Summary
Questo protocollo utilizza sia coexpression subunità e postlysis subunità miscelazione per un esame più approfondito di assemblaggio proteasoma ricombinante.
Abstract
Proteasomi si trovano in tutti i campi della vita. Essi forniscono la principale via di degradazione delle proteine intracellulari negli eucarioti, anche se il loro montaggio non è completamente noto. Tutti i proteasomi contengono una particella strutturalmente conservato nucleo (CP), o 20S proteasoma, contenente due anelli subunità beta heptameric a sandwich tra due anelli α subunità heptameric. Archaeal 20S proteasomi sono compositivo semplice rispetto alle loro controparti eucariotiche, ma entrambi condividono un meccanismo di montaggio comune. Di conseguenza, archaeal 20S proteasomi continuano ad essere modelli importanti per il montaggio del proteasoma eucariotica. In particolare, l'espressione ricombinante della 20S archeali proteasomi accoppiato con nondenaturing gel di poliacrilammide (PAGE) ha prodotto molti importanti intuizioni proteasoma biogenesi. Qui, si discute un mezzo per migliorare la solita strategia di coexpression di α proteasoma archeali e subunità beta prima nondenaturing PAGINA. Abbiamo dimostrato che, anche se rapido ed efficace, un approccio coexpression solo può mancare intermedi chiave di montaggio. Nel caso del proteasoma, coexpression potrebbe non consentire il rilevamento del semi-proteasoma, una contenente una α-anello completo intermedio e una β-anello completo. Tuttavia, questo intermedio è facilmente rilevata tramite lisato di miscelazione. Si suggerisce che la combinazione coexpression con lisato di miscelazione produce un approccio più completo per l'analisi di assemblaggio, ma rimane non intensiva del lavoro. Questo approccio può essere utile per lo studio di altri complessi multiproteici ricombinanti.
Introduction
Complessi multiproteici svolgono numerose attività cellulari critiche 1. Per molti di questi complessi, molto di più si sa sulla loro struttura e la funzione di circa il loro montaggio 2,3. Il proteasoma è un tale complesso e si trova in tutti i campi della vita. In eucarioti, questa macchina molecolare è alla base del sistema Proteasome / ubiquitina (UPS) e fornisce la principale via di degradazione delle proteine intracellulari 4. Il proteasoma eucarioti (indicato come il proteasoma 26S) è composto da due grandi gruppi di sub: un proteasoma 20S, o Core Particle (CP) 5, che può essere limitato a una o entrambe le estremità da una particella regolamentazione 19S (RP) 6.
Il proteasoma 20S è un grande proteasi compartimenti stagni. La sua struttura quaternaria è assolutamente conservata in tutti i domini della vita e consiste in una pila di quattro anelli di sette membri contenente due tipi di subunità strutturalmente correlati, α; e ß 5,7,8. Negli eucarioti, i due anelli esterni sono ciascuna costituite da sette subunità alfa distinti e due anelli interni sono ciascuna costituite da sette subunità beta distinti; attività proteolitica risiede entro tre delle subunità beta. Per contro, gli anelli di CP archaea e batteri sono generalmente costituiti da un solo tipo di α e un tipo di subunità β. Proteasomi archaeal hanno fornito un sistema importante modello per lo studio di montaggio proteasoma sia per la loro semplicità compositiva e la loro condivisione di un meccanismo di montaggio comune con le loro controparti eucariotiche 9-13. In breve, subunità alfa assemblano in anelli alfa prima, che servono da impalcatura su cui beta subunità assemblare. I risultanti mezze proteasomi (α β 7 7) dimerizzano, dando luogo ad assemblare completamente CP (α β 7 7 β α 7 7). Durante dimerizzazione, i propeptidi presenti su subunità betasono autocatalytically rimossi, esponendo i catalitici threonines N-terminale. L'uso dei proteasomi archeali per modellare il montaggio prende frequentemente vantaggio della produzione di proteine ricombinanti proteasoma archeali in Escherichia coli. Questo è un approccio interessante perché consente subunità essere prodotte in varie combinazioni, sia come WT e versioni mutanti, in un organismo ospite che non produce i propri proteasomi.
