Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

دراسة الجمعية proteasome ومع المؤتلف Archaeal جسيم بروتيني وNondenaturing الصفحة: حالة لنهج موحد

Published: December 17, 2016 doi: 10.3791/54860
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI)

Summary

يستخدم هذا البروتوكول كل من coexpression الوحيدات وحدة فرعية postlysis خلط لإجراء فحص أكثر دقة التجمع proteasome والمؤتلف.

Abstract

تم العثور على جسيم بروتيني في جميع مجالات الحياة. أنها توفر الطريق الرئيسي لتدهور البروتين داخل الخلايا في حقيقيات النوى، ولكن ليس من المفهوم جمعيتهم تماما. كل جسيم بروتيني تحتوي على الجسيمات محفوظ الهيكلية الأساسية (CP)، أو 20S proteasome و، تحتوي على اثنين heptameric حلقات فرعية β تقع بين اثنين من حلقات α فرعية heptameric. Archaeal 20S جسيم بروتيني أبسط إنشائي مقارنة مع نظرائهم حقيقية النواة، ولكن كلا منهما متشاركين في آلية تجميع المشتركة. وبالتالي، فإن archaeal 20S جسيم بروتيني لتكون نماذج هامة لتجميع proteasome وحقيقية النواة. على وجه التحديد، قد حقق التعبير المؤتلف من 20S archaeal جسيم بروتيني جانب nondenaturing هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE) العديد من الأفكار الهامة في نشوء حيوي proteasome و. هنا، نحن نناقش وسيلة لتحسين بناء على استراتيجية المعتادة من coexpression من α proteasome وarchaeal وبيتا مفارز قبل nondenaturiنانوغرام PAGE. علينا أن نبرهن على الرغم من سرعة وكفاءة، واتباع نهج coexpression وحده يستطيع ان يشتاق سيطة التجمع الرئيسية. في حالة proteasome و، coexpression قد لا تسمح الكشف عن نصف proteasome و، والمتوسطة التي تحتوي كاملة α-حلقة واحدة وكاملة β-حلقة واحدة. ومع ذلك، تم الكشف عن هذا المتوسط ​​بسهولة عبر المحللة الاختلاط. نقترح أن الجمع بين coexpression مع المحللة خلط ينتج نهج أكثر شمولا في تحليل التجمع، ومع ذلك لا تزال nonintensive العمل. قد يكون هذا النهج مفيدا لدراسة المجمعات multiprotein المؤتلف أخرى.

Introduction

المجمعات Multiprotein تنفذ العديد من الأنشطة الخلوية الحيوية 1. بالنسبة لكثير من هذه المجمعات، يعرف الكثير عن هيكل وظيفة من حول جمعيتهم 2،3. وproteasome وهو واحد من هذا القبيل معقدة ويوجد في جميع مجالات الحياة. في حقيقيات النوى، وهذا الجهاز الجزيئية هي في صميم النظام proteasome و/ اليوبيكويتين (يو بي إس)، ويوفر الطريق الرئيسي لتدهور البروتين داخل الخلايا 4. وتتألف proteasome وحقيقيات النوى (ويشار إلى أن proteasome و26S) اثنين من المجالس الفرعية رئيسيين: proteasome و20S، أو كور الجسيمات (CP) 5، والتي يمكن أن توج على واحد أو كلا الطرفين من الجسيمات التنظيمي 19S (RP) 6.

وproteasome و20S هو الأنزيم البروتيني مجزأة كبير. ويحفظ لها هيكل رباعي على الاطلاق في جميع مجالات الحياة، ويتألف من كومة من أربع حلقات سبعة membered تحتوي على نوعين من الوحدات الفرعية المرتبطة هيكليا، α. وبيتا 5،7،8. في حقيقيات النوى، وتتألف اثنين من حلقات الخارجي لكل من سبع مفارز α متميزة واثنين من الحلقات الداخلية وتضم كل من سبع مفارز β متميزة. يقيم نشاط بروتين في غضون ثلاث مفارز β. على النقيض من ذلك، حلقات CP من العتيقة والبكتيريا وتتألف عادة من نوع واحد فقط من α ونوع واحد من الوحيدات بيتا. وقد وفرت جسيم بروتيني Archaeal نظام نموذجا هاما لدراسة التجمع proteasome وعلى حد سواء بسبب بساطتها التركيبية وعلى تقاسم آلية تجميع مشتركة مع نظرائهم حقيقية النواة من 9-13. وباختصار، مفارز ألفا التجمع في حلقات α أولا، التي تكون بمثابة سقالة على الذي بيتا مفارز تجميع. الناتج-جسيم بروتيني نصف (α 7 β 7) dimerize، مما أدى إلى تجميعها بشكل كامل CP (α 7 β 7 β 7 α 7). خلال dimerization، وpropeptides تقديم على مفارز بيتاتتم إزالة autocatalytically، وفضح threonines N-محطة الحفاز. استخدام جسيم بروتيني archaeal لنموذج التجمع في كثير من الأحيان يستفيد من إنتاج المؤتلف بروتينات proteasome وarchaeal في القولونية. هذا هو نهج جدير بالاهتمام لأنه تمكن مفارز إلى أن يتم إنتاجها في توليفات مختلفة، على حد سواء WT والإصدارات متحولة، في كائن المضيف الذي لا ينتج جسيم بروتيني الخاصة بها.

