Summary
Dieses Protokoll nutzt sowohl die Untereinheit Koexpression und postlysis Untereinheit für eine gründlichere Untersuchung der rekombinanten Assemblierungsintermediate mischen.
Abstract
Proteasomen sind in allen Bereichen des Lebens zu finden. Sie bieten den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbaus in Eukaryoten, obwohl ihre Montage nicht vollständig verstanden wird. Alle Proteasomen enthalten einen strukturell konservierten Kernpartikel (CP) oder 20S-Proteasoms, die zwei heptameren Ringe β-Untereinheit zwischen zwei heptameren α-Untereinheit Ringe eingeklemmt. Archaeal 20S Proteasomen sind kompositorisch einfacher im Vergleich zu ihren eukaryotischen Kollegen, aber sie beide teilen eine gemeinsame Montagemechanismus. Folglich weiterhin Archaea 20S Proteasomen wichtige Modelle für eukaryotische Assemblierungsintermediate zu sein. Insbesondere wurde die rekombinante Expression von Archaea-20S Proteasomen in Verbindung mit nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) viele wichtige Einblicke in Proteasom-Biogenese ergab. Hier diskutieren wir ein Mittel auf die übliche Strategie der Co-Expression von Archaea-Proteasom-α zu verbessern und ß-Untereinheiten vor nondenaturing PAGE. Wir zeigen, dass, obwohl eine schnelle und effiziente, eine Co-Expression Ansatz allein Schlüssel Assemblierungsintermediate verpassen. Im Falle des Proteasoms, Koexpression erlauben nicht Detektion des Halb Proteasom, ein Zwischenprodukt, enthaltend ein vollständiges α-Ring und eine vollständige β-Ring. Jedoch ist dieses Zwischenprodukt wird leicht über Lysat Mischen detektiert. Wir schlagen vor, dass die Co-Expression mit Lysat Mischung kombiniert einen Ansatz ergibt, die bei der Analyse der Montage gründlichere ist, bleibt doch Arbeit nicht-intensiven. Dieser Ansatz kann für die Untersuchung von anderen rekombinanten Multiproteinkomplexen nützlich sein.
Introduction
Multiproteinkomplexen führen zahlreiche kritische zelluläre Aktivitäten 1. Für viele dieser Komplexe wird über ihre Struktur und Funktion viel mehr bekannt als über ihre Montage 2,3. Das Proteasom ist ein solcher Komplex und wird in allen Lebensbereichen zu finden. In Eukaryonten ist diese molekulare Maschine am Kern des Ubiquitin / Proteasom - System (UPS) und stellt den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbau 4. Die eukaryotische Proteasom (bezeichnet als 26S Proteasom) besteht aus zwei Hauptunterbaugruppen: eine 20S Proteasom oder Kernteilchen (CP) 5, die durch einen 19S Regulatory Particle (RP) 6 an einem oder beiden Enden verschlossen sein.
Das 20S-Proteasom ist ein großer compartmentalized Protease. Seine Quartärstruktur ist absolut in allen Lebensbereichen erhalten und besteht aus einem Stapel von vier siebengliedrige Ringe, die zwei Arten von strukturell verwandte Untereinheiten, α; und ß 5,7,8. In Eukaryoten sind die beiden Außenringe jeweils aus sieben verschiedenen α-Untereinheiten und die beiden Innenringe jeweils aus sieben verschiedenen β-Untereinheiten; proteolytische Aktivität liegt innerhalb drei der β-Untereinheiten. Im Gegensatz dazu werden die CP Ringe aus Archaea und Bakterien in der Regel nur aus einer Art von α und einer Art von β-Untereinheit zusammen. Archaeal Proteasomen sind ein wichtiges Modellsystem zum Studium Assemblierungsintermediate sowohl aufgrund ihrer kompositorischen Einfachheit zur Verfügung gestellt und ihre gemeinsame Montagemechanismus mit ihren eukaryotischen Pendants 9-13 teilen. Kurz gesagt, montieren α-Untereinheiten in α Ringe erste, die dazu dienen als Gerüst, auf die ß-Untereinheiten zusammenstellen. Die resultierenden Halb Proteasomen (α 7 β 7) dimerisieren Hierdurch entstehen zu komplett montierten CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Während Dimerisierung präsentieren die Propeptide auf ß-Untereinheitenautokatalytisch entfernt werden, um die katalytischen N-terminalen Threonine auszusetzen. Die Verwendung von Archaea - Proteasomen Baugruppe Modell nimmt häufig die Vorteile der Herstellung von rekombinanten Proteinen archaeal Proteasom in Escherichia coli. Dies ist eine sinnvolle Annäherung, weil es ermöglicht, die Untereinheiten in verschiedenen Kombinationen hergestellt werden, da sowohl WT und Mutanten-Versionen in einem Wirtsorganismus, der keine eigene Proteasomen erzeugt.