Monitorare l'assemblaggio di complessi multi-proteina richiede biochimicamente un qualche tipo di metodo di frazionamento che separa i complessi completamente assemblati da intermedi di assemblaggio e precursori. Grazie alla sua capacità di risoluzione superiore, nondenaturing SDS-PAGE (PAGINA) ha dimostrato di essere particolarmente utile nel frazionamento di varie grandi complessi multiproteici 14-17. La combinazione di produzione proteasoma archaeal ricombinante e PAGE nondenaturing è diventato un approccio potente dissecting assemblaggio proteasoma 9,11,12,18. Tuttavia, il metodo usuale con cui questo approccio viene applicato (es. Tramite la coespressione ricombinante di alfa e beta subunità) ha un importante inconveniente. Le reazioni di montaggio sono cooperativa e fortemente dipendente dalla concentrazione 3. Dato che la concentrazione di proteine all'interno delle cellule è molto alta 19, a causa di effetti di volume escluso, reazioni di assemblaggio siano effettuati rapidamente in vivo. Quindi è possibile perdere importanti intermedi di montaggio quando alfa e beta subunità sono coexpressed.
Qui, sosteniamo un approccio combinato nello studio di assemblaggio proteasoma usando ricombinanti subunità del proteasoma archeali. In questo approccio, entrambi i metodi di miscelazione coespressione e lisato sono impiegati. Il primo permette per l'analisi rapida di assemblaggio, perché coexpression è meno laborioso. Quest'ultimo dipende espressione separata di alfa e beta subunità, seguita da miscelazione. Anche se questo requires un po 'più sforzo che coexpression, è più che compensata dalla capacità di individuare prodotti intermedi che sono mancati durante coexpression. Insieme, questi due metodi in grado di fornire un quadro più completo di montaggio proteasoma.
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Protocol
1. Espressione batterica.
Nota: plasmidi di espressione utilizzati in questo studio sono descritti nella Tabella 1. Soluzioni, media e tamponi utilizzati in questo studio sono descritti nella tabella 2. La clonazione di geni proteasoma subunità archeali e la generazione di plasmidi di espressione sono descritte altrove 18,20. In breve, i plasmidi per coexpression ricombinante di subunità impiegano una strategia operone bicistronico che aiuta a ottenere livelli di espressione comparabili di singole subunità 18,20. I parametri di espressione elencati di seguito sono stati empiricamente determinato per essere ottimale per le subunità del proteasoma in questo studio. Potrebbe essere necessario ottimizzare espressione per altri mutanti proteasoma, per proteasomi da altre specie archeali, o per altri complessi di proteine ricombinanti (vedi la discussione).
- Trasforma plasmide di espressione di interesse in chimicamente competente E. coli BL21 (DE3) cellule.
- Aggiungere 1 - 2 microlitri di plasmide (tipicamente 50 - 100 ng) ad una aliquota di cellule DE3 che sono stati appena scongelati su ghiaccio, e continuano ad incubare su ghiaccio per 20 min.
- shock termico le cellule a 42 ° C per 45 s e tornare tubo di ghiaccio per 2 minuti aggiuntivi.
- Aggiungere 1 ml di terreno LB e incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per 1 h.
- Distribuire 100 - 200 ml di miscela trasformazione su LB-kan piastre (piastre contenenti mezzi LB solidi, integrati con kanamicina (tutti plasmidi utilizzati in questo studio di resistenza a questo antibiotico encode)). Incubare le piastre a 37 ° C O / N.
- La mattina dopo, inoculare una singola colonia dalla piastra LB-kan in 3 ml di liquido mezzi LB-kan in un tubo di vetro cultura. Incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per circa 2,5 - 3 h, o fino a quando si osserva torbidità.
- Misurare la densità ottica della coltura a 600 nm (OD 600) in uno spettrofotometro. Diluire il culto delle celluleure con una quantità appropriata di mezzi LB-kan preriscaldata ad una OD 600 di 0,4 in un volume finale di 6 mL. Riprendere agitazione a 37 ° C per 40 min.
- Indurre l'espressione della proteina nelle colture liquide aggiungendo IPTG da una soluzione madre ad una concentrazione finale di 1 mM. Incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per circa 6-7 ore.
- Raccolto colture di cellule batteriche nella loro interezza in provette da 1,5 ml microcentrifuga.
- Aggiungere 1,5 ml di una cultura in provetta. Centrifugare a 10.000 g per 1 min.
- Eliminare il surnatante e aggiungere altri 1,5 ml di una stessa cultura al pellet. Centrifugare a 10.000 g per 1 min.
- Ripetere il passaggio 1.11 fino a quando l'intera coltura è raccolta nella provetta.
- Conservare il pellet indotti a -80 ° C fino lisi.
2. batterica Lisi e lisato di miscelazione.
