Summary
Este protocolo usa tanto co-expressão de subunidades e subunidade postlysis mistura para um exame mais aprofundado do conjunto proteassoma recombinante.
Abstract
Proteossomas são encontrados em todos os domínios da vida. Eles fornecem a principal via de degradação da proteína intracelular em eucariotas, embora a sua montagem não está completamente esclarecido. Todos os proteasomas conter uma partícula estruturalmente conservada núcleo (CP), ou proteassoma 20S, contendo dois anéis de subunidade beta heptamérico imprensado entre dois anéis de subunidades α heptamérico. Archaea proteosomas 20S são de composição simples em comparação com os seus homólogos eucarióticos, ainda que ambos partilham um mecanismo de montagem comum. Consequentemente, Archaea proteosomas 20S continuam a ser modelos importantes para a montagem do proteassoma eucariótica. Especificamente, a expressão recombinante de 20s archaeal proteasomas juntamente com não desnaturante eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) rendeu muitos insights importantes sobre a biogênese proteassoma. Aqui, discutimos um meio para melhorar a estratégia habitual de co-expressão de α proteassoma e archaea subunidades p antes nondenaturing PAGE. Nós demonstramos que, embora rápida e eficiente, uma abordagem co-expressão por si só pode perder intermediários chave de montagem. No caso de o proteassoma, a co-expressão pode não permitir a detecção da meia-proteassoma, um contendo uma completa α-anel intermédio e uma completa β-anel. No entanto, este intermediário é facilmente detectado por meio de mistura lisado. Sugerimos que a combinação de co-expressão com mistura lisado produz uma abordagem que seja mais aprofundada na análise de montagem, ainda permanece nonintensive trabalho. Esta abordagem pode ser útil para o estudo de outros complexos multiproteicos recombinantes.
Introduction
Complexos multiprotein realizar inúmeras actividades celulares críticas 1. Para muitos desses complexos, muito mais se sabe sobre sua estrutura e função do que cerca sua montagem 2,3. O proteassoma é um tal complexo e é encontrado em todos os domínios da vida. Em eucariotas, esta máquina molecular está no cerne do Sistema Proteasoma / ubiquitina (UPS) e fornece a principal via de degradação da proteína intracelular 4. O proteassoma eucariótica (referido como o proteassoma 26S) é composto de duas principais subconjuntos: um proteassoma 20S, ou partícula central (CP) 5, que pode ser tapado com uma ou ambas as extremidades por uma partícula de regulamentação 19S (RP) 6.
O proteassoma 20S é um grande protease compartimentada. A sua estrutura quaternária é absolutamente conservado em todos os domínios de vida e consiste de uma pilha de quatro anéis de sete membros contendo dois tipos de subunidades estruturalmente relacionadas, α; e p 5,7,8. Nos eucariotas, os dois anéis exteriores são cada um composto por sete sub-unidades a distintas, e os dois anéis interiores são cada um composto por sete subunidades p diferentes; actividade proteolítica reside dentro de três das subunidades p. Em contraste, os anéis de CP arquebactérias e bactérias são geralmente composta por apenas um tipo de α e um tipo de subunidade β. Proteasomas Arqueais forneceram um importante sistema modelo para estudar a montagem do proteassoma devido tanto à sua simplicidade de composição e sua partilha de um mecanismo de montagem comum com os seus homólogos eucarióticos 9-13. Em breve, subunidades a montar em anéis alfa em primeiro lugar, que servem como um andaime sobre o qual p subunidades montar. As meias-proteassomas resultantes (7 α β 7) dimerizar, dando origem a CP totalmente montado (α β 7 7 7 β α 7). Durante a dimerização, os pró-péptidos apresentar em subunidades psão autocataliticamente removida, expondo as treoninas N-terminais catalíticas. A utilização de proteossomas de arqueia para modelar montagem frequentemente leva vantagem de a produção de proteínas recombinantes de proteassoma de arqueia em Escherichia coli. Esta é uma abordagem útil porque permite que as subunidades a ser produzidos em várias combinações, como tanto a WT e versões mutantes, num organismo hospedeiro que não produz as suas próprias proteossomas.
