Summary
Este protocolo utiliza tanto la co-expresión de subunidades y de mezcla para un examen más a fondo de ensamblaje proteasoma subunidad recombinante postlysis.
Abstract
Proteasomas se encuentran en todos los ámbitos de la vida. Ellos proporcionan la principal vía de degradación de proteínas intracelulares en las células eucariotas, aunque su montaje no se conoce completamente. Todos los proteasomas contienen una partícula estructuralmente conservadas núcleo (CP), o proteasoma 20S, que contiene dos anillos de subunidades beta heptameric emparedadas entre dos anillos α subunidad heptameric. Archaeal proteasomas 20S son de composición más simple en comparación con sus homólogos eucariotas, sin embargo, que ambos comparten un mecanismo de montaje común. En consecuencia, arqueas proteasomas 20S siguen siendo modelos importantes para el montaje del proteasoma eucariota. En concreto, la expresión recombinante de 20S arqueas proteasomas junto con electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante (PAGE) ha dado muchas pistas importantes sobre la biogénesis del proteasoma. A continuación, se discute un medio para mejorar la estrategia habitual de la co-expresión de α del proteasoma arqueas y las subunidades ß antes de nondenaturiPÁGINA ng. Se demuestra que a pesar de la rápida y eficiente, un enfoque coexpresión solo puede faltar montaje intermedios clave. En el caso de la proteasoma, la coexpresión no puede permitir la detección de la media-proteasoma, una que contiene una α-anillo completo intermedia y una β-anillo completo. Sin embargo, este intermedio se detecta fácilmente mediante la mezcla de lisado. Sugerimos que la combinación de co-expresión con mezcla lisado se obtiene un enfoque que es más profundo en el análisis de montaje, sin embargo, sigue siendo no intensiva de trabajo. Este enfoque puede ser útil para el estudio de otros complejos multiproteicos recombinantes.
Introduction
Complejos multiproteicos llevan a cabo numerosas actividades celulares críticas 1. Para muchos de estos complejos, se sabe mucho más acerca de su estructura y la función de aproximadamente el 2,3 de su montaje. El proteasoma es uno tan complejo y se encuentra en todos los ámbitos de la vida. En eucariotas, esta máquina molecular está en el núcleo del sistema de proteasoma / ubiquitina (UPS) y proporciona la principal vía de degradación de proteínas intracelulares 4. El proteasoma eucariota (referido como el proteasoma 26S) se compone de dos conjuntos principales sub: un proteasoma 20S, o núcleo de la partícula (CP) 5, que puede ser un tope en uno o ambos extremos por una partícula de regulación de 19S (RP) 6.
El proteasoma 20S es un gran proteasa compartimentada. Su estructura cuaternaria se conserva absolutamente en todos los dominios de la vida y consiste en una pila de cuatro ciclos de siete miembros que contienen dos tipos de subunidades relacionadas estructuralmente, α; y ß 5,7,8. En eucariotas, los dos anillos exteriores están cada uno compuesto de siete subunidades alfa diferentes y los dos anillos interiores están cada uno compuesto de siete subunidades beta distintas; actividad proteolítica reside dentro de tres de las subunidades beta. Por el contrario, los anillos Cp de arqueas y bacterias normalmente se componen de un solo tipo de α y un tipo de subunidad β. Proteasomas arqueas han proporcionado un importante sistema modelo para estudiar el montaje del proteasoma tanto por su simplicidad compositiva y su compartir un mecanismo de ensamblaje común con sus homólogos eucariotas 9-13. En breve, las subunidades alfa ensamblan en anillos alfa primero, que sirven como un andamio sobre el que beta subunidades de montar. Las medias proteasomas resultantes (α 7 β 7) dimerize, dando lugar a ensamblados completamente CP (α β 7 7 7 β α 7). Durante la dimerización, los propéptidos presentan en subunidades ßse eliminan autocatalítica, la exposición de las treoninas N-terminales catalíticos. El uso de proteasomas arqueas para modelar ensamblaje tiene con frecuencia las ventajas de la producción de proteínas recombinantes del proteasoma archaea en Escherichia coli. Este es un enfoque valioso porque permite a las subunidades que se producen en diversas combinaciones, ya que ambos WT y versiones mutantes, en un organismo huésped que no produce sus propios proteasomas.