رصد التجمع من المجمعات متعددة البروتين يتطلب كيميائيا نوع من طريقة تجزئة الذي يفصل بين المجمعات تجميعها بشكل كامل من وسيطة التجمع والسلائف. وقد ثبت نظرا لقدرتها الفائقة حل، nondenaturing إس دي إس بايج (PAGE) لتكون مفيدة بشكل خاص في تجزئة من مختلف المجمعات multiprotein كبيرة 14-17. أصبح الجمع بين المؤتلف إنتاج proteasome وarchaeal و PAGE nondenaturing طريقة فعالة في dissectinز proteasome والتجمع 9،11،12،18. ومع ذلك، فإن الطريقة المعتادة التي يتم تطبيق هذا النهج (أي عن طريق coexpression المؤتلف من α و β مفارز) لديه عيب المهم. ردود الفعل الجمعية هي التعاونية وبقوة 3-يعتمد التركيز. وبالنظر إلى أن تركيز البروتين داخل الخلايا عالية جدا 19، وذلك بسبب الآثار حجم المستبعدة، ردود فعل التجمع المضي قدما بسرعة في الجسم الحي. وبالتالي فإنه من الممكن أن يغيب سيطة التجمع المهمة عندما يتم coexpressed α و β مفارز.

هنا، فإننا نقول للنهج المشترك في الدراسة التجمع proteasome وباستخدام المؤتلف مفارز proteasome وarchaeal. في هذا النهج، والعاملين على حد سواء أساليب خلط coexpression والمحللة. يسمح السابق للتحليل السريع للتجميع بسبب coexpression أقل كثافة اليد العاملة. هذا الأخير يعتمد على التعبير منفصل من α و β مفارز، تليها خلط. على الرغم من هذا requiالدقة أكثر قليلا من الجهد من coexpression، هو أكثر من كاف للتعويض عن القدرة على الكشف عن وسيطة التي غاب خلال coexpression. معا، يمكن أن هاتين الطريقتين توفير صورة أكثر اكتمالا التجمع proteasome و.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التعبير الجرثومي.

وصفت البلازميدات التعبير المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول رقم 1: ملاحظة. ووصف الحلول، وسائل الإعلام، والمخازن المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 2. ووصف استنساخ الجينات proteasome وحدة فرعية archaeal وتوليد البلازميدات التعبير في أماكن أخرى 18،20. وباختصار، البلازميدات لcoexpression المؤتلف من مفارز توظف استراتيجية الاوبرون bicistronic التي تساعد في الحصول على مستويات التعبير مقارنة مفارز الفردية 18،20. وكانت المعلمات التعبير الواردة أدناه مصممة تجريبيا لتكون الأمثل لمفارز proteasome وفي هذه الدراسة. قد يكون من الضروري لتحسين التعبير عن المسوخ proteasome وغيرها، لجسيم بروتيني من أنواع archaeal أخرى، أو للمجمعات البروتين المؤتلف الأخرى (انظر مناقشة).

  1. تحويل التعبير البلازميد من الاهتمام إلى المختص كيميائيا القولونية BL21 (DE3) الخلايا.
  2. إضافة 1-2 ميكرولتر من البلازميد (عادة 50-100 نانوغرام) لقسامة من الخلايا DE3 التي تم إذابة حديثا على الجليد، والاستمرار في احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  3. الصدمة الحرارية الخلايا في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 45 ق والعودة إلى أنبوب الجليد لadditionl 2 دقيقة.
  4. إضافة 1 مل من LB المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (150 دورة في الدقيقة) لمدة 1 ساعة.
  5. انتشار 100-200 ميكرولتر من الخليط التحول إلى LB-اساسه لوحات (لوحات تحتوي على وسائل الاعلام LB الصلبة، على أن تستكمل مع كانامايسين (جميع البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة المقاومة ترميز لهذا المضاد الحيوي)). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية O / N.
  6. صباح اليوم التالي، تلقيح مستعمرة واحدة من لوحة LB-كان إلى 3 مل من وسائل الاعلام LB-اساسه السائل في أنبوب ثقافة الزجاج. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (150 دورة في الدقيقة) لحوالي 2،5-3 ساعة، أو حتى لوحظ تعكر.
  7. قياس الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر (OD 600) في معمل. تمييع عبادة خليةلدى عودتهم مع كمية مناسبة من وسائل الاعلام LB-كان prewarmed إلى OD 600 من 0.4 في الحجم النهائي من 6 مل. استئناف اهتزاز في 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
  8. حمل تعبير البروتين في الثقافات السائلة بإضافة IPTG من محلول المخزون إلى تركيز النهائي من 1 ملم. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (150 دورة في الدقيقة) لحوالي 6-7 ساعات.
  9. حصاد الثقافات الخلية البكتيرية في مجملها إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
  10. إضافة 1.5 مل من ثقافة إلى أنبوب microcentrifuge. أجهزة الطرد المركزي في 10000 × ز لمدة 1 دقيقة.
  11. تجاهل طاف وإضافة 1.5 مل أخرى من نفس الثقافة لبيليه. أجهزة الطرد المركزي في 10000 × ز لمدة 1 دقيقة.
  12. يتم حصاد كرر الخطوة 1.11 حتى ثقافة كاملة في أنبوب microcentrifuge.
  13. تخزين الكريات الناجم في -80 درجة مئوية حتى تحلل.

2. بكتيريا تحلل والمحللة خلط.

ملاحظة: (أي أنه يتحقق من أن أعرب عن البروتين وقابل للذوبان). وبالتالي، فإننا نوصي بشدة بما في ذلك تحليل TSP في البداية. مرة واحدة وقد تم تحقيق بروتوكول الأمثل لمزيج فرعية معين، لا يتطلب تحليل TSP بدقة وهذا هو السبب وصفته اختياري أدناه.