Nota: (cioè verifica che la proteina era espresso e solubile). Così, si consiglia vivamente compresa l'analisi TSP inizialmente. Una volta che un protocollo ottimale è stato raggiunto per una particolare combinazione subunità, analisi TSP non è richiesto rigorosamente è per questo che è descritto come optional di seguito.
- Lisi delle cellule batteriche e la preparazione di frazioni solubili.
- Scongelare il pellet cellulare indotta in ghiaccio per 5 min. Risospendere il pellet in 600 ml di tampone di lisi.
- IncUbate la sospensione a 30 ° C con agitazione (150 rpm) per 30 min per generare lisato grezzo totale.
Nota: Il passo successivo e la sottosezione che segue sono opzionali. - Rimuovere due aliquote 25 microlitri dal lisato grezzo totale in provette da microcentrifuga da 1,5 ml separati ed effettuare analisi TSP come segue.
- Per una delle due aliquote 25 microlitri, aggiungere tampone campione SDS 5X ad una concentrazione finale di 1X. Etichettare la provetta con "T" per "lisato grezzo totale".
- Incubare il campione "T" a 100 ° C per 5 minuti per denaturare le proteine completamente.
- Nel frattempo, prendere la seconda aliquota 25 microlitri e centrifugare è a 10.000 g per 10 min. rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare la piccola pallina, e trasferirlo ad un nuovo 1,5 ml provetta. Etichettare questo nuovo tubo "S" per "frazione solubile".
- Per i behi piccola pallina di sinistraND nel passaggio precedente, aggiungere 25 ml di tampone di lisi e vortex per risospendere. Etichettare questo tubo "P" per "frazione pellet".
- Aggiungere 6 tampone campione ml di 5X SDS ai tubi e "S" "P" e incubare a 100 ° C, come descritto sopra.
Nota: se non saranno utilizzati i campioni TSP quel giorno per analizzare l'espressione, possono essere congelati a -20 ° C fino al momento dell'uso. Una volta scongelate, devono essere reincubate a 100 ° C, come descritto sopra, immediatamente prima di essere caricati su un gel SDS-PAGE standard di 12% e / o del 15%.
- Mentre l'analisi TSP viene effettuata, centrifugare il restante 550 ml di lisato grezzo totale (o l'intero 600 ml di lisato grezzo totale se l'analisi TSP non viene effettuata) a 10.000 g per 10 min. Raccogliere il surnatante in una fresca 1,5 ml provetta. Questo è il lisato solubile che verrà utilizzato per la purificazione.
- Lisato miscelazione.
- Effettuare lisi come descritto ai punti 2.1.1 e 2.1.2 di cui sopra.
- Mescolare 600 ml di lisato grezzo totale dai batteri che esprimono la subunità α desiderato con 600 ml di lisato grezzo totale dai batteri che esprimono la subunità β desiderato. Incubare a 37 ° C con lenta agitazione per 30 min.
Nota: Potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo di incubazione per ottenere il massimo assemblaggio durante lisato di miscelazione (vedi la discussione). Il tempo e la temperatura qui presentati sono ottimali per le proteine ricombinanti in questo studio e sono stati determinati altrove 18. - Centrifugare il lisato mista a 10.000 g per 10 minuti per separare materiale solubile da pellet insolubili. Trasferire il surnatante in un nuovo 1,5 ml provetta. Utilizzare questo lisato solubile mista per la purificazione della proteina.
3. purificazione della proteina tramite Immobilized Cobalt Affinity Resina(ICAR).
- Equilibrare la resina.
- Accuratamente risospendere la resina capovolgendo il flacone e trasferire 50 ml di liquame di una provetta da microcentrifuga da 1,5. Centrifugare a 700 g per 2 minuti per resina pellet. Con attenzione aspirare il surnatante.
Nota: Effettuiamo aspirazione pipetta utilizzando una punta blu 1 ml pipetta per rimuovere la massa del liquido. Un bianco tip 2 microlitri viene utilizzato per la regolazione fine della rimozione del surnatante rimanente, lasciando uno strato molto sottile di liquido che copre le perline. - Aggiungere 1 ml di tampone A. Mescolare delicatamente per risospendere resina e centrifugare a 700 g per 2 minuti per far sedimentare resina. Con attenzione aspirare il surnatante e ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta.
- Accuratamente risospendere la resina capovolgendo il flacone e trasferire 50 ml di liquame di una provetta da microcentrifuga da 1,5. Centrifugare a 700 g per 2 minuti per resina pellet. Con attenzione aspirare il surnatante.