Die Überwachung der Montage von Multiproteinkomplexen erfordert biochemisch eine Art Fraktionierung Methode, die vollständig zusammengebaut Komplexe von Montage Zwischen- und Vorprodukte trennt. Aufgrund ihrer überlegenen Fähigkeit der Lösung, wurde nicht - denaturierenden Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) in der Fraktionierung der verschiedenen großen Multiproteinkomplexe besonders nützlich 14-17 erwiesen. Die Kombination von rekombinanten Archaea Proteasom Produktion und nicht denaturierenden PAGE hat sich zu einem leistungsfähigen Ansatz in dissectin werdeng Assemblierungsintermediate 9,11,12,18. Jedoch ist das übliche Verfahren , mit dem dieser Ansatz angewendet (dh. Über die rekombinante Koexpression von α und β - Untereinheiten) hat einen wichtigen Nachteil. Montage Reaktionen sind kooperativ und stark konzentrationsabhängig 3. Da die Proteinkonzentration innerhalb der Zellen ist sehr hoch 19, aufgrund ausgeschlossen Volumeneffekte, Montage Reaktionen verlaufen schnell in vivo. Daher ist es möglich, wichtige Assemblierungsintermediate wenn α und β-Untereinheiten koexprimiert werden zu verpassen.
Hier streiten wir für einen kombinierten Ansatz bei der Untersuchung von Assemblierungsintermediate rekombinanten Archaea Proteasom-Untereinheiten verwendet wird. In diesem Ansatz werden beide Koexpression und Lysat Mischverfahren eingesetzt. Erstere ermöglicht eine schnelle Analyse der Montage, da die Co-Expression weniger arbeitsintensiv ist. Letzteres hängt von getrennten Expression von α und β-Untereinheiten, gefolgt von Mischen. Obwohl dieser requires etwas mehr Aufwand als Koexpression, ist es mehr als kompensiert durch die Fähigkeit, Zwischenprodukte zu erfassen, die während der Coexpression verpasst werden. Zusammen können diese beiden Methoden, um ein vollständigeres Bild der Assemblierungsintermediate liefern.
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Protocol
1. Bakterielle Expression.
Anmerkung: Expressionsplasmide in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 1 beschrieben. Lösungen, Medien und Puffer in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 2 beschrieben. Die Klonierung von Archaea - Proteasom - Untereinheit - Gene und die Erzeugung von Expressionsplasmiden sind an anderer Stelle beschrieben 18,20. Kurz gesagt, Plasmide für die rekombinante Koexpression von Untereinheiten verwenden eine bizistronischen Operon - Strategie , die bei der Beschaffung von 18,20 vergleichbaren Expressionsniveaus der einzelnen Untereinheiten hilft. Die Expressions unten aufgeführten Parameter wurden empirisch bestimmt für die Proteasom-Untereinheiten in dieser Studie als optimal. Es kann notwendig sein Ausdruck für andere Proteasom-Mutanten zu optimieren, für Proteasomen aus anderen Archaea Arten oder für andere rekombinante Protein-Komplexe (siehe Diskussion).
- Verwandeln Expressionsplasmid von Interesse in chemisch kompetente E. coli BL21 (DE3) Zellen.
- In 1 bis 2 & mgr; l Plasmid (in der Regel 50 bis 100 ng) zu einem Aliquot von DE3-Zellen, die frisch auf Eis aufgetaut wurden, und weiter auf Eis für 20 Minuten inkubiert.
- Hitzeschock die Zellen bei 42 ° C für 45 s und das Rückrohr Eis für additionl 2 min.
- 1 ml LB-Medium und Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln (150 Upm) für 1 h.
- Verteilt 100-200 & mgr; l des Transformationsgemisch auf LB-kan-Platten (Platten, die festes LB-Medium, supplementiert mit Kanamycin (alle Plasmide, die in dieser Studie encode Resistenz gegen dieses Antibiotikum verwendet wird)). Die Platten bei 37 ºC O / N.
- Am nächsten Morgen, eine einzelne Kolonie von der LB-kan Platte in 3 ml flüssiges LB-kan Medien in einem Glaskulturröhrchen impfen. bei 37 ºC inkubieren unter Schütteln (150 rpm) für etwa 2,5 bis 3 h, oder bis die Trübung beobachtet.
- Messen der optischen Dichte der Kultur bei 600 nm (OD 600) in einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Zelle Kulture mit einer geeigneten Menge von vorgewärmtem LB-kan - Medium auf eine OD 600 von 0,4 in einem Endvolumen von 6 ml. Lebenslauf bei 37 ºC für 40 min schütteln.
- Induzieren die Proteinexpression in den Flüssigkulturen durch IPTG aus einer Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt wird. bei 37 ºC inkubieren unter Schütteln (150 rpm) für ca. 6 - 7 h.
- Ernte Bakterienzellkulturen in ihrer Gesamtheit in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- 1,5 ml einer Kultur in Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min.
- Überstand verwerfen und fügen Sie weitere 1,5 ml der gleichen Kultur zu dem Pellet. Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min.
- Wiederholen Sie Schritt 1.11, bis die gesamte Kultur in das Mikrozentrifugenröhrchen geerntet.
- Lagern Sie die induzierten Pellets bei -80 ° C bis Lyse.