Acompanhamento do conjunto de complexos multi-protéicos requer bioquimicamente algum tipo de método de fraccionamento que separa complexos totalmente montados a partir de intermediários de montagem e precursores. Devido à sua capacidade de resolução superior, não desnaturante em gel de poliacrilamida de electroforese (PAGE), tem provado ser especialmente úteis no fraccionamento de vários grandes complexos multiproteicos 14-17. A combinação de produção proteassoma archaeal recombinante e PAGE não desnaturante tornou-se uma abordagem poderosa em dissecting de montagem do proteassoma 9,11,12,18. No entanto, o método usual, através da qual esta abordagem é aplicada (isto é. Por meio da co-expressão recombinante de subunidades a e p) tem uma importante desvantagem. Reações de montagem são cooperativos e fortemente dependente da concentração 3. Dado que a concentração de proteínas no interior das células é muito alta 19, devido a efeitos de volume excluído, reacções de montagem proceder rapidamente in vivo. Por isso, é possível perder importantes intermediários de montagem quando aep subunidades são co-expressos.
Aqui, defendem uma abordagem combinada no estudo da montagem do proteassoma usando subunidades de proteassoma archaeal recombinantes. Nesta abordagem, ambos os métodos de mistura e co-expressão de lisado são empregues. O ex-permite a análise rápida de reunião, porque a co-expressão é menos trabalhosa. Este último depende da expressão separada de subunidades a e p, seguidos por mistura. Embora este requires um pouco mais esforço do que co-expressão, é mais do que compensada pela capacidade de detectar intermediários que são perdidas durante a co-expressão. Juntos, estes dois métodos podem fornecer um quadro mais completo de montagem do proteassoma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Expressão Bacteriana.
Nota: Os plasmídeos de expressão usados neste estudo estão descritos na Tabela 1. Soluções, meios, e tampões utilizados neste estudo estão descritos na Tabela 2. A clonagem de genes de subunidade de proteassoma e archaea a geração de plasmídeos de expressão são descritos noutro local 18,20. Em resumo, os plasmídeos para a co-expressão recombinante de subunidades empregar uma estratégia operão bicistrónico que ajuda na obtenção de níveis de expressão comparáveis de subunidades individuais 18,20. Os parâmetros de expressão enumerados abaixo foram empiricamente determinada como sendo óptima para as subunidades de proteassoma do presente estudo. Pode ser necessário optimizar a expressão de outros mutantes de proteassoma, por proteossomas de outras espécies de arqueia, ou para outros complexos de proteína recombinante (ver discussão).
- Transformar o plasmídeo de interesse expressão em E. coli quimicamente competentes BL21 (DE3) células.
- Adicionar 1 - 2 ul de plasmídeo (tipicamente 50 - 100 ng) a uma alíquota de células DE3 que foram recém-descongeladas em gelo, e continuar a incubar em gelo durante 20 min.
- O choque térmico das células a 42 ° C durante 45 s e retornar tubo para gelo para additionl 2 min.
- Adicionar 1 ml de meio LB e incubar a 37 ° C com agitação (150 rpm) durante 1 h.
- Espalhe 100-200 uL da mistura de transformação em LB-kan placas (placas contendo meio LB sólidos, suplementadas com canamicina (todos os plasmídeos usados neste estudo codificam resistência a este antibiótico)). Incubar as placas a 37 ° C O / N.
- Na manhã seguinte, inocula uma única colónia da placa de LB-kan em 3 ml de meio LB-kan líquido num tubo de cultura de vidro. Incubar a 37 ° C com agitação (150 rpm) durante cerca de 2,5-3 horas, ou até a turbidez é observado.
- Medir a densidade óptica da cultura a 600 nm (DO600) num espectrofotómetro. Diluir o culto celularure com uma quantidade apropriada de meio LB-kan pré-aquecido a uma DO 600 de 0,4, num volume final de 6 ml. Retomar a agitação a 37 ºC durante 40 min.
- Induzem a expressão de proteínas nas culturas líquidas pela adição de IPTG a partir de uma solução-mãe a uma concentração final de 1 mM. Incubar a 37 ° C com agitação (150 rpm) durante cerca de 6-7 h.
- Colher culturas de células bacterianas, na sua totalidade em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicionar 1,5 ml de uma cultura em tubo de microcentrifugação. Centrifuga-se a 10000 × g durante 1 min.
- Descartar o sobrenadante e adicionar mais 1,5 ml da mesma cultura ao sedimento. Centrifuga-se a 10000 × g durante 1 min.
- Repetir o passo 1.11 até que toda a cultura é colhida no tubo de microcentrífuga.
- Armazenar as pelotas induzidas a -80 ° C até a lise.