- Applicare lisato solubile ottenuto in precedenza nella sezione 2.1 o 2.2 alla resina equilibrata. Incubare la provetta con rotazione dolce a 4 ° C per 60 min. Centrifugare la provetta a 700 × g </ Em> per 5 minuti e con attenzione aspirare il surnatante.
- Lavare la resina come segue per rimuovere le proteine non specifico legato.
- resina risospendere con 1 ml di tampone A e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 10 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta.
- resina risospendere con 1 ml di tampone B (tampone A con 5 mM imidazolo) e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta.
- resina risospendere con 1 ml di tampone C (tampone A con 10 mM imidazolo) e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante.
- Eluire la proteina con l'aggiunta di 400 ml di tampone E (tampone A con 200 mm imidazolo) to la resina. Incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare a 700 g per 5 min.
- Trasferire il surnatante contenente proteina purificata in un 1,5 mL provetta da centrifuga.
- Dissalare la proteina purificata mediante centrifugazione seriale come segue.
- Per 400 ml di proteina purificata, aggiungere 100 microlitri tampone A (questo riduce la concentrazione Imidazole da 200 mm a 160 mm). Applicare proteina purificata a 0,5 ml filtri ultracentrifugo con un 10 peso molecolare kDa cut-off. Centrifugare a 14.000 g per 5 min.
- Eliminare il filtrato e aggiungere 400 microlitri tampone A per diluire il retentato e centrifugare di nuovo. Continuare i cicli di centrifugazione / diluizione fino concentrazione imidazolo scende al di sotto di 4 mm. Ad esempio, se ogni centrifugazione concentra 500 microlitri fino a ~ 70 microlitri (o circa 7 volte), poi due cicli ridurrà l'avvio 160 mM imidazolo concentrazione (7 x 7 = 49 volte) per approximately 3,3 mm.
- Misurare la concentrazione di proteine del campione dissalato utilizzando il saggio BCA 21.
Nota: Dissalazione è necessaria per ridurre i livelli imidazolici di sotto del limite di tolleranza per il saggio BCA, come descritto nelle istruzioni del produttore. Il nostro laboratorio preferisce il saggio BCA perché è sensibile, ha un ampio range dinamico, e presenta molto meno variazione proteina-to-proteine. Tuttavia, altri metodi per determinare la concentrazione di proteine possono essere sostituiti per il saggio BCA. La chiave è essere consapevoli dei vantaggi e dei limiti di ciascun metodo.
- Aggiungere 5X tampone campione nativo ad una concentrazione finale di 1X e procedere ad elettroforesi. In alternativa, conservare i campioni a -20 ° C per una successiva analisi.
4. nondenaturing SDS-PAGE (PAG).
Attenzione: secondo le normative vigenti acrilamide è una neurotossina. Indossare adeguata protezione gear.
- Preparare il gel PAGE nondenaturing come segue.
- Preparare la cassetta del gel per la fusione con lastre di vetro puliti e la colata stand. Mettere produttore di pendenza sulla cima di un piccolo agitatore magnetico e posizionare una piccola ancoretta in ciascuna camera.
- Utilizzando 40% (w / v) acrilammide e 2% (w / v) soluzioni stock bisacrylamide, preparano 5% e il 10% (w / v) soluzioni gel di acrilammide in un buffer risoluzione nativa. Assicurarsi che il rapporto di acrilamide totale bisacrylamide è 37,5: 1. Freddo sul ghiaccio prima di versare.
Nota: Il sistema nondenaturing PAGE usato qui è sostanzialmente identico al sistema SDS-PAGE Laemmli, con SDS omessa 22. - Aggiungere persolfato di ammonio (da 10% (w / v) soluzione madre preparata in acqua) alle soluzioni di acrilammide per iniziare la polimerizzazione. concentrazione finale di ammonio persolfato è 0,1% (w / v).
- Versare le soluzioni di acrilamide nelle due camere del creatore di gradiente. Con il tubo di uscita b inseritara le piastre della cassetta gel, attivare l'agitatore magnetico e si aprono le valvole gradiente creatore. Versare il 5 - gel non denaturante pendenza del 10%.
- Una volta versato, sovrapporre il gel con un sottile strato di isopropanolo e consentire il gel polimerizzare per 30 min. Durante questo tempo, preparare la soluzione di gel di acrilammide fresco 5% in tampone risoluzione nativa. Dopo i set di gel, travasare isopropanolo e sciacquare la parte superiore del gel con acqua deionizzata da una spruzzetta.