2. Bakterienlyse und Lysate Mischen.
Hinweis: (dh überprüft er , dass Protein exprimiert wurde und löslich). Daher empfehlen wir dringend zunächst TSP Analyse. Sobald ein optimales Protokoll für eine bestimmte Untereinheit-Kombination erreicht worden ist, wird TSP Analyse nicht unbedingt erforderlich, weshalb er als optional weiter unten beschrieben wird.
- Lyse von Bakterienzellen und Herstellung von löslichen Fraktionen.
- Auftauen induzierte Zellpellet auf Eis für 5 min. Resuspendieren des Pellets in 600 & mgr; l Lyse-Puffer.
- IncUbate der Suspension bei 30 ºC unter Schütteln (150 Upm) für 30 min Gesamt Rohlysat zu erzeugen.
Hinweis: Der folgende Schritt und dem Unterabschnitt , die optional sind folgende. - Entfernen Sie die zwei 25 & mgr; l-Aliquots aus dem gesamten Rohlysat in getrennte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und führen TSP-Analyse wie folgt.
- Um einen der zwei 25 ul Aliquots, 5X SDS-Probenpuffer zu einer Endkonzentration von 1X hinzu. Das Röhrchen mit "T" für "total Rohlysat".
- Inkubieren Sie die "T" Probe bei 100 ºC für 5 Minuten, um vollständig Proteine denaturieren.
- Inzwischen nehmen Sie die zweite 25 - ul - Aliquot und bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert werden . Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne das winzige Pellet zu stören, und übertragen sie auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml. Beschriften Sie diese neue Röhre "S" für "lösliche Fraktion".
- Um die winzigen Pellet links behind im vorherigen Schritt, fügen Sie 25 ul Lysepuffer und Wirbel wieder zu suspendieren. Beschriften Sie diese Röhre "P" für "Pellet-Fraktion".
- In 6 ul 5X SDS-Probenpuffer auf die "S" und "P" Rohre und Inkubation bei 100 ° C, wie oben beschrieben.
Hinweis: Wenn die TSP Proben werden an diesem Tag nicht verwendet werden , um Expression zu analysieren, können sie bei -20 ° C eingefroren werden , bis sie benötigt werden . Einmal aufgetaut, müssen sie bei 100 ºC werden reinkubiert, wie oben beschrieben, unmittelbar vor dem Laden auf ein 12% und / oder 15% Standard-SDS-PAGE-Gel.
- Während die TSP - Analyse durchgeführt wird, Zentrifuge die restlichen 550 & mgr; l Gesamt Rohlysat für 10 min bei 10.000 × g (oder der gesamten 600 & mgr; l Gesamt Rohlysat wenn TSP Analyse nicht durchgeführt wird ). Sammeln Sie den Überstand in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Dies ist das lösliche Lysat, das zur Reinigung verwendet wird.
- Lysate Mischung.
- Führen Sie Lyse wie in den Schritten 2.1.1 und 2.1.2.
- Mischen Sie 600 & mgr; l der gesamten Rohlysat von Bakterien die gewünschte α-Untereinheit mit 600 & mgr; l der gesamten Rohlysat von Bakterien exprimiert das gewünschte β-Untereinheit exprimieren. bei 37 ºC inkubieren langsam mit Schütteln für 30 min.
Hinweis: Es kann notwendig sein , um die Inkubationszeit zu optimieren maximale Anordnung während des Lysats zu erreichen Mischen (siehe Diskussion). Die Zeit und die Temperatur hier vorgestellten sind optimal für die rekombinanten Proteine in dieser Studie und wurden an anderer Stelle 18 bestimmt. - Zentrifuge das gemischte Lysat bei 10000 × g für 10 min löslichem Material von unlöslichen Pellet zu trennen. Den Überstand in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie diese gemischten löslichen Lysat zur Proteinreinigung.
3. Proteinaufreinigung über immobilisiertem Cobalt Affinity Resin(ICH AUTO).
- Äquilibrieren des Harzes.
- Gründlich Resuspendieren des Harzes durch die Flasche Invertieren und Übertragung 50 & mgr; l der Aufschlämmung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 700 × g für 2 min zu Pellets Harz. Sorgfältig absaugen Überstand.
Hinweis: Wir führen Pipette Aspiration eine blaue 1 ml Pipettenspitze mit der Masse der Flüssigkeit zu entfernen. Eine weiße 2 ul Spitze wird zur Feinsteuerung der Entfernung des verbleibenden Überstand verwendet, um eine sehr dünne Schicht aus flüssigem verlassen die Perlen bedeckt. - 1 ml Puffer A Mix sanft zu resuspendieren Harz und Zentrifuge bei 700 × g für 2 min Harz zu pelletieren. aspirieren vorsichtig den Überstand und wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal.
- Gründlich Resuspendieren des Harzes durch die Flasche Invertieren und Übertragung 50 & mgr; l der Aufschlämmung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 700 × g für 2 min zu Pellets Harz. Sorgfältig absaugen Überstand.