  1. تحلل الخلايا البكتيرية وإعداد كسور القابلة للذوبان.
    1. ذوبان الجليد بيليه الخلية التي يسببها على الجليد لمدة 5 دقائق. Resuspend وبيليه في 600 ميكرولتر من تحلل العازلة.
    2. المؤتمر الوطني العراقيأوباتي تعليق على 30 درجة مئوية مع اهتزاز (150 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة لتوليد الكلي المحللة الخام.
      ملاحظة: الخطوة التالية والفرعي الذي يلي اختيارية.
    3. إزالة اثنين من 25 مكل من إجمالي المحللة الخام إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge منفصلة وإجراء تحليل TSP على النحو التالي.
      1. إلى واحد من اثنين 25 للمكل، إضافة عينة العازلة 5X SDS إلى تركيز النهائي من 1X. تسمية الأنبوب مع "تي" ل "الكلي المحللة الخام".
      2. احتضان "T" العينة على 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد تماما البروتينات.
      3. وفي الوقت نفسه، واتخاذ الثانية قسامة 25 ميكرولتر وأجهزة الطرد المركزي أنه في 10000 × ز لمدة 10 دقيقة. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه الصغير، وتحويلها إلى 1.5 أنبوب جديد مل microcentrifuge. تسمية هذا الأنبوب الجديد "S" ل "جزء القابلة للذوبان".
      4. إلى الباهي بيليه الصغير اليسارالثاني في الخطوة السابقة، إضافة 25 ميكرولتر من تحلل العازلة ودوامة ل resuspend. تسمية هذا الأنبوب "P" ل "جزء بيليه".
      5. إضافة 6 عينة العازلة ميكرولتر من 5X SDS إلى "S" وأنابيب "P" واحتضان عند 100 درجة مئوية كما هو موضح أعلاه.
        ملاحظة: إذا لن يتم استخدام عينات TSP ذلك اليوم لتحليل التعبير، فإنها قد تكون مجمدة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. إذابة مرة واحدة، لا بد من reincubated عند 100 درجة مئوية، كما هو موضح أعلاه، مباشرة قبل التحميل على 12٪ و / أو 15٪ القياسية هلام SDS-PAGE.
    4. بينما يتم تحليل TSP خارج، الطرد المركزي المتبقية 550 ميكرولتر من إجمالي المحللة الخام (أو كامل 600 ميكرولتر من إجمالي المحللة الخام إذا لم يتم إجراء تحليل TSP الخروج) في 10000 × ز لمدة 10 دقيقة. جمع طاف في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge الطازجة. هذا هو المحللة للذوبان التي سيتم استخدامها لتنقية.
  2. المحللة الاختلاط.
    1. تنفيذ تحلل كما هو موضح في الخطوات 2.1.1 و 2.1.2 أعلاه.
    2. مزيج 600 ميكرولتر من إجمالي المحللة الخام من البكتيريا التعبير الوحيدات α المطلوب مع 600 ميكرولتر من إجمالي المحللة الخام من البكتيريا التعبير الوحيدات بيتا المطلوب. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز ببطء لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري لتحسين فترة حضانة لتحقيق أقصى قدر من التجمع خلال المحللة خلط (انظر مناقشة). الوقت ودرجة الحرارة عرض هنا هي الأمثل للبروتينات المؤتلف في هذه الدراسة، وحددت أماكن أخرى 18.
    3. أجهزة الطرد المركزي في المحللة مختلطة في 10000 × ز لمدة 10 دقيقة لفصل المواد القابلة للذوبان من بيليه غير قابلة للذوبان. طاف لنقل 1.5 أنبوب جديد مل microcentrifuge. استخدام هذا المحللة للذوبان المختلطة لتنقية البروتين.

3. البروتين تنقية عبر يجمد الكوبالت الانجذاب الراتنج(أنا سيارة).

