין פתרון ג'ל טרי 5% acrylamide במאגר בפתרון הילידים. לאחר ערכות ג'ל, יוצקים מעל Isopropanol ולשטוף העליון של ג'ל עם מים ללא יונים מבקבוק להשפריץ.
- כדי הפתרון ג'ל 5% המוכנים לעיל, להוסיף אמוניום persulfate (בדיוק כמתואר 4.1.3) ויוצק על גבי ג'ל polymerized עד צלחות זכוכית מלאות. כנס מסרק ג'ל. אפשר הג'ל המעולף לפלמר עבור 30 דקות נוספות.
- לאחר ג'ל הוא polymerized, להרכיב ג'ל קלט לתוך מנגנון אלקטרופורזה. לחלופין, לאחסן את הג'ל על 4 ºC, עטוף במגבות נייר לחות בניילון נצמד עד לשימוש.
- לאחר ג'ל עמוד nondenaturing מורכב לתוך ELECמנגנון trophoresis, למלא את המכל עם חיץ ריצת יליד 1X המוכן טרי מלאה ריצת חיץ יליד 10X.
- טען 10 מיקרוגרם של חלבונים מטוהרים, שהושג בסוף סעיף 3, לתוך כל שימוש היטב מזרק זכוכית.
- טען 2 μL לסטנדרטים חלבון יליד משקל מולקולרי גבוה (מדולל במאגר ריצה 1X הילידים) לאחת הבארות.
- הפעל ג'ל ב- V ו -4 ºC 55 עד בחזית לצבוע בורח הג'ל (כ 4 - 4.5 שעות).
- בנוסף הג'ל nondenaturing, לנתח aliquots של החלבון מטוהרים על ידי 22 SDS-PAGE סטנדרטי.
- מערבבים aliquots (10 מיקרוגרם) של דגימות חלבון מטוהרים, שהושג בסוף סעיף 3, עם חיץ 5X SDS-מדגם לריכוז סופי של 1X.
- לדגור על 100 ºC למשך 5 דקות ו לטעון על תקן 12% ו / או 15% ג'ל SDS-PAGE 22.
- הפעלה ב 80V למשך 20 דקות ולאחר מכן ב 120 V עד בחזית לצבוע בורח הג'ל (זה כ תוספתitional 75 דקות עבור ג'ל 12%, ו -120 דקות עבור ג'ל 15%).
5. פעילות חזותיות מכתים חלבון.
- בעקבות אלקטרופורזה, צלחות זכוכית נפרדות בזהירות ולהעביר את הג'ל nondenaturing למגש ג'ל המכיל 50 מיליליטר של מים ללא יונים. לשטוף ג'ל עם נדנדה עדין למשך 5 דקות. בטל מים וחזרו על שלב זה לשטוף שלוש פעמים.
- בצע assay כיסוי המצע כדלקמן.
- הוסף 1 מ"ל של פיתוח מאגר המכיל המצע פפטיד fluorogenic Suc-LLVY-AMC ולהפיץ באופן אחיד על פני הג'ל. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הערה: מוט זכוכית או releaser ג'ל (טריז קטן של פלסטיק המשמש לוחות זכוכית נפרדים) ניתן להשתמש כדי להפיץ את הנוזל על ג'ל. - בזהירות להעביר את הג'ל על UV transilluminator של מערכת ההדמיה ג'ל ולבחון קרינה בשל מצע פפטיד בקע. תמונת שיא. להעביר בזהירות את ba ג'לck למגש ג'ל.
- יש לשטוף את הג'ל פעמיים עם 50 מ"ל של מים ללא יונים במשך 5 דקות עם נדנדה עדין.
- כתם ג'ל עם 10 מיליליטר של ריאגנט כתם coomassie קולואידים במשך 60 דקות עם נדנדה עדינה. ג'ל destain עם 50 מ"ל מים עד רקע מתבהר. צעד מכתים זה חל על ג'לים SDS-PAGE הסטנדרטי גם כן.