- Anwenden zuvor erhaltenen löslichen Lysat in Abschnitt 2.1 oder 2.2 auf die äquilibrierte Harz. Inkubieren Sie die Röhrchen mit leichter Rotation bei 4 ° C für 60 min. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g </ Em> für 5 min und den Überstand vorsichtig absaugen.
- Das Harz wird als nicht-spezifisch gebundene Proteine zu entfernen, folgt.
- Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer A und Inkubation mit sanftem für 10 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal.
- Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer B (Puffer A mit 5 mM Imidazol) und Inkubation mit sanftem für 5 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal.
- Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer C (Puffer A mit 10 mM Imidazol) und Inkubation mit sanftem für 5 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand.
- Eluieren des Proteins durch Zugabe von 400 ul Puffer E (Puffer A mit 200 mM Imidazol) to das Harz. Inkubieren mit sanften bei 4 ° C für 5 min zu schaukeln. Zentrifuge bei 700 × g für 5 min.
- Übertragen Überstand mit gereinigtem Protein in ein neues 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
- Desalt das gereinigte Protein durch serielle Zentrifugation wie folgt.
- Bis 400 & mgr; l gereinigtes Protein, mit 100 & mgr; l Puffer A (dies reduziert Imidazole Konzentration von 200 mM bis 160 mM). Anwenden gereinigtem Protein auf 0,5 ml Ultrazentrifugalmühle Filter mit einem 10 kDa Molekulargewicht cut-off. Zentrifuge bei 14000 × g für 5 min.
- Entsorgen Sie das Filtrat und fügen 400 ul Puffer A des Retentats und Zentrifuge wieder zu verdünnen. Weiter die Zyklen der Zentrifugation / Verdünnung bis Imidazolkonzentration unter 4 mm fällt. Als ein Beispiel, wenn jede Zentrifugierung 500 ul konzentriert bis auf ~ 70 & mgr; l (oder ca. 7-fach), dann zwei Zyklen des Ausgangs 160 mM Imidazol-Konzentration (7 × 7 = 49-fach) reduzieren auf ca.oximately 3,3 mM.
- Messung der Proteinkonzentration der entsalzte Probe unter Verwendung des BCA - Assay 21.
Anmerkung: Die Entsalzung erforderlich Imidazole Ebenen unter der Toleranzgrenze für den BCA - Assay zu reduzieren, wie in der Anleitung des Herstellers beschrieben. Unser Labor bevorzugt den BCA-Assay, da sie empfindlich ist, hat einen großen dynamischen Bereich und zeigt deutlich weniger Protein-zu-Protein-Variante. Jedoch können andere Verfahren der Proteinkonzentration zu bestimmen, kann für die BCA-Assay ersetzt werden. Der Schlüssel ist, der jedes Methoden Vorteile und Grenzen zu beachten.
- In 5X nativen Probenpuffer auf eine Endkonzentration von 1X und fahren Sie mit der Elektrophorese. Alternativ Proben bei -20 ° C für eine spätere Analyse.
4. nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE).
Achtung: Unpolymerisiertes Acrylamid ist ein Neurotoxin. Tragen Sie geeignete Schutz gear.
- Bereiten Sie die nicht-denaturierenden PAGE-Gel wie folgt.
- Bereiten Sie die Gel-Kassette für die Verwendung von sauberen Glasplatten Gießen und Gießen stehen. Platzieren Sie Steigung Hersteller auf der Spitze eines kleinen Magnetrührer und legen Sie eine kleine Rührstab in jede Kammer.
- Unter Verwendung von 40% (w / v) Acrylamid und 2% (w / v) Bisacrylamid-Stammlösungen, bereiten 5% und 10% (w / v) Acrylamid-Gel-Lösungen in einem nativen Auflösungspuffer. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von Gesamt Acrylamid zu Bisacrylamid beträgt 37,5: 1. Chill auf Eis vor dem Gießen.
Anmerkung: Die nicht - denaturierenden PAGE - System verwendet dabei im wesentlichen identisch mit dem Laemmli SDS-PAGE - System ist, mit SDS 22 weggelassen. - Hinzufügen Ammoniumpersulfat (von einer 10% (w / v) Stammlösung in Wasser hergestellt) mit den Acrylamidlösungen Polymerisation zu initiieren. Endkonzentration Ammoniumpersulfat 0,1% (w / v).
- Gießen Sie die Acrylamid-Lösungen in den beiden Kammern des Gradienten ausgestattet. Mit dem Ablaufschlauch eingeführt bwischen die Platten der Gel-Kassette, aktivieren Sie den Magnetrührer und die Gradienten-Hersteller Ventile öffnen. Gießen Sie mit dem 5 - 10% nicht-denaturierenden Gradienten-Gel.
- Einmal gegossen, überlagern das Gel mit einer dünnen Schicht aus Isopropanol und erlauben das Gel für 30 min zu polymerisieren. Während dieser Zeit, bereiten Sie frisches 5% Acrylamid-Gel-Lösung in nativen Lösung Puffer. Nachdem das Gel-Sets, gießen Isopropanol aus und die Spitze des Gels mit VE-Wasser aus einer Spritzflasche spülen.