  1. تتوازن الراتنج.
    1. تماما resuspend والراتنج التي كتبها قلب الزجاجة ونقل 50 ميكرولتر من الطين إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 2 دقيقة لراتنج بيليه. نضح بعناية طاف.
      ملاحظة: نقوم طموح ماصة باستخدام الأزرق 1 مل ماصة لإزالة الجزء الأكبر من السائل. ويستخدم 2 ميكرولتر الأبيض نصيحة لمراقبة دقيقة من إزالة طاف المتبقية، وترك طبقة رقيقة جدا من السائل الذي يغطي الخرز.
    2. إضافة 1 مل من ألف الاحتياطي مزيج بلطف ل resuspend الراتنج وأجهزة الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 2 دقيقة لتكوير الراتنج. نضح بعناية طاف وكرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى.
  2. تطبيق المحللة للذوبان التي تم الحصول عليها سابقا في القسم 2.1 أو 2.2 إلى الراتنج معايرتها. احتضان الأنبوب مع دوران طيف في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. أنبوب الطرد المركزي في 700 × ز </ م> لمدة 5 دقائق وبعناية نضح طاف.
  3. غسل الراتنج على النحو التالي لإزالة البروتينات ملزمة nonspecifically.
    1. الراتنج و resuspend مع 1 مل من الاحتياطي ألف واحتضان مع هزاز لطيف في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. أنبوب الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 5 دقائق، ونضح بعناية طاف. كرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى.
    2. الراتنج و resuspend مع 1 مل من الاحتياطي ب (الاحتياطي برصيد 5 ملي إيميدازول)، واحتضان مع هزاز لطيف في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أنبوب الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 5 دقائق، ونضح بعناية طاف. كرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى.
    3. الراتنج و resuspend مع 1 مل من الاحتياطي C (الاحتياطي برصيد 10 ملي إيميدازول)، واحتضان مع هزاز لطيف في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أنبوب الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 5 دقائق، ونضح بعناية طاف.
  4. أزل البروتين عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من الاحتياطي E (الاحتياطي ومع 200 ملي إيميدازول) رس الراتنج. احتضان مع هزاز لطيف في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. نقل طاف التي تحتوي على البروتين النقي إلى 1.5 أنبوب جديد للطرد المركزي مل.
  6. تحلية البروتين المنقى بواسطة الطرد المركزي التسلسلي على النحو التالي.
    1. 400 ميكرولتر من البروتين النقي، إضافة 100 ميكرولتر العازلة ألف (وهذا يقلل من تركيز إيميدازول من 200 ملم إلى 160 ملم). تطبيق البروتين النقي إلى 0.5 مل مرشحات ultracentrifugal مع 10 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع. أجهزة الطرد المركزي في 14000 × ز لمدة 5 دقائق.
    2. تجاهل الترشيح وإضافة 400 ميكرولتر عازلة لتمييع retentate وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. تواصل دورات الطرد المركزي / تخفيف حتى يسقط تركيز ايميدازول أقل من 4 ملم. على سبيل المثال، إذا كان كل الطرد المركزي يركز 500 ميكرولتر الى ~ 70 ميكرولتر (أو ما يقرب من 7 مرات)، ثم دورتين سوف يقلل من بدء 160 ملي تركيز ايميدازول (7 × 7 = 49 أضعاف) لapproximately 3.3 ملم.
    3. قياس تركيز البروتين من العينة المحلاة باستخدام مقايسة BCA 21.
      مطلوب تحلية للحد من مستويات إيميدازول أقل من الحد التسامح للمقايسة BCA، كما هو موضح في إرشادات الشركة المصنعة: مذكرة. لدينا مختبر يفضل فحص BCA لأنها حساسة، لديها مجموعة ديناميكية كبيرة، ويسلك أقل بكثير الاختلاف البروتين إلى بروتين. ومع ذلك، أساليب أخرى لتحديد تركيز البروتين يمكن أن تكون بديلا للمقايسة BCA. والمفتاح هو أن يكون على بينة من مزايا كل طريقة والقيود.
  7. إضافة 5X العازلة عينة الأصلي إلى تركيز النهائي من 1X، والشروع في الكهربائي. بدلا من ذلك، عينات مخزن في -20 درجة مئوية لتحليلها لاحقا.

4. Nondenaturing إس دي إس بايج (PAGE).

تحذير: مادة الأكريلاميد Unpolymerized هو عصبي. ارتداء الرابطة الواقية المناسبةص.

  1. تحضير هلام PAGE nondenaturing على النحو التالي.
    1. إعداد كاسيت جل للالصب باستخدام لوحات زجاجية نظيفة والصب الموقف. وضع صانع التدرج على رأس محرك مغناطيسي صغير ووضع بقضيب صغير في كل غرفة.
    2. باستخدام 40٪ (ث / ت) مادة الأكريلاميد و 2٪ (ث / ت) الحلول الأسهم bisacrylamide، وإعداد 5٪ و 10٪ (ث / ت) الحلول هلام الأكريلاميد في منطقة عازلة حل الأصلي. تأكد من أن نسبة من إجمالي الأكريلاميد إلى bisacrylamide هي 37.5: 1. البرد على الجليد قبل صب.
      ملاحظة: نظام nondenaturing صفحة المستخدم هنا هو مطابق للنظام SDS-PAGE Laemmli، مع SDS حذف 22.
    3. إضافة الأمونيوم بيرسلفات (من 10٪ (ث ت) حل / الأسهم على استعداد في الماء) لحلول الأكريلاميد لبدء البلمرة. تركيز النهائي من الأمونيوم بيرسلفات 0.1٪ (ث / ت).
    4. صب حلول مادة الأكريلاميد في مجلسي صانع التدرج. مع ب منفذ أنابيب إدراجهاإلى صف لوحات من كاسيت هلام، وتفعيل محرك مغناطيسي وفتح الصمامات صانع التدرج. صب 5-10٪ هلام nondenaturing التدرج.
    5. مرة واحدة صب، تراكب الجل مع طبقة رقيقة من كحولالأيسوبروبيل والسماح للهلام لتتبلمر لمدة 30 دقيقة. خلال هذا الوقت، وإعداد الطازجة 5٪ محلول هلام الأكريلاميد في المخزن حل الأصلي. بعد غروب هلام، صب قبالة كحولالأيسوبروبيل وشطف الجزء العلوي من هلام مع الماء منزوع الأيونات من زجاجة بخ.
    6. إلى حل هلام 5٪ أعدت أعلاه، إضافة الأمونيوم بيرسلفات (تماما كما هو موضح في 4.1.3) وتصب على رأس جل بلمرة حتى لوحات الزجاج مليئة. إدراج هلام المشط. السماح للهلام مضافين إلى تتبلمر لمدة 30 دقيقة إضافية.
    7. مرة واحدة هلام هو بلمرة، تجميع جل كاسيت في جهاز الكهربائي. بدلا من ذلك، تخزين هلام في 4 درجة مئوية، ملفوفة في مناشف ورقية مبللة والاغطية البلاستيكية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  2. مرة واحدة يتم تجميعها nondenaturing هلام PAGE إلى كهربائيجهاز trophoresis، وملء خزان مع 1X عازلة تشغيل الأصلي أعدت طازجة من مخزون احتياطي التشغيل الأصلي 10X.
  3. تحميل 10 ميكروغرام من البروتين النقي، التي تم الحصول عليها في نهاية الباب 3، في كل بئر باستخدام حقنة زجاجية.
  4. تحميل 2 ميكرولتر من ارتفاع الوزن الجزيئي الأصلي مستوى البروتين (المخفف في 1X العازلة تشغيل الأم) في واحدة من الآبار.
  5. تشغيل هلام في 55 V و 4 درجات مئوية حتى تدير الجبهة صبغ قبالة هلام (حوالي 4-4،5 ح).
  6. بالإضافة إلى هلام nondenaturing وتحليل aliquots من البروتين النقي من قبل القياسية SDS-PAGE 22.
    1. مزيج قسامات (10 ميكروغرام) من عينات البروتين المنقى، التي تم الحصول عليها في نهاية الباب 3، مع العازلة 5X SDS عينة لتركيز النهائي من 1X.
    2. احتضان عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتحميل على معيار 12٪ و / أو المواد الهلامية 15٪ SDS-PAGE 22.
    3. تشغيل في 80V لمدة 20 دقيقة وبعد ذلك في 120 V حتى تدير الجبهة صبغ قبالة هلام (وهذا هو تقريبا الوظيفةitional 75 دقيقة عن مادة هلامية بنسبة 12٪، و 120 دقيقة لهلام 15٪).