2. Lise bacteriana e Lisado de mistura.
Nota: (ou seja, ele verifica que a proteína foi expressa e solúvel). Assim, recomendamos incluindo análise TSP inicialmente. Uma vez que um protocolo ideal foi alcançado para uma combinação subunidade particular, a análise TSP não é estritamente necessário, que é por isso que ela é descrita como opcional abaixo.
- A lise das células bacterianas e preparação de fracções solúveis.
- Descongelar o sedimento celular induzida em gelo durante 5 min. Ressuspender o sedimento em 600 ul de tampão de lise.
- IncUbate a suspensão a 30 ° C com agitação (150 rpm) durante 30 min para gerar lisado bruto total.
Nota: A etapa seguinte e a subseção que se segue são opcionais. - Retire os dois 25 mL alíquotas a partir do ligado brutas totais em 1,5 tubos separados microcentrífuga ml e realizar análises TSP como segue.
- Para uma das duas aliquotas de 25 ml, adicionar tampão de amostra 5X de SDS para uma concentração final de 1X. Rotular o tubo com "T" para o "total de lisado bruto".
- Incubar o "T" da amostra a 100 ° C durante 5 minutos para desnaturar proteínas completamente.
- Enquanto isso, pegue a segunda alíquota de 25 mL e centrifugar-lo a 10.000 × g por 10 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a pequena pelota, e transferi-lo para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Marque esse novo tubo "S" para "fracção solúvel".
- Para os restantes behi pequena sedimentoND na etapa anterior, adicionar 25 ul de tampão de lise e vortex para ressuspender. Rotular este tubo "P" para "fração pellet".
- Adiciona-se 6 mL de tampão de amostra 5X de SDS para os "S" e "P" tubos e incuba-se a 100 ° C, como descrito acima.
Nota: Se as amostras TSP não irá ser utilizado naquele dia para analisar a expressão, que pode ser congelada a -20 ° C até ser necessário. Uma vez descongelado, eles devem ser novamente incubada a 100 ° C, como acima descrito, imediatamente antes do carregamento num gel de SDS-PAGE padrão 12% e / ou 15%.
- Enquanto a análise de TSP é levada a cabo, de centrifugação da restante 550 mL de lisado bruto total (ou a totalidade do 600 ul de lisado bruto total, se a análise do TSP é não realizado) a 10000 × g durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco. Este é o lisado solúvel que irá ser utilizada para a purificação.
- mistura lisado.
- Realizar a lise conforme descrito nos passos 2.1.1 e 2.1.2 supra.
- Misturar 600 mL de lisado bruto total desde bactérias que expressam a subunidade α desejado com 600? L de lisado bruto total desde bactérias que expressam a subunidade β desejado. Incubar a 37 ºC com agitação lenta durante 30 minutos.
Nota: Pode ser necessário para otimizar o tempo de incubação para alcançar o máximo de montagem durante lisado de mistura (ver discussão). O tempo ea temperatura apresentadas aqui são ideais para as proteínas recombinantes neste estudo e foram determinados em outro lugar 18. - Centrifugar o lisado misturada a 10000 × g durante 10 min para separar o material solúvel do sedimento insolúvel. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL. Utilize este ligado solúvel misto para a purificação de proteínas.
3. Purificação de Proteínas Imobilizadas cobalto através de afinidade em resina(ICAR).
- Equilibrar a resina.
- Completamente ressuspender a resina, invertendo o frasco e transferir 50 ul da suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifuga-se a 700 x g durante 2 min para resina de sedimento. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
Nota: realizar a aspiração da pipeta usando um azul ponta de pipeta de 1 mL para remover a maior parte do líquido. Uma dica 2 mL branco é usado para controle de multa de remoção do sobrenadante restante, deixando uma camada muito fina de líquido de cobertura das esferas. - Adicionar 1 ml de tampão A. Misture suavemente para voltar a suspender resina e centrifugar a 700 × g durante 2 min para sedimentar resina. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e repetir este passo de lavagem mais uma vez.
- Completamente ressuspender a resina, invertendo o frasco e transferir 50 ul da suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifuga-se a 700 x g durante 2 min para resina de sedimento. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
- Aplicar ligado solúvel obtido anteriormente na seção 2.1 ou 2.2 para a resina equilibrada. Incubar o tubo com uma rotação suave a 4 ºC durante 60 min. Centrifugar o tubo a 700 × g </ Em>, durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado.