El control de la asamblea de varios complejos de proteínas bioquímicamente requiere algún tipo de método de fraccionamiento que separa los complejos totalmente ensamblados de montaje intermedios y precursores. Debido a su capacidad de resolver superior, no desnaturalizante de poliacrilamida electroforesis en gel (PAGE) ha demostrado ser especialmente útil en el fraccionamiento de diversos grandes complejos multiproteicos 14-17. La combinación de la producción del proteasoma arqueas recombinante y PÁGINA desnaturalizante se ha convertido en un poderoso enfoque en dissecting ensamblaje proteasoma 9,11,12,18. Sin embargo, el método habitual por la que se aplica este enfoque (es decir. A través de la co-expresión recombinante de subunidades alfa y beta) tiene un inconveniente importante. Las reacciones de ensamblaje son cooperativas y fuertemente dependiente de la concentración 3. Dado que la concentración de proteínas dentro de las células es muy alta 19, debido a los efectos de volumen excluidos, reacciones de montaje se efectúen rápidamente in vivo. Por lo tanto es posible que se pierda importantes intermedios de montaje cuando se coexpresan alfa y beta subunidades.
Aquí, argumentamos a favor de un enfoque combinado en el estudio del conjunto de proteasoma utilizando subunidades del proteasoma arqueas recombinantes. En este enfoque, se emplean dos métodos de mezcla coexpression y lisado. El primero permite el análisis rápido de montaje debido a la coexpresión es menos mano de obra. Esta última depende de la expresión separada de alfa y beta subunidades, seguido de mezcla. Aunque este requires un poco más esfuerzo que la co-expresión, es más que compensada por la capacidad de detectar intermedios que se pierden durante la co-expresión. Juntos, estos dos métodos pueden proporcionar una imagen más completa del conjunto del proteasoma.
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Protocol
1. Expresión bacteriana.
Nota: Los plásmidos de expresión utilizados en este estudio se describen en la Tabla 1. Soluciones, los medios y tampones utilizados en este estudio se describen en la Tabla 2. La clonación de genes de la subunidad del proteasoma archaeal y la generación de plásmidos de expresión se describen en otro 18,20. En resumen, los plásmidos de coexpresión recombinante de subunidades emplean una estrategia operón bicistrónico que ayuda en la obtención de niveles de expresión comparables de subunidades individuales 18,20. Los parámetros de expresión se indican a continuación fueron determinada empíricamente para ser óptimo para las subunidades del proteasoma en este estudio. Puede ser necesario para optimizar la expresión de otros mutantes del proteasoma, por proteasomas de otras especies archaeal, o para otros complejos de proteína recombinante (ver Discusión).
- Transformar el plásmido de expresión de interés en químicamente competentes de E. coli BL21 (DE3) células.
- Añadir 1 - 2 l de plásmido (típicamente de 50 - 100 ng) a una alícuota de células DE3 que estaban recién descongelado en el hielo, y continúe a incubar en hielo durante 20 min.
- choque térmico de las células a 42ºC durante 45 s y el tubo de retorno de hielo durante 2 min additionl.
- Añadir 1 ml de medio LB y se incuba a 37 ° C con agitación (150 rpm) durante 1 h.
- Spread 100-200 l de la mezcla de transformación sobre LB-kan placas (placas que contienen medio sólido LB, suplementado con kanamicina (todos los plásmidos utilizados en este estudio resistencia codificar a este antibiótico)). Incubar las placas a 37 ºC O / N.
- A la mañana siguiente, inocular una única colonia de la placa de LB-kan en 3 ml de medio LB-kan líquido en un tubo de cultivo de vidrio. Incubar a 37 ºC con agitación (150 rpm) durante aproximadamente 2,5 a 3 h, o hasta que se observa turbidez.
- Medir la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD 600) en un espectrofotómetro. Diluir el culto celularUre con una cantidad apropiada de medio LB precalentada-Kan a un OD 600 de 0,4 en un volumen final de 6 ml. Reanudar la agitación a 37 ºC durante 40 min.
- Inducir la expresión de proteínas en los cultivos líquidos mediante la adición de IPTG a partir de una solución madre a una concentración final de 1 mM. Incubar a 37 ºC con agitación (150 rpm) durante aproximadamente 6-7 h.
- Cosechar cultivos de células bacterianas en su totalidad en tubos de 1,5 mL microcentrífuga.
- Añadir 1,5 ml de un cultivo en tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min.
- Eliminar el sobrenadante y añadir otros 1,5 ml de la misma cultura de la pastilla. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min.
- Repita el paso 1.11 hasta que todo el cultivo se recoge en el tubo de microcentrífuga.
- Almacenar los pellets inducidos a -80 ° C hasta su lisis.