- Per la soluzione di gel 5% preparata sopra, aggiungere ammonio persolfato (esattamente come descritto in 4.1.3) e versare sulla superficie del gel polimerizzato fino lastre di vetro sono pieni. Inserto in gel pettine. Lasciare il gel sovrapposto polimerizzare per altri 30 min.
- Una volta che il gel è polimerizzato, assemblare cassette gel in apparato di elettroforesi. In alternativa, conservare il gel a 4 ° C, avvolti in tovaglioli di carta inumidito e l'involucro di plastica fino al momento dell'uso.
- Una volta nondenaturing gel PAGE è assemblato in eletApparecchio trophoresis, riempire il serbatoio con 1X tampone esecuzione nativa preparato fresco da un buffer in esecuzione nativa 10X magazzino.
- Carico 10 ug di proteina purificata, ottenuto alla fine della sezione 3, in ogni pozzetto usando una siringa di vetro.
- Carico 2 ml di alto livello peso molecolare nativa delle proteine (diluito in 1X buffer di esecuzione nativa) in uno dei pozzi.
- Eseguire gel a 55 V e 4 ° C fino a quando il fronte del colorante scappa il gel (circa 4-4,5 ore).
- In aggiunta al gel non denaturante, analizzare aliquote della proteina purificata dalla norma SDS-PAGE 22.
- Mescolare aliquote (10 ug) dei campioni di proteine purificate, ottenuti alla fine della sezione 3, con tampone 5X SDS-campione ad una concentrazione finale di 1X.
- Incubare a 100 ° C per 5 minuti e caricare su standard di 12% e / o del 15% gel SDS-PAGE 22.
- Eseguito a 80V per 20 minuti e poi a 120 V fino a quando il fronte del colorante corre il gel (questo è approssimativamente un addtransi- 75 min per un gel al 12%, e 120 min per un gel 15%).
5. Visualizing attività e proteine di colorazione.
- Dopo elettroforesi, lastre di vetro accuratamente separati e trasferire il gel non denaturante ad un vassoio gel contenente 50 mL di acqua deionizzata. Risciacquare gel con dolce dondolio per 5 min. Eliminare l'acqua e ripetere l'operazione di lavaggio per tre volte.
- Eseguire test overlay substrato come segue.
- Aggiungere 1 mL di sviluppare tampone contenente il peptide substrato fluorogenico Suc-LLVY-AMC e diffondere uniformemente su gel. Incubare a 37 ° C per 30 min.
Nota: Una bacchetta di vetro o un releaser gel (piccolo cuneo di plastica usata per lastre di vetro separate) possono essere utilizzati per diffondere il liquido sul gel. - Trasferire accuratamente il gel sul transilluminatore UV del gel sistema di imaging e osservare la fluorescenza a causa del substrato peptidico spaccati. immagine Record. trasferire accuratamente l'ba gelck al vassoio gel.
- Lavare il gel due volte con 50 ml di acqua deionizzata per 5 minuti con dolce dondolio.
- Colorare il gel con 10 ml di una colloidale reattivo Coomassie macchia per 60 minuti con il dolce dondolio. Gel Decolorare con 50 ml di acqua fino a sfondo diventa chiara. Questa fase di colorazione applica ai gel SDS-PAGE standard così.
- Aggiungere 1 mL di sviluppare tampone contenente il peptide substrato fluorogenico Suc-LLVY-AMC e diffondere uniformemente su gel. Incubare a 37 ° C per 30 min.
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Representative Results
Assemblaggio proteasoma (Figura 1) inizia quando subunità alfa si combinano per anelli di forma 9. Ciò può essere illustrato quando alfa subunità dalla archaeon Methanococcus maripaludis S2 sono espressi in E. coli come C-terminale hexahistidine tag (His-tag) derivati (Tabella 1). Quando la α-la proteina ricombinante è stata purificata dall'ICAR e analizzata mediante nondenaturing PAGE, due bande sono state osservate (Figura 2A, corsia 1). Abbiamo precedentemente dimostrato che questi corrispondono a Squillo unico alfa (SR) e doppio alfa-ring (DR) 18. Il DR è una specie dead-end che non è produttivo per il successivo assemblaggio 9,18.