- הוסף 1 מ"ל של פיתוח מאגר המכיל המצע פפטיד fluorogenic Suc-LLVY-AMC ולהפיץ באופן אחיד על פני הג'ל. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטאזום הרכבה (איור 1) מתחילה כאשר יחידות משנת אלפא לשלב טבעות טופס 9. אפשר להדגים זאת כאשר יחידות משנה אלפא מן archaeon Methanococcus maripaludis S2 מבוטאים החיידק כמו C- סופני hexahistidine מתויג (מתויג שלו) נגזרים (טבלה 1). כאשר α-שלו רקומביננטי החלבון היה מטוהר על ידי קואליציית עיקר ונותח על ידי nondenaturing עמוד, שתי להקות נצפו (איור 2 א ', מסלול 1). אנחנו הוכחנו בעבר כי אלה מתאימים טבעות α יחידות (SR) ו-טבעות α זוגיות (DR) 18. ה- DR הוא מין ללא מוצא כי הוא לא פרודוקטיבי להרכבה הבאה 9,18.
כאשר אלפא-שלו יחידות המשנה היו coexpressed עם יחידות משנה β, המייצגת את השיטה הרגילה על ידי להרכבה של פרוטאזומים archaeal רקומביננטי היא assayed, מין רומן נצפה נודדת ליד הדוכן בגודל 670 kDaARD (איור 2 א, מסלול 3). מין זה היה proteolytically פעיל (תרשים 2B, מסלול 3) והכיל רק יחידות משנת β בוגרות לחלוטין (mβ) אשר propeptides הוסר (איור 2 ג, מסלול 3). מין זה הוא CP לבגרות מלאה. מדגם זה הכיל גם כמה מיני SR, אשר היה צפוי כי SR היא הרכבה ידועה ביניים, אבל לא מיני DR. חוסר DR כאשר אלפא-שלו יחידות משנה בטא הם coexpressed עולה כי הרכבה נכונה התרחשה מהר מספיק כך ההתאגדות של יחידות משנת β הצליחה outcompete ההיווצרות פרודוקטיבי של DR (לניתוח מפורט יותר לראות 18).
כדי להדגים את המגבלה של שיטת Coexpression, ולנסות לשכנע את התועלת של גישה משולבת, α-שלו יחידות משנה בטא התבטא בנפרד ב E. coli. בעקבות התפרקות שהברים המסיסים היו מעורבים וחלבונים היו מטוהרים על ידי קואליציית עיקר לפניניתוח לפי דף nondenaturing. לגמרי פרוטאזומים פונקציונלי גם נוצרו באמצעות גישת ערבוב lysate (איור 2 א ו -2, מסלול 2), ואת מיני SR נצפו גם כצפויים. ההופעה המחודשת של מיני DR ב lysate ערבוב מדגם ברגע שהמחיר נוצר, תת-יחידות β אינן מסוגלות הפיך לפרק זה; זה מדגיש את הטבע ללא מוצא של DR. מעניין, זן חדש הופיע גם במדגם ערבוב lysate, נודדות ממש מתחת CP (המכונה "חצי"). לאחרונה, הראינו כי מין זה תואם את חץ הפרוטאזום (אלפא 7 β 7) 18. כדי להמחיש זאת כאן, מוטציה למקטע β (R166W) הועסקה. מוטציה זו משבשת אינטראקצית טבעת β-β, מובילה 18 dimerization חצי פרוטאזומים לקויים. מאז חצי הפרוטוסמית מבשרי המיידי CP, מוטצית R166W צריכה להוביל גם הצטברות של חצי פרוטאזומיםירידת דה במבנה CP. כאשר lysate ערבוב עם α-β שלו (R166W) יחידות משנה בוצע, רמות נמוכות יותר של CP ו רמות גבוהות של מינים "חצי" נצפו (איור 2 א, מסלול 4). זה עולה בקנה אחד עם מערכת יחסים מבשר-מוצר עבור שתי להקות אלה, ומאשרת את הזהות של המינים "חצי" כמו-הפרוטאזום וחצי. ההגירה מעט מהירה יותר של-הפרוטאזום חצי במדגם מוטציה (מסלול 4 לעומת מסלול 2) היא כנראה עקב המוטציה R166W לשנות את יחס המסה-תשלום של למקטע β.