2. bacteriana de lisis y el lisado de mezcla.
Nota: (es decir, se verifica que la proteína se expresó y soluble). Por lo tanto, es muy recomendable que incluye el análisis de TSP inicialmente. Una vez que un protocolo óptimo se ha logrado una combinación de subunidades particular, el análisis TSP no es estrictamente necesario por lo que se describe como opcional a continuación.
- La lisis de las células bacterianas y la preparación de fracciones solubles.
- Descongelar el pellet de células inducida en hielo durante 5 min. Resuspender el precipitado en 600 l de tampón de lisis.
- CªUbaté la suspensión a 30 ° C con agitación (150 rpm) durante 30 min para generar lisado bruto total.
Nota: En el siguiente paso, y la subsección que sigue son opcionales. - Retire los dos 25 alícuotas del lisado total de crudo en 1,5 ml tubos de microcentrífuga separados y llevar a cabo análisis de TSP de la siguiente manera.
- Para uno de los dos 25 alícuotas, añadir tampón de muestra SDS 5X a una concentración final de 1X. Etiquetar el tubo con "T" para "lisado total de crudo".
- Incubar la muestra "T" a 100 ºC durante 5 minutos para desnaturalizar las proteínas por completo.
- Mientras tanto, tomar la segunda alícuota de 25 l y centrifugar a 10.000 x g durante 10 minutos. Retirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento pequeña, y la transfiere a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Etiqueta este nuevo tubo "S" para "fracción soluble".
- Para los BEHI pequeña pellet izquierdand en el paso anterior, se añaden 25 l de tampón de lisis y vórtice para resuspender. Etiquetar este tubo "C" de "fracción de sedimento".
- Añadir 6 tampón de muestra l de 5X SDS a los tubos y "S" "P" y se incuba a 100 ºC como se describe anteriormente.
Nota: Si las muestras TSP no serán utilizados ese día para analizar la expresión, pueden ser congeladas a -20 ° C hasta que se necesite. Una vez descongelado, se deben volvieron a incubar a 100 ºC, como se describió anteriormente, inmediatamente antes de la carga en un gel de SDS-PAGE estándar 12% y / o 15%.
- Si bien el análisis se lleva a cabo TSP, centrifugar los restantes 550 l de lisado bruto total (o la totalidad de los 600 l de lisado bruto total si el análisis TSP no se lleva a cabo) a 10.000 x g durante 10 minutos. Recoger el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml frescos. Este es el lisado soluble que se utilizará para la purificación.
- mezcla lisado.
- Llevar a cabo la lisis tal como se describe en los pasos 2.1.1 y 2.1.2 anteriores.
- Mezclar 600 l de lisado bruto total a partir de bacterias que expresan la subunidad α deseado con 600 l de lisado bruto total a partir de bacterias que expresan la subunidad β deseado. Incubar a 37 ºC con lenta agitación durante 30 min.
Nota: Puede que sea necesario para optimizar el tiempo de incubación para lograr la máxima asamblea durante la mezcla lisado (ver Discusión). El tiempo y la temperatura que se presenta aquí son óptimas para las proteínas recombinantes en este estudio y se determinaron en otro lugar 18. - Centrifugar el lisado de mezclado a 10.000 x g durante 10 min para separar el material soluble del sedimento insoluble. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Utilice este lisado soluble mixto para la purificación de proteínas.
3. Purificación de la proteína a través de inmovilizada Cobalt Affinity Resin(ICAR).
- Equilibrar la resina.
- A fondo resuspender la resina invirtiendo la botella y la transferencia de 50 l de la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 700 xg durante 2 min a la resina de pellets. Con cuidado, aspirar el sobrenadante.
Nota: Llevamos a cabo la aspiración de la pipeta usando un azul punta de pipeta de 1 ml para eliminar la mayor parte del líquido. Una punta de 2 l blanco se utiliza para el control fino de la eliminación del sobrenadante restante, dejando una capa muy delgada de líquido de los granos. - Añadir 1 ml de tampón A. Mezclar suavemente para resuspender la resina y se centrifuga a 700 xg durante 2 min para sedimentar la resina. aspirar cuidadosamente el sobrenadante y repetir este paso de lavado una vez más.
- A fondo resuspender la resina invirtiendo la botella y la transferencia de 50 l de la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 700 xg durante 2 min a la resina de pellets. Con cuidado, aspirar el sobrenadante.