- Lava-se a resina como se segue para remover as proteínas não especificamente ligadas.
- resina Ressuspender com 1 ml de tampão A e incubar com agitação suave a 4 ºC durante 10 min. Centrifuga-se o tubo a 700 × g durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. Repita este passo de lavagem mais uma vez.
- Ressuspender a resina com 1 mL de Tampão B (Tampão A com imidazole a 5 mM) e incuba-se com agitação suave a 4 ºC durante 5 min. Centrifuga-se o tubo a 700 × g durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado. Repita este passo de lavagem mais uma vez.
- Ressuspender a resina com 1 mL de tampão C (tampão A com imidazole 10 mM) e incuba-se com agitação suave a 4 ºC durante 5 min. Centrifuga-se o tubo a 700 × g durante 5 min e o sobrenadante cuidadosamente aspirado.
- Elui-se a proteína por adição de 400 uL de tampão E (tampão A com imidazole 200 mM) tO da resina. Incube com agitação suave a 4 ºC durante 5 min. Centrifuga-se a 700 x g durante 5 min.
- Transferir o sobrenadante contendo proteína purificada para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml.
- Dessalinizar a proteína purificada por centrifugação em série como se segue.
- Para 400 uL de proteína purificada, adiciona-se 100 uL de tampão A (isto reduz a concentração de imidazole de 200 mM a 160 mM). Aplicar proteína purificada a 0,5 ml de ultra-centrifuga�o filtros com um peso molecular de 10 kDa de corte. Centrifuga-se a 14000 × g durante 5 min.
- Descartar o filtrado e adicionar 400 uL de Tampão A para diluir o retentado e centrifugar novamente. Continue os ciclos de centrifugação / diluição até concentração de imidazol cai abaixo de 4 mM. Como um exemplo, se cada centrifugação concentra-se 500 ul para baixo para ~ 70 ul (ou de aproximadamente 7 vezes), em seguida, dois ciclos irá reduzir a concentração de 160 mM a partir de imidazole (7 × 7 = 49 vezes) para approximately 3,3 mm.
- Medir a concentração de proteína da amostra dessalinizada usando o ensaio BCA 21.
Nota: A dessalinização é necessária para reduzir os níveis de imidazole abaixo do limite de tolerância para o ensaio de BCA, tal como descrito nas instruções do fabricante. O nosso laboratório prefere o ensaio BCA porque é sensível, tem uma grande faixa dinâmica, e exibe muito menos variação proteína-proteína. No entanto, outros métodos para determinar a concentração de proteína pode ser substituído para o ensaio de BCA. A chave é estar ciente das vantagens e limitações de cada método.
- Adicionar tampão de amostra 5X nativo a uma concentração final de 1X e proceder-se a electroforese. Alternativamente, armazenar amostras a -20 ºC para análise posterior.
4. não desnaturante em gel de poliacrilamida eletroforese (PAGE).
Cuidado: acrilamida não polimerizado é uma neurotoxina. Desgaste gea de protecção adequador.
- Prepara-se o gel de PAGE não desnaturante como se segue.
- Prepare a cassete de gel para o vazamento usando placas de vidro limpas e lançando suporte. Coloque fabricante de gradiente no topo de um pequeno agitador magnético e coloque uma pequena barra de agitação em cada câmara.
- Usando 40% (w / v) de acrilamida e de 2% (w / v) de soluções stock bisacrilamida, preparar 5% e 10% (w / v) de soluções de gel de acrilamida em um tampão de resolução nativa. Assegure-se que a razão de acrilamida para bisacrilamida totais é de 37,5: 1. Frio em gelo antes do vazamento.
Nota: O sistema não desnaturante PAGE usado aqui é essencialmente idêntico ao sistema de SDS-PAGE de Laemmli, com SDS omitido 22. - Adicionar persulfato de amónio (de 10% (w v) / solução de estoque preparadas em água) para as soluções de acrilamida para iniciar a polimerização. A concentração final de persulfato de amónio é de 0,1% (w / v).
- Despeje a solução de acrilamida para as duas câmaras do fabricante de gradiente. Com a b tubulação de saída inseridontre as placas da cassete de gel, activar o agitador magnético e abrir as válvulas fabricante de gradiente. Despeje a 5 - em gel com gradiente não desnaturante a 10%.