- Zum 5% Gel-Lösung oben hergestellt, fügen Ammoniumpersulfat (genau wie in 4.1.3 beschrieben) und gießen Sie auf der Oberseite des polymerisierten Gels bis Glasplatten voll sind. Legen Sie Gelkamm. Erlauben es dem überlagerten Gel für weitere 30 min zu polymerisieren.
- Sobald Gel polymerisiert wird, Gel-Kassette in Elektrophorese-Vorrichtung montieren. Alternativ speichern Sie das Gel bei 4 ° C, für den Einsatz in angefeuchteten Papiertüchern und Plastikverpackung, bis sie bereit gewickelt.
- Sobald nicht denaturierenden PAGE-Gel in elec zusammengebauttrophorese Gerät, füllen den Tank mit 1X nativen Laufpuffer frisch zubereitet von einem 10fach nativen Laufpuffer Lager.
- Last 10 ug gereinigtes Protein, am Ende des Abschnitts 3 erhalten, in jedes Well ein Glas Spritze.
- Last 2 & mgr; l mit hohem Molekulargewicht native Protein-Standard (verdünnt in 1X nativen Laufpuffer) in einem der Brunnen.
- Führen Gel bei 55 V und 4 ° C, bis die Farbstofffront läuft das Gel aus (ca. 4-4,5 h).
- Zusätzlich zu dem nicht - denaturierenden Gel, Analyse Aliquots des gereinigten Proteins , das durch Standard - SDS-PAGE 22.
- Mischungs Aliquots (10 & mgr; g) der gereinigten Proteinproben, am Ende der Sektion 3 erhalten, mit 5X-SDS-Probenpuffer zu einer Endkonzentration von 1X.
- 5 min bei 100 ºC inkubieren und auf Standard - 12% und / oder 15% SDS-PAGE - Gelen 22 laden.
- für 20 Minuten bei 80 V laufen und dann bei 120 V, bis die Farbstofffront das Gel läuft weg (das ist etwa ein Additional 75 min für eine 12% Gel und 120 min für eine 15% Gel).
5. Visualizing Aktivität und Protein-Färbung.
- Nach der Elektrophorese sorgfältig getrennte Glasplatten und übertragen Sie die nicht-denaturierenden Gel auf eine Gelträger, der 50 ml VE-Wasser. Spülen Sie Gel mit sanfter 5 min zu schaukeln. Entsorgen Sie Wasser und wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal.
- Führen Substrat Overlay-Assay wie folgt.
- 1 mL Puffer für die Entwicklung des fluorogenen Peptidsubstrats Suc-LLVY-AMC enthält und verteilt gleichmäßig über das Gel. für 30 min bei 37 ºC inkubieren.
Hinweis: Ein Glasstab oder ein Gel Ausrücker (kleinen Keil aus Kunststoff zur getrennten Glasplatten verwendet wird ) verwendet werden kann , um die Flüssigkeit auf das Gel zu verteilen. - übertragen Sie vorsichtig das Gel auf den UV-Transilluminator des Gels Abbildungssystem und beobachten Fluoreszenz aufgrund der gespaltenen Peptidsubstrats. Nehmen Bild. übertragen Sie vorsichtig die Gel back zur Gelträger.
- Spülen Sie das Gel zweimal mit 50 ml VE-Wasser für 5 min unter leichtem Schütteln.
- Beflecken das Gel mit 10 ml einer kolloidalen Coomassie-Färbung Reagenz für 60 min unter leichtem Schütteln. Entfärben Gel mit 50 ml Wasser, bis Hintergrund wird klar. Diese Färbung Schritt gilt für die Standard-SDS-PAGE-Gelen als auch.
- 1 mL Puffer für die Entwicklung des fluorogenen Peptidsubstrats Suc-LLVY-AMC enthält und verteilt gleichmäßig über das Gel. für 30 min bei 37 ºC inkubieren.
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Representative Results
Assemblierungsintermediate (Abbildung 1) beginnt , wenn alpha - Untereinheiten zu bilden Ringe 9 zu kombinieren. Dies kann veranschaulicht werden , wenn & agr; -Untereinheiten von der archaeon Methanococcus maripaludis S2 in E. coli exprimiert werden , wie C-terminal Hexahistidin - markierte (His-tagged) -derivate (Tabelle 1). Wenn die rekombinante α-His - Protein durch ICAR und analysiert wurde gereinigt durch nicht - denaturierende PAGE, zwei Banden beobachtet (2A, Spur 1). Wir haben bereits gezeigt , dass diese entsprechen Einzel α Ringe (SR) und Doppel - α-Rings (DR) 18. Die DR ist eine Sackgasse Arten , die nicht produktiv für die spätere Montage 9,18 ist.