- Aplicar lisado soluble obtenido anteriormente en la sección 2.1 o 2.2 a la resina equilibrada. Incubar el tubo con una rotación suave a 4 ° C durante 60 min. Se centrifuga el tubo a 700 × g </ Em> durante 5 min y con cuidado aspirar el sobrenadante.
- Lavar la resina de la siguiente manera para eliminar las proteínas unidas de forma no específica.
- Resuspender resina con 1 ml de tampón A y se incuban con agitación suave a 4 ° C durante 10 min. Centrifugar el tubo a 700 xg durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso de lavado una vez más.
- Resuspender resina con 1 ml de Tampón B (Tampón A con imidazol 5 mM) y se incuba con agitación suave a 4 ° C durante 5 min. Centrifugar el tubo a 700 xg durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Repita este paso de lavado una vez más.
- Resuspender resina con 1 ml de tampón C (tampón A con imidazol 10 mM) y se incuba con agitación suave a 4 ° C durante 5 min. Centrifugar el tubo a 700 xg durante 5 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante.
- Eluir la proteína mediante la adición de 400 l de tampón E (tampón A con imidazol 200 mM) to la resina. Incubar con agitación suave a 4 ° C durante 5 min. Centrifugar a 700 xg durante 5 min.
- Transferir el sobrenadante que contiene proteína purificada a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml.
- Desalar la proteína purificada por centrifugación de serie de la siguiente manera.
- Para 400 l de proteína purificada, añadir 100 l de tampón A (esto reduce la concentración de imidazol de 200 mM a 160 mM). Aplicar proteína purificada a 0,5 ml filtros de ultracentrifugación con un 10 kDa de peso molecular de corte. Centrifugar a 14.000 × g durante 5 min.
- Desechar el filtrado y añadir 400 l de tampón A para diluir el retenido y se centrifuga de nuevo. Continuar los ciclos de centrifugación / dilución hasta la concentración de imidazol cae por debajo de 4 mm. Como un ejemplo, si cada centrifugación concentra 500 l hasta ~ 70 l (o aproximadamente 7 veces), a continuación, dos ciclos reducirán el 160 mM a partir de concentración de imidazol (7 × 7 = 49 veces) a aproxoximately 3,3 mM.
- Medir la concentración de proteína de la muestra desalada usando el ensayo BCA 21.
Se requiere desalación para reducir los niveles de imidazol por debajo del límite de tolerancia para el ensayo BCA, como se describe en las instrucciones del fabricante: Nota. Nuestro laboratorio prefiere el ensayo BCA porque es sensible, tiene un gran rango dinámico, y exhibe una variación mucho menor de proteína a proteína. Sin embargo, otros métodos para determinar la concentración de proteína pueden ser sustituidos por el ensayo de BCA. La clave es ser consciente de las ventajas y limitaciones de cada método.
- Añadir tampón de muestra nativo 5X a una concentración final de 1X y proceder a la electroforesis. Alternativamente, las muestras almacenadas a -20 ° C para su posterior análisis.
4. desnaturalizante en gel de poliacrilamida electroforesis (PAGE).
Precaución: no polimerizado acrilamida es una neurotoxina. Use gea de protección apropiador.
- Preparar el gel no desnaturalizante PÁGINA como sigue.
- Preparar el casete de gel para moldear utilizando placas de vidrio limpias y emitan soporte. Coloque fabricante de gradiente en la parte superior de un pequeño agitador magnético y se colocará un pequeño imán en cada cámara.
- El uso de 40% (w / v) de acrilamida y 2% (w / v) de soluciones madre bisacrilamida, preparar 5% y 10% (w / v) Las soluciones de gel de acrilamida en un tampón de la solución nativa. Asegúrese de que la proporción de acrilamida total bisacrilamida es 37,5: 1. Se enfría en hielo antes de verter.
Nota: El sistema PÁGINA desnaturalizante se utiliza aquí es esencialmente idéntico al sistema SDS-PAGE de Laemmli, con SDS omitió 22. - Añadir amonio persulfato (de un 10% (w v) solución / preparada en agua) a las soluciones de acrilamida para iniciar la polimerización. La concentración final de amonio persulfato es 0,1% (w / v).
- Vierta las soluciones de acrilamida en las dos cámaras del fabricante de gradiente. Con el tubo de salida b insertadantre las placas de la casete de gel, activar el agitador magnético y se abren las válvulas fabricante de gradiente. Verter la 5 - gel con gradiente desnaturalizante al 10%.