היכולת לדמיין את-הפרוטאזום והחצי במהלך ערבוב lysate נובעת בעיקר ריכוז חלבון הרבה יותר נמוך lysate לעומת ריכוזי חלבון הגבוהים בתוך תאים. ריכוזים נמוכים לגרום פחות יעילה (כלומר איטית) הרכבה, המאפשרת ביניים הופכים ליותר ויותר מאוכלס ובכך לזיהוי. מלבד המראה של-הפרוטאזום וחצי, נתון נוסף מדגיש את יעילות הרכבת הירד במהלך ערבוב lysate: יחידות משנת β לא מעובד, אשר שומרות propeptides שלהם, הופכות לגילוי (proβ). מאז עיבוד propeptide אינו מתרחש עד פרוטאזומים חצי dimerize, הופעתו של טופס proβ בשלה בקורלציה עם רמת הצטברות חצי הפרוטאזום (השווה איור 2C, מסלול 3 לעומת מסלול 2 לעומת מסלול 4). במקרה של מוטצית R166W, כישלון עיבוד propeptide במהלך ערבוב lysate הוא מוחלט למרות כמות קטנה של CP עושה טופס. הסיבה לכך היא כי עיבוד propeptide לא רק דורש dimerization חצי הפרוטאזום, אלא גם ממשק כראוי יצרו β-β טבעת 23 אשר המוטציה R166W אינו מקנה. תרטיב מפורט יותר של Coexpression לעומת ערבוב lysate, כפי שהוא נוגע הרכבת הפרוטאזום רקומביננטי, ניתן למצוא כאן 18.
איור 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,860 / 54860fig1.jpg "/>
איור 1: סכמטי פשוט של חלקיקי Core (CP) עצרת.
היחידות משנת α יכולה להרכיב לתוך טבעת-α הסינגל הראשון (SR) המשמש כתבנית עבור השילוב של יחידות משנה β. זה מוביל לדור של חצי הפרוטאזום ביניים (מחצית) אשר dimerizes במהירות. במקביל dimerization, את propeptides למקטע β (לא מוצג) יוסר autocatalytically והוליד חלקיק הליבה מתפקד במלואה (CP). Double α-טבעות (DR) יכולות לנבוע SR ואינם מוסמכים להרכבה לתוך מחסום. היווצרותם מייצגת מסלול הרכבת פרודוקטיבי (חץ מקווקו) בניגוד לאירועי הרכבת פרודוקטיבי (חיצים מוצקים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: גישה משולבת עבור Assaying הפרוטאזום העצרת.
Coexpression (C) lysate ערבוב (L) הועסקו ללמוד הרכבה של פרוטאזומים רקומביננטי מן archaeon מ maripaludis. חלבונים היו מטוהרים ידי משותקת קובלט זיקה שרף (קואליציית עיקר). (A, B) חלבונים מטוהרים (10 מיקרוגרם) הועמסו 5 הלא denaturing - 10% ג'ל שיפוע. בעקבות אלקטרופורזה, פעילות peptidase היה דמיינו באמצעות שכבת ג'ל עם פתרון מאגר המכיל את המצע פפטיד fluorogenic Suc-LLVY-AMC (B) לפני מכתים את הג'ל עם מגיב הכתם coomassie קולואידים (א). ראשי חץ שחור לציין את עמדותיהם של חלקיק הליבה 20S התאספו (CP), חצי-הפרוטאזום ביניים (וחצי), טבעת α כפול (DR) ו-טבעת α יחיד (SR). ההגירה של סטנדרטים גודל מספר מולקולרי (ב KDA) מותווה בצד ימין. (ג) A הועמסו גם על 15% ג'ל SDS-PAGE. בעקבות אלקטרופורזה, ג'לים הוכתמו ריאגנט הכתם coomassie קולואידים. הגירה של α-שלו למקטע ושל מלא בוגרת (mβ) ואת בשלה (proβ) יחידות משנת β מותווה. עמדת תקן הגודל מולקולרי 25 kDa היא מופיעה בצד ימין. כוכבית מציינת α-שלו קטועה שבר למקטע הנובע proteolysis ספציפי במהלך תמוגה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| פלסמיד | גנוטיפ | מָקוֹר |
| AKB191 | pET42 psmA-שלו | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB464 | pET42 psmA-שלו psmB | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB946 | pET42 psmB | Panfair et al., (2015) |
| AKB952 | pET42 psmB (R166W) | Panfair et al., (2015) |
טבלה 1: פלסמידים בקטריאלי השתמשו במחקר זה. psmA הוא הגן למקטע α archaeal ו psmB הוא הגן למקטע β archaeal.