Wenn & agr; -Untereinheiten-His wurden mit β-Untereinheiten koexprimiert, das übliche Verfahren darstellt, durch die Anordnung von rekombinantem archaeal Proteasomen getestet wird, wurde eine neuartige Spezies beobachtet in der Nähe des 670 kDa Größe Stand der Migrationard (2A, Bahn 3). Diese Art war proteolytisch aktiv (2B, Spur 3) und enthielt nur vollständig reifen β - Untereinheiten (mβ) , deren Propeptide entfernt worden sind (2C, Spur 3). Diese Art ist die voll ausgereift CP. Diese Probe enthielt auch einige SR-Arten, die erwartet wurde, weil SR eine bekannte Montagezwischen, aber keine DR-Spezies ist. Der Mangel an DR , wenn a-sein und ß - Untereinheiten schlägt koexprimiert , dass eine korrekte Montage auftrat schnell genug ist, so daß der Einbau von β - Untereinheiten der Lage war , die unproduktive Bildung von DR zu outcompete (18 für eine detailliertere Darstellung).
Um die Begrenzung der Koexpression Verfahren demonstrieren und sprechen für die Brauchbarkeit eines kombinierten Ansatzes α-his und & bgr; -Untereinheiten wurden separat in E. coli exprimiert. Nach der Lyse wurden die löslichen Fraktionen gemischt und Proteine durch ICAR gereinigt wurden vor derAnalyse von nicht-denaturierenden PAGE. Voll funktions Proteasomen wurden auch über das Lysat Mischungsansatz (2A und 2B, Spur 2) erzeugt und die SR - Spezies wurde auch als erwartet beobachtet. Das Wiederauftreten der DR Spezies in der Lysatprobe Mischen zeigt an, dass einmal gebildet, β-Untereinheiten nicht in der Lage sind, um es reversibel zu zerlegen; Dies unterstreicht die Sackgasse Natur des DR. Interessanterweise ist eine neue Art erschien auch in der Probe Lysat Mischen, direkt unterhalb des CP Migration (bezeichnet als "halbe"). Vor kurzem haben wir gezeigt , dass diese Art der Halb Proteasom entspricht (alpha 7 β 7) 18. Um dies zu veranschaulichen dabei eine β-Untereinheit-Mutante (R166W) wurde verwendet. Diese Mutation stört β-β - Ring - Interaktion, 18 zu einer Beeinträchtigung der Halb Proteasomen Dimerisierung führt. Da Halb Proteasomen die unmittelbaren Vorläufer zu CP sind, sollte die R166W Mutation sowohl Ansammlung von Halb Proteasomen ein führenda Abnahme der CP-Bildung. Wenn Lysats mit α-his und β (R166W) -Untereinheiten Mischen wurde durchgeführt, geringere Mengen an CP und erhöhte Niveaus der "halben" Spezies beobachtet (2A, Spur 4). Dies ist mit einem Vorläufer-Produktbeziehung für diese zwei Bänder konsistent und bestätigt die Identität der "halben" Spezies wie der Halb Proteasom. Die etwas schnellere Migration des Halb Proteasom in der Mutante Probe (Spur 4 gegenüber Spur 2) dürfte aufgrund der R166W Mutation Veränderung der Masse-Ladungs-Verhältnis der β-Untereinheit.
Die Fähigkeit, die Halb Proteasom während Lysat Mischen zu visualisieren, wie den hohen Proteinkonzentrationen in Zellen verglichen hauptsächlich auf viel niedrigeren Proteinkonzentrationen im Lysat. Niedrigere Konzentrationen führen zu weniger effizient (dh langsamer) Montage, die Zwischenprodukte ermöglicht bevölkerten zu werden und somit nachweisbar. Neben dem Erscheinen des Halb Proteasom, eine zusätzliche Beobachtung unterstreicht die verminderte Montageeffizienz während Lysat Mischen: nicht verarbeitete β-Untereinheiten, die ihre Propeptide behalten, werden nachweisbar (proβ). Da Propeptid Verarbeitung bis Halbproteasomen dimerisieren nicht auftritt, korreliert das Aussehen des unreifen proβ Form mit dem Niveau der Halb Proteasom Akkumulation (vergleiche 2C, Spur 3 im Vergleich zu Spur 2 im Vergleich zu Spur 4). Im Falle der Mutante R166W, ist die Propeptid-Verarbeitungsfehler während Lysat Mischen absolute obwohl eine kleine Menge von CP bildet. Dies liegt daran , Propeptid Verarbeitung erfordert nicht nur Halb Proteasom Dimerisierung, aber auch eine einwand gebildete β-β - Ring - Schnittstelle 23 , die die Mutation R166W leisten nicht. Eine ausführlichere Erzählung von Co - Expression im Vergleich zu Lysat Mischen, wie es um rekombinante Assemblierungsintermediate betrifft, gibt es hier 18 gefunden.
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Abbildung 1: ein vereinfachtes Schema Kernteilchen (CP) Versammlung.
Die α-Untereinheiten kann in einem einzigen α-Ring montieren erste (SR), die für den Einbau von β-Untereinheiten als Vorlage dient. Dies führt zur Erzeugung des Halb Proteasom-Zwischenprodukt (die Hälfte), die rasch dimerisiert. Gleichzeitig mit Dimerisierung werden die β-Untereinheit Propeptide (nicht gezeigt) mit dem voll funktionsfähigen Kernteilchen (CP) BEGRÜNDE autokatalytisch entfernt. Doppel α-Ringe (DR) von SR entstehen und sind nicht zuständig für die Montage in CP. Ihre Bildung stellt eine unproduktive Montage Weg (gestrichelte Pfeil) im Gegensatz zu produktiven Montage Ereignisse (durchgezogene Pfeile). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Ein kombinierter Ansatz zur Untersuchung von Proteasom Versammlung.