- Una vez vertida, superponer el gel con una capa delgada de isopropanol y permitir que el gel se polimerice durante 30 min. Durante este tiempo, preparar la solución de gel de acrilamida al 5% en tampón fresco resolver nativo. Después de la puesta de gel, vierta el isopropanol y enjuague la parte superior del gel con agua desionizada de una botella con atomizador.
- A la solución de gel de 5% preparada anteriormente, añadir amonio persulfato (exactamente como se describe en 4.1.3) y se vierte en la parte superior del gel polimerizado hasta placas de vidrio están llenos. Inserto de peine gel. Permitir que el gel superpuesto polimerizar durante 30 minutos adicionales.
- Una vez gel se polimeriza, montar casete de gel en el aparato de electroforesis. Como alternativa, el gel almacenar a 4 ° C, envueltas en toallas de papel humedecido y una envoltura de plástico hasta que esté listo para su uso.
- Una vez que no desnaturalizante en gel PAGE se ensambla en electrophoresis aparato, llene el tanque con tampón de procesamiento 1X nativa preparada fresca de un tampón 10X ejecución nativa de valores.
- Carga de 10 g de proteína purificada, obtenida al final de la sección 3, en cada pocillo utilizando una jeringa de vidrio.
- Carga 2 l de estándar de alto peso molecular nativo de proteína (diluido en tampón de ejecución nativo 1X) en uno de los pocillos.
- gel de funcionar a 55 V y 4 ºC hasta que el frente del colorante se escurre el gel (aproximadamente 4 - 4,5 horas).
- Además del gel no desnaturalizante, analizar alícuotas de la proteína purificada por la norma SDS-PAGE 22.
- Mezclar alícuotas (10 g) de las muestras de proteína purificada, obtenida al final de la sección 3, con tampón 5X de muestra de SDS a una concentración final de 1X.
- Incubar a 100 ºC durante 5 min y cargar en estándar 12% y / o 15% en geles de SDS-PAGE 22.
- Correr a 80 V durante 20 min y luego a 120 V hasta que el frente de colorante se sale de la gel (esto es aproximadamente un complementoitional 75 min para un gel 12%, y 120 min para un gel 15%).
Actividad 5. Visualización y tinción de proteínas.
- Tras la electroforesis, las placas de vidrio separadas cuidadosamente y transferir el gel no desnaturalizante a una bandeja de gel que contiene 50 ml de agua desionizada. Enjuague gel con agitación suave durante 5 minutos. Desechar el agua y repetir este paso de lavado tres veces.
- Realizar ensayo de recubrimiento de sustrato de la siguiente manera.
- Añadir 1 ml de tampón de revelado que contiene el sustrato de péptido fluorogénico Suc-LLVY-AMC y se extendió uniformemente sobre el gel. Incubar a 37 ºC durante 30 min.
Nota: una varilla de vidrio o un liberador de gel (pequeña cuña de plástico utilizado para placas de vidrio separadas) se pueden utilizar para extender el líquido sobre el gel. - transferir cuidadosamente el gel en el transiluminador UV del sistema de imágenes de gel y observar la fluorescencia debido al sustrato péptido escindido. imagen de registro. Transferir cuidadosamente los ba gelck a la bandeja de gel.
- Enjuague el gel dos veces con 50 ml de agua desionizada durante 5 minutos con agitación suave.
- Tinción del gel con 10 ml de un reactivo de tinción de Coomassie coloidal durante 60 minutos con agitación suave. destain de gel con 50 ml de agua hasta que el fondo se vuelve claro. Esta etapa de tinción se aplica a los geles de SDS-PAGE estándar también.
- Añadir 1 ml de tampón de revelado que contiene el sustrato de péptido fluorogénico Suc-LLVY-AMC y se extendió uniformemente sobre el gel. Incubar a 37 ºC durante 30 min.
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Representative Results
El montaje del proteasoma (Figura 1) comienza cuando subunidades se combinan para formar anillos 9. Esto se puede ilustrar cuando subunidades alfa de la archaeon Methanococcus maripaludis S2 se expresan en E. coli como C-terminal de hexahistidina marcado (marcado con His) derivados (Tabla 1). Cuando el α-su proteína recombinante se purificó por ICAR y se analizó por desnaturalizante PAGE, se observaron dos bandas (Figura 2A, carril 1). Hemos demostrado previamente que estos corresponden a los anillos individuales alfa (SR) y dobles alfa-Rings (DR) 18. El DR es una especie de callejón sin salida que no es productivo para su posterior montaje 9,18.