Quando alfa-le sue subunità sono stati coexpressed con subunità beta, che rappresenta il solito metodo con cui il montaggio dei proteasomi archeali ricombinanti viene analizzato, è stata osservata una specie di romanzo la migrazione presso lo stand 670 dimensioni kDaard (Figura 2A, corsia 3). Questa specie è stata proteoliticamente attiva (Figura 2B, corsia 3) e conteneva subunità beta solo completamente maturi (mβ) i cui propeptidi sono stati rimossi (Figura 2C, corsia 3). Questa specie è il CP pienamente maturo. Questo campione conteneva anche alcune specie SR, che è stato previsto perché SR è un assemblaggio noto intermedio, ma nessuna specie DR. La mancanza di DR, quando alfa-lui e subunità beta sono coexpressed suggerisce che il corretto montaggio stava avvenendo abbastanza rapidamente in modo tale che l'incorporazione della subunità beta è stato in grado di outcompete la formazione non produttiva di DR (per un'analisi più dettagliata si veda 18).
Per dimostrare la limitazione del metodo coespressione e sostenere l'utilità di un approccio combinato, α-la e subunità beta sono stati espressi separatamente in E. coli. Dopo lisi, le frazioni solubili sono stati miscelati e proteine sono stati purificati dall'ICAR primaanalisi PAGE nondenaturing. Completamente proteasomi funzionali sono stati generati mediante la miscelazione lisato approccio (Figura 2A e 2B, corsia 2), e le specie SR è stato anche osservato come previsto. La ricomparsa della specie DR del lisato campione miscelazione indica che una volta formato, subunità beta sono in grado di smontare reversibilmente esso; Ciò sottolinea la natura vicolo cieco del DR. È interessante notare che una nuova specie è apparso anche nel campione di miscelazione lisato, la migrazione appena sotto la CP (definito "mezzo"). Recentemente, abbiamo dimostrato che questa specie corrisponde alla metà-proteasoma (alfa 7 β 7) 18. Per illustrare questo qui, è stato impiegato un mutante β subunità (R166W). Questa mutazione distrugge interazione anello β-β, che porta alla compromissione dimerizzazione mezza proteasomi 18. Dal momento che le mezze proteasomi sono i precursori immediati per CP, la mutazione R166W dovrebbe portare sia l'accumulo di mezze proteasomi unda diminuzione della formazione di CP. Quando lisato miscelazione con alfa-beta e le sue (R166W) subunità è stata effettuata, sono stati osservati livelli più bassi di CP e aumento dei livelli di specie "metà" (Figura 2A, corsia 4). Questo è coerente con un rapporto precursore prodotto per queste due bande, e conferma l'identità della specie "mezze" come meta-proteasoma. La migrazione leggermente più veloce del mezzo-proteasoma nel campione mutante (corsia 4 contro corsia 2) è probabilmente dovuto alla mutazione R166W alterare il rapporto di massa-a-carica della subunità β.
La possibilità di visualizzare meta-proteasoma durante lisato miscelazione è dovuto principalmente a concentrazioni proteiche molto bassi nel lisato rispetto alle concentrazioni elevate di proteine all'interno delle cellule. Concentrazioni inferiori producono meno efficiente assemblaggio (cioè più lenta), che consente intermedi a diventare più popolato e quindi rilevabile. Inoltre l'aspetto del mezzo-proteasoma, un'osservazione ulteriore evidenzia l'efficienza di assemblaggio diminuito durante lisato di miscelazione: subunità beta non trasformati, che mantengono le loro propeptidi, diventano rilevabili (proβ). Dal momento che l'elaborazione propeptide non si verifica fino a quando proteasomi mezzo dimerizzano, l'aspetto del modulo proβ immatura è correlata con il livello di accumulo di mezza proteasoma (confrontare Figura 2C, corsia 3 contro corsia 2 contro corsia 4). Nel caso del mutante R166W, il fallimento trasformazione propeptide durante lisato miscelazione è assoluta, anche se una piccola quantità di CP si forma. Questo perché l'elaborazione propeptide non solo richiede dimerizzazione metà proteasoma, ma anche un corretto formata interfaccia anello β-β 23 che la mutazione R166W non offre. Una narrazione più dettagliata di coexpression contro lisato di miscelazione, in quanto riguarda il montaggio proteasoma ricombinante, può essere trovato qui 18.
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Figura 1: Uno schema semplificato di core Particle (CP) Assembly.