Coexpression (C) und Mischen Lysat (L) wurden M. maripaludis studieren Montage von rekombinantem Proteasomen aus dem archaeon eingesetzt. Die Proteine wurden gereinigt durch immobilisierte Cobalt Affinitätsharz (ICAR). (A, B) Gereinigte Proteine (10 ug) wurden geladen auf nicht denaturierenden von 5 bis 10% Gradienten - Gelen. Nach der Elektrophorese wurde Peptidase - Aktivität sichtbar gemacht, indem das Gel mit Pufferlösung , die über der fluorogenes Peptidsubstrat Suc-LLVY-AMC (B) vor dem Färben des Gels mit kolloidalem Coomassie - Färbung Reagens (A) enthält. Schwarze Pfeile bezeichnen die Positionen der zusammengebauten 20S Kernteilchen (CP), Halb Proteasom Zwischen (die Hälfte), Doppel-α-Ring (DR) und einzelne α-Ring (SR). Die Migration von mehreren molekularen Größenstandards (in kDa) ist rechts angegeben. (C) A wurden auf 15% SDS-PAGE - Gele geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit einem kolloidalen Coomassie-Färbung Reagens gefärbt. Migration von α-Untereinheit sein und voll ausgereift (mβ) und unreife (proβ) β-Untereinheiten angezeigt. Die Position des 25 kDa Molekulargrößenstandard ist rechts dargestellt. Asterisk zeigt eine abgeschnittene α-Untereinheit sein Fragment von unspezifischen Proteolyse während der Lyse führt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Plasmid | Genotyp | Quelle |
| AKB191 | pET42 PSMA-his | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB464 | pET42 PSMA-his psmB | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB946 | pET42 psmB | Panfair et al., (2015) |
| AKB952 | pET42 psmB (R166W) | Panfair et al., (2015) |
Tabelle 1: Bakterienplasmiden in dieser Studie verwendet. PSMA ist die Archaea-α-Untereinheit-Gen und psmB ist die Archaea-β-Untereinheit-Gens.
| Puffer A | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2. | Puffer B, C, und E, sind Derivate von Puffer A, enthaltend Imidazole. Es ist nützlich, Imidazole aus einer 2 M Lager vorbereitet in Wasser und im Dunkeln aufbewahrt hinzuzufügen. |
| Native Lösung Puffer | 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% (v / v) tetramethyl-Ethylendiamin (TEMED) und 0,1% (w / v) Ammonium Perulfate (APS). | Frisch zubereitet nicht mehr als eine Stunde vor dem Gel polymerisiert werden soll, und auf Eis gehalten. Wenn Acrylamidgel Herstellung von Lösungen in der nativen Lösung Puffer, ist es nützlich, die Tris-HCl aus einem 4X Lager (1,5 M Tris-HCl, pH-Wert 8,8) hinzuzufügen. Der APS zugegeben unmittelbar vor der Polymerisation. |
| Mutterlaufpuffer 10X Lager | 250 mM Tris, 1,92 M Glycin, nicht einstellen pH-Wert. | |
| 5X nativen Probenpuffer | 0,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 50% (v / v) Glycerol, Spuren von Bromphenolblau. | Spuren bezieht sich auf eine sehr kleine Menge, in der Regel ein paar Körner über Spatel überführt. |
| 5X SDS-Probenpuffer | 0,3 M Tris-HCl, pH 6,8, 600 mM Dithiothreitol (DTT), 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) Glycerin und Spuren von Bromphenolblau. | Spuren bezieht sich auf eine sehr kleine Menge, in der Regel ein paar Körner über Spatel über. |
| Die Entwicklung Puffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 1 mM ATP, 50 mM Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC ist ein fluorogenes Peptidsubstrat verwendet Proteasom-Aktivität zu untersuchen. |
Tabelle 2: Lösungen, Medien und Puffer in dieser Studie verwendet.
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Discussion
Wir zeigen den Nutzen eines kombinierten Ansatzes Assemblierungsintermediate zur Analyse von PAGE unter Verwendung von rekombinanten Archaea Proteasomen nicht denaturierenden. Die übliche Methode 9,11 von bakteriellen Co - Expression von Proteasom - Untereinheiten ermöglicht eine schnelle Analyse kann aber keine Schlüssel Assemblierungsintermediate offenbaren. Wir schlagen vor, die Kombination von Co-Expression mit Lysat Mischen ein umfassenderes Bild von Montage Ereignisse zu entwickeln.