- Uma vez vazada, sobrepor o gel com uma camada fina de isopropanol e permitir que o gel para polimerizar durante 30 minutos. Durante este tempo, preparar a solução de gel de acrilamida a 5% fresco em tampão de resolver nativa. Depois de os conjuntos de gel, deitar fora isopropanol e lavar a superfície do gel, com água desionizada a partir de uma garrafa de esguicho.
- Para a solução de gel de 5%, preparada antes, adicionar persulfato de amónio (exactamente como descrito em 4.1.3) e verter em cima do gel polimerizado até placas de vidro são cheios. Insira pente gel. Permitir que o gel sobreposta para polimerizar durante mais 30 min.
- Uma vez que é de gel polimerizado, montar cassete de gel no aparelho de electroforese. Alternativamente, armazenar o gel a 4 ºC, envolto em toalhas de papel umedecido e filme plástico até que esteja pronto para uso.
- Uma vez que não desnaturante em gel PAGE é montada em elecAparelho trophoresis, encher o tanque com tampão de corrida nativa 1X preparada a partir de um estoque regulador execução nativa de 10X.
- Carga de 10 ug de proteína purificada, obtida no final da secção 3, em cada poço usando uma seringa de vidro.
- Carga 2 uL de padrão de peso molecular elevado de proteína nativa (diluído em tampão de corrida nativa 1X) em um dos poços.
- Executar gel a 55 V e 4 ºC até que a frente de corante é executado fora do gel (cerca de 4-4,5 h).
- Em adição ao gel não desnaturante, analisar-se alíquotas da proteína purificada por SDS-PAGE padrão 22.
- Misturar-se alíquotas (10 ug) das amostras de proteínas purificadas, obtidas no final da secção 3, com tampão SDS-amostra 5X a uma concentração final de 1X.
- Incubar a 100 ºC durante 5 min e carregar no padrão de 12% e / ou 15% de géis de SDS-PAGE 22.
- Executar a 80V durante 20 min e em seguida a 120 V até a frente do corante foge do gel (isto é, aproximadamente, um suplementoitional 75 min para um gel a 12%, e 120 minutos para um gel a 15%).
5. Actividade visualização e coloração da proteína.
- Após a electroforese, as placas de vidro separadas e transferir cuidadosamente o gel não desnaturante para um tabuleiro de gel contendo 50 mL de água desionizada. Lavar o gel com balanço delicado por 5 min. Descarte de água e repita esta etapa de lavagem três vezes.
- Realizar ensaio de sobreposição de substrato como se segue.
- Adicione 1 mL de desenvolver tampão contendo o substrato peptídeo fluorogénico Suc-LLVY-AMC e espalhe uniformemente sobre o gel. Incubar a 37 ºC durante 30 min.
Nota: Uma vareta de vidro ou de um libertador de gel (pequena cunha de plástico usado para placas de vidro separadas) pode ser usado para espalhar o líquido sobre o gel. - Transferir cuidadosamente o gel sobre o transiluminador de UV de sistema de imagem do gel e observar fluorescência devida ao substrato péptido clivado. imagem Record. transferir cuidadosamente os ba gelck para a bandeja de gel.
- Lavar o gel duas vezes com 50 mL de água desionizada durante 5 min com agitação suave.
- Corar o gel com 10 ml de um reagente de coloração de Coomassie coloidal durante 60 minutos com agitação suave. gel Destain com 50 mL de água até o fundo se torna claro. Este passo aplica-se a coloração dos géis de SDS-PAGE bem como padrão.
- Adicione 1 mL de desenvolver tampão contendo o substrato peptídeo fluorogénico Suc-LLVY-AMC e espalhe uniformemente sobre o gel. Incubar a 37 ºC durante 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Montagem de proteassoma (Figura 1) começa quando sub-unidades a combinam-se para 9 formam anéis. Isto pode ser ilustrado quando subunidades alfa do archaeon Methanococcus maripaludis S2 são expressas em E. coli como C-terminal de hexa-histidina com etiquetas (His-tag) derivados (Tabela 1). Quando o α-His recombinante foi purificada por ICAR e analisadas por PAGE não desnaturante, duas bandas foram observadas (Figura 2A, pista 1). Temos demonstrado anteriormente que estes correspondem aos anéis simples a (SR) e de casal alfa-Rings (DR) 18. A DR é uma espécie de beco sem saída que não é produtivo para a montagem posterior 9,18.