Cuando a-sus subunidades se coexpresan con las subunidades beta, que representa el método habitual por el que se somete a ensayo, se observó una especie nuevo conjunto de proteasomas archaeal recombinantes migrar cerca de la parada 670 kDa tamañoard (Figura 2A, carril 3). Esta especie fue proteolíticamente activo (Figura 2B, carril 3) y contenía subunidades beta solamente completamente maduros (mβ) cuyos propéptidos se han eliminado (Figura 2C, carril 3). Esta especie es la de CP completamente madura. Esta muestra también contenía algunas especies SR, que se esperaba porque SR es un conjunto conocido intermedia, pero ninguna especie DR. La falta de DR cuando a-su y subunidades ß se coexpresan sugiere que correcto montaje se estaba produciendo la suficiente rapidez tal que la incorporación de las subunidades beta fue capaz de competir directamente con la formación no productiva de la RD (para un análisis más detallado ver 18).
Para demostrar la limitación del método de co-expresión, y argumentar a favor de la utilidad de un enfoque combinado, α-y su subunidades ß se expresaron por separado en E. coli. Después de la lisis, las fracciones solubles se mezclaron y las proteínas se purificaron por ICAR antes deanálisis por PAGE no desnaturalizante. Totalmente proteasomas funcionales también se generaron mediante el enfoque de mezcla lisado (Figura 2A y 2B, carril 2), y la especie SR también se observó como se esperaba. La reaparición de la especie DR en la muestra de la mezcla de lisado indica que una vez formado, subunidades beta son incapaces de desmontar reversiblemente ella; esto subraya la naturaleza callejón sin salida de la RD. Curiosamente, una nueva especie también aparecieron en la muestra de la mezcla de lisado, migrando justo debajo de la CP (denominada "media"). Recientemente, se demostró que esta especie corresponde a la media del proteasoma (alpha 7 β 7) 18. Para ilustrar este aquí, se empleó un mutante de la subunidad β (R166W). Esta mutación altera la interacción anillo de β-β, lo que lleva a la alteración de la dimerización de media proteasomas 18. Desde medias proteasomas son los precursores inmediatos de CP, la mutación R166W debería llevar tanto a la acumulación de medias proteasomas unadisminución da en la formación de CP. Cuando la mezcla de lisado con sus alfa-beta y subunidades (R166W) se llevó a cabo, se observaron niveles más bajos de CP y aumento de los niveles de las "medias" especies (Figura 2A, carril 4). Esto es consistente con una relación precursor-producto para estas dos bandas, y confirma la identidad de la especie "medio", como el medio-proteasoma. La migración ligeramente más rápida del medio-proteasoma en la muestra mutante (carril 4 frente a carril 2) es probablemente debido a la mutación R166W alterando la relación de masa a carga de la subunidad β.
La capacidad de visualizar el medio-proteasoma durante la mezcla de lisado se debe principalmente a las concentraciones de proteína mucho más bajos en el lisado en comparación con las altas concentraciones de proteína dentro de las células. Las concentraciones más bajas resultan en conjunto de menos eficiente (es decir, más lento), lo que permite intermedios para ser más poblada y por lo tanto detectable. Además de la aparición de la media-proteasoma, una observación adicional destaca la disminución de la eficiencia de montaje durante la mezcla de lisado: subunidades beta no procesados, que retienen sus propéptidos, se hacen detectables (proβ). Desde el procesamiento de propéptido no se produce hasta la mitad de proteasomas dimerize, la aparición de la forma inmadura proβ se correlaciona con el nivel de acumulación media-proteasoma (comparar Figura 2C, carril 3 frente a carril 2 frente a carril 4). En el caso del mutante R166W, el fallo de procesamiento de propéptido durante la mezcla de lisado es absoluto a pesar de que una pequeña cantidad de CP se forma. Esto es porque el procesamiento de propéptido no sólo requiere la dimerización medio-proteasoma, pero también una interfaz de anillo de β-β formado correctamente-23 que la mutación R166W no ofrece. Un relato más detallado de la co-expresión en comparación con la mezcla de lisado, en lo que respecta al conjunto del proteasoma recombinante, se puede encontrar aquí 18.
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Figura 1: Un esquemática simplificada del núcleo de la partícula (CP) de la Asamblea.