Der Vorteil dieses kombinierten Ansatzes ist, dass trotz erfordern getrennte Expression der α und & bgr; -Untereinheiten für Lysat Mischen, ist es noch relativ arbeitsfreundlich. Die Ergebnisse können auch semiquantitative sein, wenn man vergleichbarer und Expressionsniveaus der einzelnen Proteine gewährleistet. Zu diesem Zweck wird empfohlen, führen wir die übliche Optimierung der Expression rekombinanter Proteine aus Bedingungen zu bestimmen, die vergleichbare Mengen an exprimierten Proteinen Mischens vor Lysat ermöglichen. Die Optimierung kann unterschiedlichen Induktions tim umfassene, Induktionstemperatur, optische Dichte bei Induktion, bakterielle Expressionsstamm, und so weiter, bis die gewünschte Niveaus an löslichem Protein erreicht werden. Dies ist besonders wichtig, wenn WT und Mutanten-Versionen eines Proteins zu vergleichen, weil manchmal die Mutante vergleichbare Expressionsniveaus aufweisen können, aber verringerte Löslichkeit. Wir zeigen auch die Bedeutung Proteinkonzentrationen der ICAR reinigten Proben vor dem Laden der nicht-denaturierenden PAGE zu bestimmen. Auch mit der Expression-Optimierung statt, und mit der besten Sorgfalt, um sicherzustellen, dass parallel Proben durch die Reinigungsschritte in der gleichen Weise verarbeitet werden, Varianz noch versehentlich eingeführt werden kann. Eine Konzentrationsmessung gewährleistet, daß die gleiche Menge an Gesamtprotein ist gut pro Probe geladen. Dies macht Spur-zu-Spur-Vergleiche der Bandenintensitäten für eine gegebene Zugvogelarten aussagekräftiger.
Wenn vergleichbar und ein einheitliches Niveau der Proteinexpression kann nicht für lysa erreicht werdente Durchmischung, kann man immer alle Komponenten reinigen vorher und führen Experimente mit reinen Proteinen zu mischen. Dies hat den Vorteil einer genaueren Proteinbestimmungen ermöglicht und somit macht den Ansatz quantitativ. Jedoch ist der Nachteil einer vollständigen Reinigung dass der Prozess wesentlich arbeitsintensiv wird, die schnelle Analyse von Mehrfachmutanten gleichzeitig 18 ausschließen können. Eine letzte Einschränkung ist erwähnenswert, dass manchmal die Expression von α trennen, und & bgr; -Untereinheiten kann nicht möglich sein. Dies kann auftreten , wenn eine Mutation verursacht eine Untereinheit in E. coli unlöslich zu sein , wenn sie auf seine eigene ausgedrückt erlaubt aber Löslichkeit wiedergewonnen werden , wenn die Mutante mit seinem Bindungspartner exprimiert wird. Wenn dies der Fall ist, wird es Analyse beschränken sich nur auf die Coexpression. Dies ist jedoch eine Einschränkung , die während rekombinanter Proteinexpression im allgemeinen auftreten können, und ist für archaeal Proteasom - Untereinheiten 24,25 nicht spezifisch.
Wir wählten generate his-markierte Derivate unserer proteasomaler Proteine aufgrund von Reinigung und Erschwinglichkeit des ICAR Harz zu erleichtern. Andere Epitopmarkierungen möglich sind, die für Antikörper-basierte Reinigungs einschließlich, und wir haben erfolgreich exprimiert und gereinigt FLAG-markierten Versionen der Proteasom-Untereinheiten (nicht gezeigt). wenn die Reinigung bis zur Homogenität jedoch (oder den Umfang der Produktion zu erhöhen), die erforderlich ist, die seine markierten Versionen bieten die schnellste und kostengünstiges Mittel, dies zu tun.
Es ist eine Selbstverständlichkeit , dass die Ergebnisse mit rekombinanten Proteinen erhalten, werden sie Archaea oder eukaryotische in Bakterien produzierte Proteine, gewinnen weiter , wenn sie mit in vivo Beobachtungen weiterverfolgt Bedeutung. Eine in vivo - Ansatz nicht immer jedoch sofort zugänglich experimentell. Dies gilt insbesondere, wenn der Untersuchungsgegenstand ist ein großes, komplexes Multiunter wie das Proteasom. Recombinant Protein Ansätze für futu einen wichtigen Startpunkt bietenre Experimente. Im Falle des Proteasoms, mit nicht - denaturierenden PAGE wird rekombinante Archaea Proteasom Produktion Paarung weiterhin beim Aufklären der wichtigsten Features von Assemblierungsintermediate sehr wirksam zu sein, die 9,11,12,18 zwischen Archaea und eukaryotischen Spezies geteilt werden. Ein solcher Ansatz ist wahrscheinlich auch für die Untersuchung der Montage von anderen großen Multiproteinkomplexen nützlich. Vor kurzem haben wir diese Strategie zu demonstrieren , dass Archaea Proteasomen über mehr als einen Stoffwechselweg montieren kann, und dass α-Ringe sind nicht die obligate Zwischenprodukte bei der Montage , die sie gedacht wurden 18 sein. Es bleibt abzuwarten, ob das gleiche gilt für die eukaryotische Proteasomen hält.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Research Support Funds Grant (RSFG) von der Indiana University-Purdue University, Indianapolis, und teilweise durch eine Auszeichnung von der American Heart Association 14GRNT20390154, zu ARK unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
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