| הצפת | 50 מ"מ HEPES-NaOH, 7.5 pH, 300 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl 2. | חוצצי B, C, ו- E, הם נגזרות של הצפת Imidazole המכיל. כדאי להוסיף Imidazole ממלאי 2 M מוכן במים לאחסן בחושך. |
| חיץ Native בפתרון | Tris-HCl מ"מ 375, pH 8.8, 0.1% (v / v) tetramethylethylenediamine (TEMED) ו -0.1% (w / v) אמוניום Perulfate (APS). | מוכן טרי לא יותר משעה לפני ג'ל הוא להיות polymerized ושמר על קרח. כאשר מכינים acrylamide פתרונות ג'ל יליד חיץ פתרון, כדאי להוסיף את טריס-HCl ממלאי 4X (1.5 M Tris-HCl, pH 8.8). APS הוא הוסיף מיד לפני פילמור. |
| חיץ ריצת Native 10X מניות | 250 מ"מ טריס, 1.92 מ 'גליצין, לא להתאים את ה- pH. | |
| חיץ מדגם 5X ילידים | 0.5 M Tris-HCl, pH 8.8, 50% (v / v) גליצרול, עקבות של כחול bromophenol. | עקבות מתייחסות כמות קטנה מאוד, בדרך כלל כמה גרגרים המועברים באמצעות מרית. |
| חיץ 5X SDS-מדגם | 0.3 M Tris-HCl, pH 6.8, 600 מ"מ dithiothreitol (DTT), 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) גליצרול עקבות של כחול bromophenol. | עקבות מתייחסות כמות קטנה מאוד, בדרך כלל כמה גרגרים מועבר באמצעות מרית. |
| חיץ פיתוח | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 מ"מ MgCl 2, 1 mM ATP, 50 מ"מ Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC הוא מצע פפטיד fluorogenic המשמש assay פעילות הפרוטאזום. |
טבלה 2: פתרונות, מדיה או מאגר השתמשו במחקר זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מדגימים את היתרון של גישה משולבת לניתוח הרכבה הפרוטאזום ידי nondenaturing עמוד באמצעות פרוטאזומים archaeal רקומביננטי. 9,11 השיטה הרגילה של Coexpression בקטריאלי של יחידות משנה הפרוטאזום מאפשר ניתוח מהיר אבל לא יכול לחשוף ביניים הרכבה מפתח. אנו מציעים שילוב Coexpression עם lysate ערבוב לפתח תמונה רחבה יותר של אירועי הרכבה.
היתרון של גישה משולבת זו הוא שלמרות מחייב ביטוי נפרד של α ובטא יחידות משנה עבור ערבוב lysate, זה עדיין יחסית עבודה ידידותית. התוצאות יכולות להיות גם semiquantitative אם ניתן להבטיח רמות ביטוי דומות ועקביות של החלבונים הבודדים. לשם כך, אנו ממליצים לבצע אופטימיזציה הרגיל של ביטוי חלבון רקומביננטי כדי לקבוע תנאים המאפשרים רמות דומות של חלבונים הביע לפני ערבוב lysate. אופטימיזציה יכולה לכלול משתנים אינדוקציה timדואר, טמפרטורת אינדוקציה, צפיפות אופטית ב אינדוקציה, זן ביטוי חיידקים, וכן הלאה, עד לרמות רצויות של חלבון מסיס מושגות. זה חשוב במיוחד כאשר משווה גרסות WT ו מוטציה של חלבון כי לפעמים המוטציה עשויה להפגין רמות ביטוי דומות, אך ירד מסיסות. כמו כן, אנו מדגישים את החשיבות של קביעת ריכוזי חלבון של דגימות מטוהרים ICAR לפני טעינת עמוד nondenaturing. אפילו עם אופטימיזציה ביטוי במקום, ועם הטיפול הטוב ביותר לנקוט על מנת להבטיח כי דגימות במקביל מעובדים לאורך שלבי טיהור באותו אופן, שונה יכול עדיין להיות הציג בשוגג. מדידת ריכוז מבטיחה את אותה הכמות של חלבון כולל נטענת לדגימה היטב. זה הופך שביל אל שביל השוואות בעוצמות להקה נתונה נודדות מינים יותר משמעותיים.