Quando os ácido a-subunidades foram co-expressa com as subunidades p, que representa o método usual, através da qual a montagem de proteossomas de arqueia recombinantes é ensaiada, foi observada uma nova espécie migrar perto do carrinho 670 kDa de tamanhoard (Figura 2A, pista 3). Esta espécie foi proteoliticamente activa (Figura 2B, faixa 3) e continha subunidades p única completamente maduros (mβ) cujo pró-péptidos foram removidos (Figura 2C, faixa 3). Esta espécie é a CP totalmente maduro. Esta amostra também continha algumas espécies SR, o que era esperado, porque SR é um conjunto intermediário conhecido, mas nenhuma espécie DR. A falta de DR quando a- dele e subunidades p são co-expressos sugere que a montagem correta estava ocorrendo rápido o suficiente tal que a incorporação de subunidades p era capaz de superá a formação improdutivo de DR (para uma análise mais detalhada, ver 18).
Para demonstrar a limitação do método de co-expressão, e defendem a utilidade de uma abordagem combinada, α-a e subunidades p foram expressas separadamente em E. coli. Após a lise, as fracções solúveis foram misturados e as proteínas foram purificadas por ICAR antesA análise por PAGE não desnaturante. Totalmente proteossomas funcionais, também foram gerados através do método de mistura lisado (Figura 2A e 2B, pista 2), e as espécies SR também foi observada como esperado. O reaparecimento das espécies Dr em lisado de mistura da amostra indica que, uma vez formada, subunidades p não são capazes de desmontar-se reversivelmente; isto sublinha a natureza sem saída do DR. Curiosamente, uma nova espécie também apareceu na amostra de lisado de mistura, migrando logo abaixo da CP (denominado "meio"). Recentemente, mostrámos que esta espécie corresponde à meia-proteassoma (a 7 β 7) 18. Para ilustrar este aqui, foi empregado um mutante da subunidade β (R166W). Esta mutação perturba β-β interação anel, levando a meia-proteasomas dimerização prejudicada 18. Desde meias-proteasomas são os precursores imediatos para CP, a mutação R166W deve levar tanto a acumulação de meio-proteasomas umda diminuição na formação de CP. Quando lisado de mistura com a-subunidades suas e p (R166W) foi levada a cabo, foram observados níveis mais baixos de PB e os níveis aumentados de "meia" espécies (Figura 2A, pista 4). Isto é consistente com uma relação de produto precursor para estas duas faixas, e confirma a identidade das espécies de "meia" como a meia-proteassoma. A migração ligeiramente mais rápido da meia-proteassoma na amostra mutante (pista 4 contra a pista 2) é provavelmente devido à mutação R166W alterando a razão massa-carga da subunidade β.
A habilidade de visualizar a meia-proteassoma durante a mistura lisado é devido, principalmente, às concentrações de proteína muito mais baixas do lisado quando comparado com as concentrações elevadas de proteínas dentro das células. Concentrações mais baixas resultar em menos eficiente a montagem (isto é, mais lenta), a qual permite intermediários para se tornar mais povoadas e, portanto detectável. Além disso a aparência da meia-proteassoma, uma observação adicional destaca a eficiência de montagem diminuiu durante mistura lisado: subunidades p não transformados, que mantenham as suas pr�p�tidos, se tornar detectável (proβ). Dado que o processamento propéptido não ocorre até metade proteossomas dimerizam, a aparência da forma imatura proβ correlaciona-se com o nível de acumulação de meia-proteassoma (comparar Figura 2C, faixa 3 contra pista 2 versus pista 4). No caso de o mutante R166W, a falha de processamento propéptido durante a mistura lisado é absoluta, embora uma pequena quantidade de PB se forma. Isto é porque o processamento de pró-péptido não só requer a dimerização meia-proteassoma, mas também uma interface de anel β-β adequadamente-formado 23 que a mutação R166W não pagar. Uma narrativa mais detalhada do co-expressão contra a mistura lisado, no que se refere à montagem do proteassoma recombinante, pode ser encontrada aqui 18.
gura 1 "src =" / files / ftp_upload / 54860 / 54860fig1.jpg "/>
Figura 1: um diagrama esquemático simplificado da montagem da partícula (CP) do núcleo.