Le subunità alfa possono assemblare in un unico α-primo anello (SR) che serve come modello per l'inserimento di subunità beta. Questo porta alla generazione del semi-proteasoma intermedia (metà) che dimerizza rapidamente. In concomitanza con dimerizzazione, i propeptidi β subunità (non mostrate) vengono rimossi autocatalytically dando origine alla particella nucleo completamente funzionale (CP). Doppia alfa-ring (DR) possono sorgere da SR e non sono competenti per il montaggio in CP. La loro formazione rappresenta un percorso di montaggio non produttiva (freccia tratteggiata) in contrasto con eventi di assemblaggio produttive (frecce solidi). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: un approccio combinato per il saggio di montaggio del proteasoma.
Coexpression (C) e lisato di miscelazione (L) sono stati impiegati per studiare montaggio di proteasomi ricombinanti dal archaeon M. maripaludis. Le proteine sono stati purificati da Immobilized Cobalt Affinity resina (ICAR). (A, B) proteine purificate (10 mcg) sono stati caricati su-denaturanti non 5 - 10% gel gradiente. Dopo elettroforesi, attività peptidasi stato visualizzato sovrapponendo il gel con una soluzione tampone contenente il peptide substrato fluorogenico Suc-LLVY-AMC (B) prima della colorazione del gel con Coomassie colloidale reagente macchia (A). frecce nere indicano le posizioni del nucleo particella 20S assemblati (CP), semi-proteasoma intermedia (metà), α-doppio anello (DR) e α-ring singola (CS). La migrazione di diversi standard di dimensioni molecolari (in kDa) è indicato a destra. (C) un sono stati caricati anche sul 15% gel SDS-PAGE. Dopo l'elettroforesi, gel sono stati colorati con un reagente colloidale Coomassie macchia. La migrazione di α-sua subunità e pienamente matura (mβ) e immaturi (proβ) subunità beta è indicato. La posizione dello standard dimensione molecolare 25 kDa è mostrato a destra. L'asterisco indica un tronco α-suo frammento subunità derivanti dalla proteolisi non specifico durante la lisi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| plasmidi | Genotipo | fonte |
| AKB191 | pET42 PSMA-suo | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB464 | pET42 PSMA-suo psmB | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB946 | pET42 psmB | Panfair et al., (2015) |
| AKB952 | pET42 psmB (R166W) | Panfair et al., (2015) |
Tabella 1: plasmidi batterici utilizzati in questo studio. PSMA è il gene α subunità archaeal e psmB è il gene β subunità archaeal.
| tampone A | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2. | Buffer B, C ed E, sono derivati di tampone A contenente imidazolo. È utile aggiungere imidazolo da un magazzino 2 M preparato in acqua e conservata al buio. |
| buffer di risolvere Native | 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% (v / v) tetrametiletilendiammina (TEMED) e 0,1% (w / v) di ammonio Perulfate (APS). | Preparato fresco non più di un'ora prima del gel è da polimerizzare e tenuti in ghiaccio. Nel preparare soluzioni gel di acrilammide in tampone risoluzione nativa, è utile aggiungere il Tris-HCl da uno stock 4X (1,5 M Tris-HCl, pH 8.8). L'APS viene aggiunta immediatamente prima della polimerizzazione. |
| buffer di esecuzione nativa 10X magazzino | 250 mm Tris, 1,92 M glicina, non aggiustare il pH. | |
| 5X tampone campione nativo | 0.5 M Tris-HCl, pH 8,8, 50% (v / v) glicerolo, tracce di blu di bromofenolo. | Tracce si riferisce a una quantità molto piccola, di solito alcuni grani trasferiti tramite spatola. |
| 5X SDS-campione del buffer | 0.3 M Tris-HCl, pH 6.8, 600 mM ditiotreitolo (DTT), 10% (w / v) di SDS, 50% (v / v) di glicerolo e tracce di blu di bromofenolo. | Tracce si riferisce a una quantità molto piccola, di solito alcuni grani trasferiti tramite spatola. |
| Lo sviluppo del buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 1 mM ATP, 50 mM Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC è un substrato peptidico fluorogenico utilizzato per saggiare l'attività del proteasoma. |
Tabella 2: Soluzioni, Media, e tamponi utilizzati in questo studio.
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Discussion
Dimostriamo il vantaggio di un approccio combinato di analizzare il montaggio proteasoma da nondenaturing pagina utilizzando proteasomi archeali ricombinanti. Il metodo usuale 9,11 di coexpression batterica subunità del proteasoma permette una rapida analisi, ma non può rivelare intermedi chiave di montaggio. Vi proponiamo la combinazione coexpression con lisato di miscelazione per sviluppare un quadro più ampio di eventi di assemblaggio.