آخر 5. تصور وتلطيخ البروتين.

  1. بعد الكهربائي، وألواح الزجاج منفصلة بعناية ونقل هلام nondenaturing إلى علبة الجل تحتوي على 50 مل من الماء منزوع الأيونات. شطف الجل مع هزاز لطيف لمدة 5 دقائق. تجاهل المياه وكرر هذه الخطوة يغسل ثلاث مرات.
  2. أداء الركيزة تراكب الفحص على النحو التالي.
    1. إضافة 1 مل من تطوير العازلة التي تحتوي على الفلورة الببتيد الركيزة SUC-LLVY-AMC وتنتشر بشكل موحد على هلام. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: قضيب من الزجاج أو إفراز مادة هلامية (إسفين صغيرة من البلاستيك يستخدم لوحات الزجاج منفصلة) يمكن استخدامها لنشر السائل على هلام.
    2. نقل بعناية الهلام على نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية من نظام التصوير جل ومراقبة مضان بسبب الركيزة الببتيد المشقوق. صورة قياسية. نقل بعناية با هلامالمسيخ إلى علبة هلام.
    3. شطف الجل مرتين مع 50 مل من الماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق مع هزاز لطيف.
    4. وصمة عار الجل مع 10 مل من الغروية كاشف coomassie وصمة عار لمدة 60 دقيقة مع هزاز لطيف. هلام يزيل اللون مع 50 مل من الماء حتى الخلفية يصبح واضحا. تنطبق هذه الخطوة تلطيخ على المواد الهلامية SDS-PAGE القياسية أيضا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يبدأ proteasome والتجمع (الشكل 1) عند الجمع بين مفارز ألفا إلى حلقات شكل 9. ويمكن توضيح ذلك عندما يتم التعبير ألفا مفارز من archaeon المكورة الميثانية maripaludis S2 في كولاي كما C-عضال hexahistidine الموسومة (له الموسومة) المشتقات (الجدول 1). عندما تمت تنقية المؤتلف α-له البروتين ICAR وتحليلها بواسطة nondenaturing PAGE، لوحظت شريطين (الشكل 2A، حارة 1). لقد أثبتنا سابقا أن هذه تتوافق مع خواتم واحدة α (SR) ومزدوجة α-خواتم (DR) 18. وDR هو نوع مسدود ليست منتجة للجمعية اللاحقة 9،18.

عندما ألفا له وcoexpressed مفارز مع مفارز β، وتمثل الطريقة المعتادة التي يتم يعاير تجميع جسيم بروتيني archaeal المؤتلف، لوحظ وجود الأنواع المهاجرة رواية قرب 670 كيلو دالتون حجم الموقفارض (الشكل 2A، حارة 3). وكان هذا النوع النشط proteolytically (الشكل 2B، حارة 3) ويتضمن مفارز β فقط ناضجة تماما (mβ) التي تم إزالتها (الشكل 2C، حارة 3) propeptides. هذا النوع هو CP ناضجة تماما. يتضمن هذا النموذج أيضا بعض الأنواع ريال، والتي كان من المتوقع لريال هو التجمع المعروف وسيطة، ولكن لم الأنواع DR. عدم وجود DR عندما ألفا له وcoexpressed ومفارز بيتا يشير إلى أن التجميع الصحيح كان يحدث بسرعة كافية بحيث إدماج مفارز β كان قادرا على تكومبيتي تشكيل غير منتجة من DR (لتحليل أكثر تفصيلا يرى 18).

للتدليل على الحد من طريقة coexpression، ويقول لفائدة نهج المشترك،-له α ومفارز بيتا وأعرب بشكل منفصل في كولاي. وبعد تحلل، كانت أجزاء القابلة للذوبان المختلطة ووتنقيته البروتينات التي كتبها إيكار قبلالتحليل PAGE nondenaturing. تماما تم إنشاؤها جسيم بروتيني وظيفية أيضا عن طريق نهج المحللة خلط (الشكل 2A و 2B، حارة 2)، ولوحظ الأنواع ريال أيضا كما هو متوقع. عودة ظهور الأنواع DR في المحللة خلط عينة يشير إلى أن تشكلت مرة واحدة، مفارز بيتا غير قادرة على تفكيك ذلك عكسية. هذا يؤكد طبيعة مسدود من DR. ومن المثير للاهتمام، ظهر نوع جديد أيضا في العينة المحللة الاختلاط، المهاجرة أسفل CP (وهو ما يسمى "نصف"). في الآونة الأخيرة، أظهرنا أن هذا النوع يتوافق مع proteasome ونصف (a 7 β 7) (18). لتوضيح هذا هنا، كان يعمل المسخ β فرعية (R166W). هذا التحول يعطل بيتا β حلقة التفاعل، مما يؤدي إلى ضعف dimerization نصف جسيم بروتيني 18. منذ نصف جسيم بروتيني-هي السلائف فورية لحزب المحافظين، يجب أن الطفرة R166W يؤدي إلى كل من تراكم نصف جسيم بروتيني-لدا انخفاض في تشكيل CP. عندما المحللة خلط مع له α و β (R166W) مفارز نفذت، لوحظ انخفاض مستويات CP وزيادة مستويات "نصف" الأنواع (الشكل 2A، حارة 4). وهذا يتفق مع العلاقة السلائف المنتج لهذه العصابات اثنين، ويؤكد على هوية الأنواع "نصف"، كما نصف proteasome و. ومن المرجح الهجرة أسرع قليلا من proteasome ونصف في العينة متحولة (حارة 4 مقابل 2 لين) نتيجة لطفرة R166W تغيير نسبة الكتلة للشحنة من الوحيدات β.