As sub-unidades a podem montar em um único α-anel primeiro (SR), que serve como molde para a incorporação de sub-unidades beta. Isto conduz à geração da meia-proteassoma intermediário (metade) que dimeriza rapidamente. Concomitante com a dimerização, os pró-péptidos de subunidades β (não representados) são removidos autocataliticamente dando origem à partícula de núcleo totalmente funcional (CP). alfa-anéis duplos (DR) podem surgir de SR e não são competentes para montagem em CP. Sua formação representa uma via de montagem improdutivo (seta tracejada) em contraste com eventos de montagem produtivas (setas sólidas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: uma abordagem combinada para a Assembleia Proteasoma ensaio.
A co-expressão (C) e lisado de mistura (G) foram utilizados para estudar a montagem dos proteassomas recombinantes do archaeon M. maripaludis. As proteínas foram purificadas por Imobilizado Cobalt Affinity Resin (ICAR). (A, B) As proteínas purificadas (10 ug) foram carregadas em 5 desnaturantes não - géis de gradiente de 10%. Após a electroforese, a actividade de peptidase foi visualizado através da sobreposição do gel com uma solução tampão que contém o substrato de péptido fluorogénico Suc-LLVY-AMC (B) antes da coloração do gel com o reagente de coloração de Coomassie coloidal (A). pontas de setas pretas indicam as posições do núcleo de partícula 20S montados (CP), meia-proteassoma intermediário (metade), duplo α-anel (DR) e α anel único (SR). A migração de vários padrões de tamanho molecular (em kDa) está indicada à direita. (C) A também foram carregadas em géis de 15% SDS-PAGE. A seguir à electroforese, os geles foram corados com um reagente de coloração de Coomassie coloidal. Migração de α-a subunidade e totalmente maduro (mβ) e imaturos (proβ) subunidades p é indicado. A posição do padrão de tamanho molecular de 25 kDa é mostrado à direita. O asterisco indica uma α-seu fragmento da subunidade truncada resultante da proteólise durante a lise não específica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| plasmídeo | Genótipo | Fonte |
| AKB191 | pET42 PSMA-His | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB464 | pET42 PSMA sua psmB | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB946 | pET42 psmB | Panfair et al., (2015) |
| AKB952 | pET42 psmB (R166W) | Panfair et al., (2015) |
Tabela 1: Os plasmídeos bacterianos utilizados neste estudo. PSMA é o gene da subunidade α e archaea psmB é o gene da subunidade β archaea.
| tampão A | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2. | Os tampões B, C, e E, são derivados de tampão A contendo imidazole. É útil para adicionar imidazole a partir de um estoque a 2 M preparada em água e armazenadas no escuro. |
| tampão resolução nativa | 375 mM de Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% (v / v) tetrametiletilenodiamina (TEMED) e 0,1% (w / v) de amónio Perulfate (APS). | Preparado fresco não mais do que uma hora antes de gel é para ser polimerizado e mantido em gelo. Ao preparar soluções de gel de acrilamida em tampão a resolução nativa, é útil para adicionar o Tris-HCl a partir de um estoque 4X (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8). O EPA é adicionado imediatamente antes da polimerização. |
| tampão de corrida nativa 10X estoque | Tris 250 mM, 1,92 M de glicina, não ajustar o pH. | |
| tampão de amostra nativo de 5X | 0,5 M de Tris-HCl, pH 8,8, 50% (v / v) de glicerol, traços de azul de bromofenol. | Traços refere-se a uma quantidade muito pequena, normalmente alguns grãos transferidos através espátula. |
| 5X SDS-amostra tampão | 0,3 M de Tris-HCl, pH 6,8, ditiotreitol 600 mM (DTT), 10% (w / v) de SDS, 50% (v / v) de glicerol e vestígios de azul de bromofenol. | Traços refere-se a uma quantidade muito pequena, normalmente alguns grãos transferidos através espátula. |
| tampão desenvolvimento | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM de MgCl2, 1 mM de ATP, 50 mM de Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC é um substrato peptídeo fluorogénico utilizado para ensaiar a actividade de proteassoma. |
Tabela 2: Soluções, mídia e tampões usados neste estudo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nós demonstramos o benefício de uma abordagem combinada à análise de montagem do proteosoma pelo não desnaturante PAGE utilizando proteasomas archaeal recombinantes. O método usual de 9,11 a co-expressão bacteriana de subunidades de proteassoma permite a análise rápida mas pode não revelar intermediários chave de montagem. Sugerimos combinando co-expressão com ligado misturando a desenvolver um quadro mais amplo de eventos de montagem.