Las subunidades alfa pueden ensamblar en un único α-anillo primero (SR), que sirve como plantilla para la incorporación de las subunidades beta. Esto conduce a la generación de la media-proteasoma intermedio (medio), que dimeriza de forma rápida. Simultáneamente con la dimerización, los propéptidos β subunidades (no mostrados) se eliminan autocatalıticamente dando lugar a la partícula de núcleo completamente funcional (CP). a-anillos dobles (DR) puede surgir de SR y no son competentes para el montaje en CP. Su formación representa un montaje vía no productiva (flecha discontinua) en contraste con el montaje de eventos productivos (flechas sólidas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un enfoque combinado para ensayar la Asamblea proteasoma.
Se emplearon coexpresión (C) y la mezcla de lisado (L) para estudiar el montaje de proteasomas recombinantes a partir de la archaeon M. maripaludis. Las proteínas fueron purificados por afinidad inmovilizada cobalto Resina (ICAR). (A, B), las proteínas purificadas (10 g) se cargaron en 5 desnaturalizantes no - geles de gradiente de 10%. Después de la electroforesis, la actividad peptidasa se visualizó mediante la superposición de la gel con solución tampón que contiene el sustrato peptídico fluorogénico Suc-LLVY-AMC (B) antes de la tinción del gel con reactivo de tinción de Coomassie coloidal (A). puntas de flechas negras indican las posiciones de la partícula 20S reunidos núcleo (CP), la mitad-proteasoma intermedia (la mitad), α-doble anillo (DR) y el único α-ring (SR). La migración de varios patrones de tamaño molecular (en kDa) se indica a la derecha. (DO) A también se cargaron en 15% de geles de SDS-PAGE. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con un reactivo de tinción de Coomassie coloidal. La migración de α-su subunidad y de plena madurez (mβ) y subunidades beta inmaduros (proβ) está indicado. La posición del patrón de tamaño molecular de 25 kDa se muestra a la derecha. El asterisco indica una su-α fragmento truncado subunidad que resulta de la proteólisis no específica durante la lisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| plásmido | Genotipo | Fuente |
| AKB191 | pET42-PSMA su | Kuśmierczyk et al., (2011) |
| AKB464 | pET42-PSMA su PSMB | Kuśmierczyk et al., (2011) |
| AKB946 | pET42 PSMB | Panfair et al., (2015) |
| AKB952 | pET42 PSMB (R166W) | Panfair et al., (2015) |
Tabla 1: plásmidos bacterianos utilizados en este estudio. PSMA es el gen de la subunidad α de arqueas y PSMB es el gen de la subunidad β de arqueas.
| tampón A | 50 mM de HEPES-NaOH, pH 7,5, NaCl 300 mM, 5 mM MgCl 2. | Buffers B, C, y E, son derivados de tampón A que contiene imidazol. Es útil añadir imidazol de una reserva de 2 M preparada en agua y se almacenaron en la oscuridad. |
| tampón resolver nativa | 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% (v / v) tetrametiletilendiamina (TEMED) y 0,1% (w / v) de amonio Perulfate (APS). | Preparado fresco no más de una hora antes de gel se polimeriza y se mantuvieron en hielo. En la preparación de las soluciones de gel de acrilamida en tampón resolver nativo, es útil para añadir el Tris-HCl de una población de 4X (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8). El APS se añade inmediatamente antes de la polimerización. |
| tampón de ejecución nativa 10x | mM Tris 250, 1,92 M de glicina, no ajustar el pH. | |
| tampón de muestras 5X nativa | 0,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 50% (v / v) de glicerol, trazas de azul de bromofenol. | Las huellas se refiere a una cantidad muy pequeña, por lo general unos pocos granos transferidos a través de una espátula. |
| 5X tampón de muestra de SDS | 0,3 M Tris-HCl, pH 6,8, ditiotreitol 600 mM (DTT), 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) de glicerol y trazas de azul de bromofenol. | Las huellas se refiere a una cantidad muy pequeña, por lo general unos pocos granos transferidos a través de espátula. |
| El desarrollo de tampón | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2 mM, ATP 1, 50 mM Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC es un sustrato de péptido fluorogénico usado para ensayar la actividad del proteasoma. |
Tabla 2: Soluciones, medios y tampones utilizados en este estudio.
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Discussion
Se demuestra el beneficio de un enfoque combinado para analizar el montaje del proteosoma por nondenaturing PAGE utilizando proteasomas arqueas recombinantes. El método usual de 9,11 coexpresión bacteriana de subunidades del proteasoma permite el análisis rápido, pero puede no revelar montaje intermedios clave. Se aconseja la combinación de co-expresión con lisado de mezcla para desarrollar una visión más amplia de montaje de eventos.