ومن المقرر أساسا لتركيزات البروتين أقل من ذلك بكثير في المحللة القدرة على تصور proteasome ونصف خلال المحللة خلط بالمقارنة مع تركيزات عالية من البروتين داخل الخلايا. تركيزات منخفضة تؤدي إلى أقل كفاءة (أي أبطأ) التجمع، والتي تمكن سيطة لتصبح أكثر سكانا، وبالتالي يمكن كشفها. إلى جانب ظهور نصف proteasome و، ملاحظة إضافية تسلط الضوء على كفاءة تجميع انخفض خلال المحللة خلط: مفارز β غير المجهزة، التي تحتفظ propeptides، وتصبح قابلة للكشف (proβ). منذ لا يحدث معالجة propeptide حتى جسيم بروتيني نصف dimerize، وظهور شكل proβ غير ناضج يرتبط مستوى تراكم نصف proteasome و(مقارنة الشكل 2C، حارة 3 مقابل 2 لين مقابل حارة 4). في حالة متحولة R166W، وعدم معالجة propeptide خلال المحللة الاختلاط المطلق على الرغم من أن كمية صغيرة من CP يفعل النموذج. هذا هو لمعالجة propeptide ليس فقط يتطلب dimerization نصف proteasome و، ولكن أيضا تم تكوينه بشكل صحيح، β-β اجهة حلقة 23 التي لا تحمل التحور R166W. وسرد أكثر تفصيلا من coexpression مقابل المحللة الاختلاط، لأنها تتعلق التجمع proteasome والمؤتلف، ويمكن العثور عليها هنا 18.

جوري 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54860 / 54860fig1.jpg "/>
الشكل 1: المبسطة تخطيطي من الجسيمات (CP) الجمعية الأساسية.
يمكن أن مفارز α التجمع في واحدة α الدائري الأول (SR) والتي هي بمثابة نموذج لإدماج مفارز بيتا. وهذا يؤدي إلى توليد نصف proteasome والمتوسطة (نصف) الذي dimerizes بسرعة. وبالتزامن مع dimerization، تتم إزالة propeptides β فرعية (لا يظهر) autocatalytically مما أدى إلى الجسيمات الأساسية وظيفية بالكامل (CP). مزدوجة α حلقات (DR) يمكن أن تنشأ من ريال وليسوا أكفاء للتجميع في CP. يمثل تشكيلها طريقا التجمع غير منتجة (السهم متقطع) على النقيض من الأحداث التجمع الإنتاجية (الأسهم الصلبة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 الشكل 2: نهج موحد لجمعية proteasome ويعاير.
كانوا يعملون Coexpression (C) والمحللة خلط (L) لدراسة تجميع جسيم بروتيني المؤتلف من archaeon م maripaludis. تم تنقية البروتينات التي يجمد الكوبالت الانجذاب الراتنج (إيكار). تم تحميل (A، B) تنقية البروتينات (10 ميكروغرام) على-تغيير طبيعة غير 5 - المواد الهلامية التدرج 10٪. بعد الكهربائي، وتصور النشاط ببتيداز طريق تغطية الجل مع الحل العازلة التي تحتوي على الركيزة الببتيد الفلورة SUC-LLVY-AMC (ب) قبل تلطيخ الجل مع الغروية كاشف coomassie وصمة عار (A). السهام السوداء للدلالة على مواقف الجسيمات تجميعها 20S الأساسية (CP)، نصف proteasome والمتوسطة (نصف)، مزدوجة α الدائري (DR) واحدة α الدائري (SR). يشار إلى الهجرة من عدة معايير حجم الجزيئية (في كيلو دالتون) في الحق. (C) الألف أيضا على 15٪ والمواد الهلامية SDS-PAGE. بعد الكهربائي، كانت ملطخة المواد الهلامية مع الغروية كاشف coomassie وصمة عار. يشار إلى هجرة α-له فرعية وناضجة تماما (mβ) وغير ناضجة (proβ) مفارز β. يتم عرض موقف 25 كيلو دالتون معيار الحجم الجزيئي على اليمين. وتشير النجمة على اقتطاع α-له جزء فرعية الناتجة عن التحلل البروتيني غير محددة خلال تحلل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البلازميد الطراز العرقى مصدر
AKB191 pET42 PSMA-له Kusmierczyk وآخرون، (2011)
AKB464 pET42 PSMA-له مؤسسة تنمية الموارد البشرية Kusmierczyk وآخرون، (2011)
AKB946 pET42 مؤسسة تنمية الموارد البشرية Panfair وآخرون، (2015)
AKB952 pET42 مؤسسة تنمية الموارد البشرية (R166W) Panfair وآخرون، (2015)

الجدول 1: البلازميدات البكتيرية المستخدمة في هذه الدراسة. PSMA هو archaeal الجينات α فرعية ومؤسسة تنمية الموارد البشرية هو archaeal الجينات β فرعية.