A vantagem desta abordagem combinada é que apesar de requerer a expressão separada do α e p subunidades para a mistura lisado, ainda é relativamente amigável-de-obra. Os resultados também podem ser semi-quantitativo se garante níveis de expressão compatíveis e comparáveis das proteínas individuais. Para este fim, recomenda-se a realização da optimização habitual da expressão da proteína recombinante para determinar as condições que permitem que níveis comparáveis de proteínas expressas antes da mistura lisado. Otimização pode incluir variáveis de indução time, temperatura de indução, a densidade óptica no momento da indução, estirpe de expressão bacteriana, e assim por diante, até que os níveis desejados de proteína solúvel são alcançados. Isto é especialmente importante quando se compara versões WT e mutantes de uma proteína porque, por vezes, o mutante podem exibir níveis de expressão comparáveis, mas diminuição da solubilidade. Destacamos também a importância de determinar concentrações de proteína das amostras purificadas-ICAR antes de carregar o PAGE não desnaturante. Mesmo com optimização expressão no lugar, e com o melhor cuidado para assegurar que as amostras são processadas em paralelo através dos passos de purificação da mesma maneira, a variação pode ainda ser inadvertidamente introduzido. Uma medição da concentração garante que a mesma quantidade de proteína total é carregado por poço de amostra. Isso faz com que comparações faixa-a-faixa de intensidades de banda para um determinado espécies migratórias mais significativa.
Se os níveis comparáveis e consistentes de expressão de proteínas não pode ser conseguido, por lysate de mistura, sempre se pode purificar todos os componentes de antemão e realizar experimentos de mistura com proteínas puras. Isto tem a vantagem de permitir determinações de proteína mais precisos e, portanto, faz com que a abordagem quantitativa. No entanto, o inconveniente de purificação completa é que o processo se torna consideravelmente mais trabalhoso, o que pode impedir uma rápida análise de mutantes múltiplos simultaneamente 18. Uma advertência final vale a pena mencionar é que às vezes separar expressão de α e subunidades p pode não ser possível. Isto pode ocorrer se uma mutação faz com que uma subunidade a ser insolúveis em E. coli quando expresso por si só, mas permite que a solubilidade para ser recuperado quando o mutante é expresso com o seu parceiro de ligação. Se isso ocorrer, ele irá limitar a análise a co-expressão única. No entanto, esta é uma advertência de que podem surgir durante a expressão de proteína recombinante em geral, e não é específico para as subunidades de proteassoma Archaea, 24,25.
Optamos por genrar derivados his-tag de nossas proteínas proteossomo devido à facilidade de purificação e de acessibilidade da resina ICAR. Outros marcadores de epitopo são possíveis, incluindo aqueles para a purificação à base de anticorpos, e que se expressa com êxito e versões purificadas marcado com FLAG dos nossos subunidades de proteassoma (não mostrado). No entanto, se for necessária purificação até à homogeneidade (ou aumentar a escala de produção), as versões marcadas com His fornecer os meios mais rápidos e mais rentável de fazê-lo.
É um dado que os resultados obtidos com proteínas recombinantes, sejam eles de archaea, ou proteínas eucarióticas produzidas em bactérias, vai ganhar ainda mais sentido quando seguiu com observações in vivo. No entanto, uma abordagem in vivo pode não ser sempre imediatamente acessível experimentalmente. Isto é especialmente verdadeiro quando o objeto de estudo é um grande, múltiplas subunidades complexo como o proteassoma. proteína recombinante abordagens fornecem um importante ponto de partida para future experiências. No caso do proteassoma, o emparelhamento de produção proteassoma archaeal recombinante com PAGE não desnaturante continuará a ser muito eficaz na elucidação das principais características do conjunto do proteassoma, que são compartilhados entre as espécies archaea e eucariotas 9,11,12,18. Tal abordagem é susceptível de ser útil para estudar a montagem de outros complexos multiproteicos grandes bem. Recentemente, foi utilizado esta estratégia para demonstrar que proteasomas archaeal pode montar através de mais de um caminho, e que os alfa-rings não são os intermediários obrigatórios durante a montagem que eles foram pensados para ser 18. Ele continua a ser determinado se o mesmo vale para proteasomas eucarióticas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por uma fundos de apoio Grant Research (RSFG) da Universidade de Indiana University-Purdue, Indianapolis, e em parte por um prêmio da American Heart Association 14GRNT20390154, a ARK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R.
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W.
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