Il vantaggio di questo approccio combinato è che pur richiedendo espressione separata del α e ß subunità per lisato miscelazione, è ancora relativamente lavoro-friendly. I risultati possono anche essere semiquantitativa se si assicura i livelli di espressione comparabili e coerenti delle singole proteine. A tal fine, si consiglia di effettuare la consueta ottimizzazione di espressione della proteina ricombinante per determinare le condizioni che consentano livelli comparabili di proteine espresse prima di lisato di miscelazione. L'ottimizzazione può includere o meno induzione time, la temperatura di induzione, densità ottica a induzione, batterica ceppo espressione, e così via, fino a ottenimento di livelli desiderati di proteina solubile. Ciò è particolarmente importante quando si confrontano versioni WT e mutanti di una proteina perché a volte il mutante può presentare livelli di espressione comparabili, ma è diminuito solubilità. Abbiamo inoltre sottolineare l'importanza di determinare le concentrazioni di proteine dei campioni ICAR-purificata prima di caricamento della pagina nondenaturing. Anche con ottimizzazione espressione in posto, e con la migliore cura di assicurare che i campioni paralleli vengono elaborati attraverso i passaggi di purificazione nello stesso modo, la varianza può ancora essere introdotto inavvertitamente. Una misura della concentrazione assicura che la stessa quantità di proteina totale viene caricato per pozzetto. Questo rende i confronti di corsia a corsia di intensità di banda per un determinato la migrazione delle specie più significativo.
Se i livelli comparabili e coerenti di espressione della proteina non possono essere raggiunti per LysaTE miscelazione, si può sempre purificare tutti i componenti in anticipo e portare a termine la miscelazione esperimenti con proteine pure. Questo ha il vantaggio di consentire determinazioni delle proteine più precisi e quindi rende quantitativa approccio. Tuttavia, l'inconveniente di purificazione pieno è che il processo diventa notevolmente più manodopera, che può impedire una rapida analisi di mutanti multipli simultaneamente 18. Un avvertimento finale degno di nota è che a volte separano espressione di α e subunità beta potrebbero non essere possibile. Ciò può verificarsi se una mutazione provoca una subunità insolubile in E. coli quando espresso da sola, ma permette solubilità per essere recuperato quando il mutante è espressa con il partner legante. Se ciò si verifica, si limiterà analisi di coespressione soltanto. Tuttavia, questo è un avvertimento che possono sorgere durante l'espressione della proteina ricombinante in generale, e non è specifico per subunità del proteasoma archeali 24,25.
Abbiamo scelto di GeneRate derivati his-tag delle nostre proteine del proteasoma a causa della facilità di purificazione e la convenienza della resina ICAR. Altre categorie epitopi sono possibili, compresi quelli per la purificazione a base di anticorpi, e abbiamo espresso con successo e purificati versioni Flag-tag dei nostri subunità del proteasoma (non mostrato). Tuttavia, se è richiesta la purificazione all'omogeneità (o aumentando la scala di produzione), le versioni suo-targhette forniscono i mezzi più veloci e più conveniente di farlo.
E 'un dato di fatto che i risultati ottenuti con le proteine ricombinanti, siano essi archeali o proteine eucariotiche prodotte nei batteri, guadagnerà ulteriore significato quando è seguito con osservazioni in vivo. Tuttavia, un approccio in vivo può non essere sempre immediatamente accessibili sperimentalmente. Questo è particolarmente vero quando il soggetto di studio è un grande, multisubunit complesso come il proteasoma. proteina ricombinante avvicina fornire un importante punto di lancio per Future esperimenti. Nel caso del proteasoma, l'associazione di produzione archeali proteasoma ricombinante con PAGINA nondenaturing continuerà ad essere molto efficace nel chiarire le caratteristiche fondamentali di assemblaggio proteasoma, che sono condivisi tra le specie archeali e eucarioti 9,11,12,18. Tale approccio può essere utile per studiare l'assemblaggio di altri grandi complessi multiproteici pure. Recentemente, abbiamo usato questa strategia per dimostrare che proteasomi archeali possono assemblare con più di un percorso, e che alfa-ring non sono gli intermedi obbligati durante il montaggio che sono stati pensati per essere 18. Resta da stabilire se lo stesso vale per proteasomi eucariotiche.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una ricerca di sostegno i fondi delle sovvenzioni (RSFG) da Indiana University-Purdue University, Indianapolis, e in parte da un premio dalla American Heart Association 14GRNT20390154, di ARK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
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