عازلة لل 50 ملي HEPES-هيدروكسيد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي MgCl 2. مخازن B، C، و E، ومشتقات العازلة والتي تحتوي على إيميدازول. ومن المفيد إضافة إيميدازول من 2 M الأوراق المالية على استعداد في المياه وتخزينها في الظلام.
عازلة حل الأصلي 375 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.8، 0.1٪ (ت / ت) ميثيلالإيثيلين (TEMED) و 0.1٪ (ث / ت) الأمونيوم Perulfate (APS). أعد جديدة لا أكثر من ساعة قبل أن جل ما أريد بلمرة وأبقى على الجليد. عند إعداد حلول هلام الأكريلاميد في المخزن حل الأصلي، فإنه من المفيد إضافة تريس، حمض الهيدروكلوريك من الأسهم 4X (1.5 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.8). وأضافت وكالة الأنباء الجزائرية مباشرة قبل البلمرة.
عازلة تشغيل الأصلي 10X الأسهم 250 ملي تريس، 1.92 M الجلايسين، لا ضبط درجة الحموضة.
5X العازلة عينة الأصلي 0.5 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.8، 50٪ (ت / ت) الجلسرين، آثار برموفينول الأزرق. آثار تشير إلى كمية صغيرة جدا، وعادة بضع حبات نقلها عبر الملعقة.
5X SDS عينة العازلة 0.3 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 600 ملي dithiothreitol (DTT)، 10٪ (ث / ت) SDS، 50٪ (ت / ت) الجلسرين وآثار برموفينول الأزرق. آثار تشير إلى كمية صغيرة جدا، وعادة بضع حبات نقلها عبر ملعقة.
عازلة تطوير 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5 و 5 ملي MgCl 2، 1 ملم ATP، 50 ملي SUC-LLVY-AMC. يمث-LLVY-AMC هو ركيزة الببتيد الفلورة المستخدمة لفحص النشاط proteasome و.

الجدول 2: حلول، وسائل الإعلام، والمخازن المستخدمة في هذه الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

علينا أن نبرهن صالح نهج موحد لتحليل التجمع proteasome والتي nondenaturing PAGE باستخدام جسيم بروتيني archaeal المؤتلف. على 9،11 الأسلوب المعتاد لcoexpression البكتيرية مفارز proteasome ويسمح للتحليل السريع ولكن قد لا تكشف عن وسيطة التجمع الرئيسية. نقترح الجمع بين coexpression مع المحللة خلط لتطوير صورة أوسع للأحداث التجمع.

وميزة هذا النهج المشترك هو أنه على الرغم من اشتراط التعبير منفصل من α وبيتا مفارز لالمحللة الاختلاط، فإنه لا يزال صديقة للعمالة نسبيا. النتائج يمكن أيضا أن تكون نصف كمي إذا كان أحد يضمن مستويات التعبير للمقارنة ومتسقة من البروتينات الفردية. تحقيقا لهذه الغاية، فإننا ننصح بتنفيذ الأمثل المعتاد التعبير البروتين المؤتلف لتحديد الظروف التي تسمح مستويات مماثلة من البروتينات وأعرب قبل المحللة الاختلاط. ويمكن أن تشمل تحسين متفاوتة تحريض تيمه، ودرجة الحرارة التعريفي، والكثافة الضوئية على الاستقراء، سلالة التعبير البكتيرية، وهلم جرا، حتى يتم تحقيق المستويات المطلوبة من البروتين القابلة للذوبان. هذا مهم بشكل خاص عند مقارنة الإصدارات WT ومتحولة من البروتين لأن في بعض الأحيان متحولة قد تظهر مستويات التعبير قابلة للمقارنة، ولكنها انخفضت الذوبان. نحن أيضا تسليط الضوء على أهمية تحديد تركيزات البروتين في عينات تنقيته ICAR قبل تحميل الصفحة nondenaturing. حتى مع الأمثل التعبير في المكان، ومع أفضل رعاية اتخاذها لضمان أن عينات موازية تتم معالجة من خلال خطوات تنقية في نفس الطريق، والتباين لا يزال من الممكن عرض عن غير قصد. وقياس تركيز يضمن أن نفس الكمية من البروتين الكلي يتم تحميل كل عينة جيدا. وهذا يجعل المقارنات حارة إلى حارة من شدة الفرقة لمعين المهاجرة الأنواع أكثر وضوحا.

إذا كانت مستويات قابلة للمقارنة ومتسقة التعبير البروتين لا يمكن أن يتحقق لlysaالشركة المصرية للاتصالات الاختلاط، يمكن للمرء دائما تنقية جميع مكونات مسبقا وتنفيذ خلط التجارب مع بروتينات نقية. وهذا له ميزة السماح للقرارات بروتين أكثر دقة، وبالتالي يجعل الكمية النهج. ومع ذلك، فإن العيب في تنقية كاملة هو أن تصبح هذه العملية أكثر من ذلك بكثير كثيفة العمالة، والتي يمكن أن تحول دون تحليل السريع للطفرات متعددة في وقت واحد 18. والتحذير النهائي الجدير بالذكر هو أنه في بعض الأحيان فصل التعبير عن α ومفارز بيتا قد لا يكون ممكنا. يمكن أن يحدث هذا إذا تحور يتسبب حدة فرعية غير قابلة للحل في كولاي عندما أعرب من تلقاء نفسها ولكن يسمح الذوبان إلى أن استعاد عندما يتم التعبير عن متحولة مع شريك الملزمة. إذا حدث هذا، فإنه سوف تحد من التحليل لcoexpression فقط. ومع ذلك، وهذا هو التحذير التي يمكن أن تنشأ خلال تعبير البروتين المؤتلف بشكل عام وليس خاصا مفارز proteasome وarchaeal 24،25.