אם רמות דומות והעקביות של ביטוי חלבון לא ניתן להשיג עבור Lysaערבוב te, תמיד אפשר לטהר את כל הרכיבים מראש ולבצע ערבוב ניסויים עם חלבונים טהורים. זה היתרון לאפשר קביעות חלבון מדויקות יותר ובכך הופך את כמותית הגישה. עם זאת, החסרון של טיהור מלאה הוא כי התהליך הופך הרבה יותר עבודה אינטנסיבית, אשר יכול למנוע ניתוח מהיר של מוטציות מרובות 18 בו זמנית. הערת אזהרה סופית ראויה להזכיר היא שלפעמים להפריד ביטוי α ו יחידות משנה בטא אינן אפשרית. זה יכול להתרחש אם מוטציה גורמת למקטע להיות מסיס חיידק כאשר הביעו בפני עוצמה אך מאפשרת מסיסות כדי לקבל בחזרה כאשר המוטציה מתבטאת עם השותף והמחייבת. אם זה קורה, זה יגביל ניתוח כדי Coexpression בלבד. עם זאת, מדובר אזהרה שיכולות להתעורר במהלך ביטוי חלבון רקומביננטי בכלל, אינה ספציפית יחידות משנה הפרוטאזום archaeal 24,25.
בחרנו generate הנגזר שלו מתויג חלבוני proteasomal שלנו בשל קלות טיהור ואת affordability של שרף קואליציית עיקר. תגי epitope אחרים אפשריים, לרבות אלה טיהור מבוססת נוגדנים, ואנחנו בהצלחה הבענו והגירסות מתויגות דגל מטוהרים של היחידות משנת הפרוטאזום שלנו (לא מוצגות). עם זאת, אם טיהור הומוגניות (או הגדלת היקף הייצור) נדרשה, הגירסות שלו מתויג לספק את האמצעים המהירים ביותר החסכוניים לעשות זאת.
הוא נתון כי התוצאות שהושגו עם חלבונים רקומביננטיים, בין אם הם archaeal או חלבונים איקריוטיים המיוצר חיידקים, תרוויח עוד משמעות כאשר במעקב עם תצפיות in vivo. עם זאת, גישה vivo ב לא תמיד נגיש מיד באופן ניסיוני. הדבר נכון במיוחד כאשר נושא המחקר הוא גדול, multisubunit מורכבת כגון הפרוטאזום. חלבון רקומביננטי מתקרב לספק נקודת השקה חשובה futuמחדש ניסויים. במקרה של הפרוטאזום, זיווג הפרוטסומים המיוצרים archaeal רקומביננטי עם עמוד nondenaturing ימשיך להיות יעיל מאוד הבהרת תכונות עיקריות של הרכבה הפרוטאזום, אשר משותפים בין מינים archaeal ו אוקריוטים 9,11,12,18. גישה כזו עשויה להיות שימושי לחקר ההרכבה של מתחמי multiprotein גדולים אחרים גם כן. לאחרונה, השתמשנו באסטרטגיה זו על מנת להוכיח כי פרוטאזומים archaeal יכולים להרכיב באמצעות יותר ממסלול אחד, וכי α-טבעות אינן ביניים לחייב במהלך העצרת כי הם נחשבו 18. זה עדיין לא נקבע אם הדבר נכון גם עבור פרוטאזומים איקריוטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק קרנות לתשתיות למחקר (RSFG) מאוניברסיטת אינדיאנה-Purdue University, אינדיאנפוליס, ובחלקה על ידי בפרס של איגוד הלב האמריקאי 14GRNT20390154, כדי ARK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R.
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W.
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