La ventaja de este enfoque combinado es que a pesar de que requiere la expresión separada de la α y ß subunidades para la mezcla de lisado, todavía es relativamente trabajo de usar. Los resultados también pueden ser semicuantitativa si se asegura que los niveles de expresión comparables y consistentes de las proteínas individuales. Con este fin, se recomienda llevar a cabo la optimización habitual de expresión de la proteína recombinante para determinar las condiciones que permiten a niveles comparables de proteínas expresadas antes de la mezcla lisado. La optimización puede incluir la variable de inducción time, la temperatura de inducción, la densidad óptica en la inducción, la cepa de expresión bacteriano, y así sucesivamente, hasta que se alcancen los niveles deseados de proteína soluble. Esto es especialmente importante cuando se comparan versiones WT y mutantes de una proteína porque a veces el mutante puede exhibir niveles de expresión comparables, pero disminuyó la solubilidad. También destacamos la importancia de determinar las concentraciones de proteína de las muestras ICAR-purificado antes de la carga de la página no desnaturalizante. Incluso con la optimización de la expresión en su lugar, y con el mejor cuidado para asegurar que las muestras paralelas se procesan a través de las etapas de purificación de la misma manera, la variación puede todavía ser introducido inadvertidamente. Una medición de la concentración se asegura de que la misma cantidad de proteína total se carga por pocillo de muestra. Esto hace que las comparaciones carriles-a-carril de intensidades de banda para un determinado especies migratorias más significativa.
Si los niveles comparables y consistentes de expresión de proteínas no pueden ser alcanzados por lysate de mezcla, siempre se puede purificar a todos los componentes de antemano y llevar a cabo experimentos de mezcla con proteínas puras. Esto tiene la ventaja de permitir determinaciones de proteína más precisas y por lo tanto hace que el enfoque cuantitativo. Sin embargo, el inconveniente de purificación completo es que el proceso se vuelve considerablemente más mano de obra, lo que puede impedir el análisis rápido de múltiples mutantes simultáneamente 18. Una advertencia final vale la pena mencionar es que a veces separar expresión de α y subunidades ß pueden no ser posibles. Esto puede ocurrir si una mutación causa una subunidad a ser insoluble en E. coli cuando se expresa por sí solo, sino que permite la solubilidad para ser recuperada cuando el mutante se expresa con su pareja de unión. Si esto ocurre, se limitará el análisis de coexpresión solamente. Sin embargo, esta es una advertencia de que puede surgir durante la expresión de la proteína recombinante en general, y no es específico de subunidades del proteasoma archaeal 24,25.
Elegimos al geneRate derivados con cola de histidina de nuestras proteínas proteasomal debido a la facilidad de purificación y la asequibilidad de la resina ICAR. Otras etiquetas de epítopo son posibles, incluyendo las de purificación basado en anticuerpos, y que han expresado con éxito y versiones bandera de etiquetado purificados de nuestros subunidades del proteasoma (no mostrado). Sin embargo, si se requiere la purificación hasta la homogeneidad (o el aumento de la escala de producción), las versiones con cola de histidina proporcionan los medios más rápidos y rentables de hacerlo.
Es una que se dé resultados obtenidos con las proteínas recombinantes, ya sean de arqueas o eucariotas proteínas producidas en bacterias, ganará aún más sentido cuando siguió con observaciones in vivo. Sin embargo, un enfoque in vivo no siempre puede ser inmediatamente accesible experimentalmente. Esto es especialmente cierto cuando el sujeto de estudio es un grande, de múltiples subunidades complejo como el proteosoma. La proteína recombinante se aproxima a proporcionar un importante punto de lanzamiento para future experimentos. En el caso de la proteasoma, el emparejamiento de la producción del proteasoma archaeal recombinante con PÁGINA desnaturalizante seguirá siendo muy eficaz en la aclaración de las características clave de montaje del proteasoma, que son compartidos entre especies de arqueas y eucariotas 9,11,12,18. Tal enfoque es probable que sea útil para estudiar el montaje de otros complejos multiproteicos grandes también. Recientemente, hemos utilizado esta estrategia para demostrar que los proteasomas arqueas pueden montar a través de más de una vía, y que las alfa-anillos no están obligados los intermedios durante el montaje que se pensaba que eran 18. Queda por determinar si el mismo es válido para los proteasomas eucariotas.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de apoyo Fondos de Investigación (RSFG) de la Universidad de Indiana-Purdue University, Indianapolis, y en parte por un premio de la Asociación Americana del Corazón 14GRNT20390154, a ARCA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R.
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W.
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