لقد اخترنا لجنرالerate المشتقات له المعلمة من البروتينات proteasomal لدينا بسبب سهولة تنقية والقدرة على تحمل التكاليف من الراتنج ICAR. علامات حاتمة أخرى ممكنة، بما في ذلك لتنقية القائمة على الأجسام المضادة، وأبدينا بنجاح والإصدارات النقاء الموسومة علم مفارز proteasome ولدينا (لا تظهر). ومع ذلك، إذا كان مطلوبا تنقية للتجانس (أو زيادة حجم الإنتاج)، وتوفر الإصدارات له الموسومة الأسرع والأكثر فعالية من حيث التكلفة وسيلة للقيام بذلك.

هو بعينه أن النتائج التي تم الحصول عليها مع البروتينات المؤتلف، سواء كانت archaeal أو البروتينات حقيقية النواة التي تنتج في البكتيريا، سوف تكسب المزيد من معنى عندما متابعتها مع المجراة الملاحظات. ومع ذلك، قد لا يكون هذا النهج في الجسم الحي دائما الوصول إليها مباشرة تجريبيا. وهذا صحيح خصوصا عندما يكون موضوع الدراسة هو كبير، multisubunit مجمع مثل proteasome و. النهج البروتين المؤتلف توفير نقطة انطلاق هامة لfutuإعادة التجارب. في حالة proteasome و، الاقتران المؤتلف إنتاج proteasome وarchaeal مع PAGE nondenaturing سوف تستمر في أن تكون فعالة جدا في توضيح الملامح الرئيسية التجمع proteasome والتي يتم تقاسمها بين الأنواع archaeal وحقيقية النواة 9،11،12،18. ومن المرجح أن تكون مفيدة لدراسة تجميع المجمعات multiprotein الكبيرة الأخرى فضلا عن هذا النهج. في الآونة الأخيرة، استخدمنا هذه الاستراتيجية لإثبات أن جسيم بروتيني archaeal يمكن أن تجمع عبر مسار أكثر من واحد، والتي α-خواتم ليست وسيطة تلزم خلال التجمع أنهم كانوا يعتقد أن 18. يبقى أن تحدد إذا يصدق الشيء نفسه عن جسيم بروتيني حقيقية النواة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل في جزء من دعم البحوث أموال المنحة (RSFG) من جامعة إنديانا جامعة-بوردو، انديانابوليس، والجزء الآخر من جائزة من جمعية القلب الأمريكية 14GRNT20390154، إلى ARK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide (40%) solution Biorad 1610104 Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear
Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters EMDMillipore UFC501024
Ammonium Persulfate Sigma A3678
ATP Sigma A7699
BCA assay kit Pierce 23225
Bisacrylamide (2%) solution Biorad 1610142
Bromophenol blue Sigma B8026
DNaseI Sigma DN25
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher BP172
E. coli BL21 competent cells EMD Millipore 69450
GelCode Blue Thermo Fisher 24592 Colloidal coomassie stain reagent for gels
Gel doc EZ system Biorad 1708270 Gel documentation system
Gel releasers Biorad 1653320 Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.
Glass rod Thermo Fisher 11-380B
Glycerol Sigma 49767
Glycine Thermo Fisher BP3865
Hamilton syringe Thermo Fisher 14-813-38 Glass syringe for loading gels
HEPES US Biologicals H2010
HMW Native calibration kit GE Healthcare 170445-01 High molecular weight protein standards
Hoefer SG30 Thermo Fisher 03-500-277 Gradient maker
Imidazole US Biologicals 280671
IPTG US Biologicals I8500 For induction of protein expression
Isopropanol Thermo Fisher BP26181
Kanamycin sulfate US Biologicals K0010
Lysozyme Sigma L6876
MgCl2 Fluka analytical 630680
Mini Protean Tetra Cell Biorad 1658002EDU Gel electrophoresis apparatus
NaCl Thermo Fisher S640-3
NaOH Thermo Fisher S318-1
Pefabloc SC Roche 11429876001 Protease inhibitor
pET42 EMD Millipore 70562 Expression plasmid
Precision plus all blue standard Biorad 1610373 Molecular protein standard for SDS-PAGE
Quickchange mutagenesis kit Agilent technologies 200521
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Thermo Fisher BP166
Suc-LLVY-AMC Enzo lifesciences BML P802-0005 Fluorogenic substrate
Talon Metal Affinity Resin Clontech 635502 Immobilized Cobalt Affinity Resin
TEMED Sigma T7024
Tris US Biologicals T8600
Triton-X100 Sigma 93426
Tryptone Bacto BD 211699
UV sample tray Biorad 1708271 For UV imaging of gels
Yeast extract Bacto BD 212720

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
  4. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  5. Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
  6. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
  7. Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
  8. Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
  9. Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
  10. Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
  11. Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
  12. Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
  13. Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
  14. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
  15. Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
  16. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
  17. Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
  18. Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
  19. Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
  20. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
  21. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  23. Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
  24. Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
  25. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 118، proteasome و، والتجمع من البروتين، العتيقة، والبروتين المؤتلف، غير تغيير طبيعة الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد،
دراسة الجمعية proteasome ومع المؤتلف Archaeal جسيم بروتيني وNondenaturing الصفحة: حالة لنهج موحد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Panfair, D., Kusmierczyk, A. R.… More

Panfair, D., Kusmierczyk, A. R. Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE: The Case for a Combined Approach. J. Vis. Exp. (118), e54860, doi:10.3791/54860 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter