Summary
Denne protokol bruger både subunit coekspression og postlysis underenhed blanding for en mere grundig undersøgelse af rekombinant proteasom forsamling.
Abstract
Proteasomer findes i alle områder af livet. De giver den største rute intracellulær proteinnedbrydning i eukaryoter, selvom deres samling ikke er helt forstået. Alle proteasomer indeholde en strukturelt konserveret kernepartikel (CP), eller 20S proteasom, der indeholder to heptamere p subunit ringe anbragt mellem to heptamere α subunit ringe. Arke 20S proteasomer er deres sammensætning enklere i forhold til deres eukaryote kolleger, men de begge deler en fælles samling mekanisme. Derfor arke 20S proteasomer fortsat være vigtige modeller for eukaryote proteasom forsamling. Specifikt har rekombinant ekspression af arke 20S proteasomer kombineret med ikke-denaturerende polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) gav mange vigtige indsigter i proteasom biogenese. Her diskuterer vi et middel til at forbedre den sædvanlige strategi coekspression af arke proteasom α og p underenheder før nondenaturing PAGE. Vi viser, at selv om hurtig og effektiv, kan en co-ekspression tilgang alene brænde centrale montage mellemprodukter. I tilfælde af proteasomet, kan co-ekspression ikke tillade detektion af den halve proteasomet, et mellemprodukt indeholdende et komplet α-ring og en komplet β-ring. Imidlertid er dette mellemprodukt let påvises via lysat blanding. Vi foreslår, at kombinere co-ekspression med lysat blanding giver en tilgang, der er mere grundig i at analysere forsamling, men forbliver arbejdskraft nonintensive. Denne fremgangsmåde kan være nyttig til undersøgelse af andre rekombinante multiprotein komplekser.
Introduction
Multiprotein komplekser udfører mange kritiske cellulære aktiviteter 1. For mange af disse komplekser, er meget mere viden om deres struktur og funktion end om deres samling 2,3. Proteasomet er et sådant kompleks og findes i alle områder af livet. I eukaryoter, denne molekylære maskine er kernen i Ubiquitin / Proteasome System (UPS) og giver den største rute intracellulær proteinnedbrydning 4. Den eukaryote proteasomet (benævnt 26S proteasomet) består af to store sub enheder: en 20S proteasom eller kernepartiklen (CP) 5, som kan blive udjævnet på en eller begge ender med en 19S Regulatory Particle (RP) 6.
Den 20S proteasomet er en stor ruminddelt protease. Dens kvaternære struktur er helt bevaret på tværs af alle områder af livet og består af en stak af fire syv-leddede ringe indeholdende to typer af strukturelt beslægtede underenheder, α; og p 5,7,8. I eukaryoter, er de to ydre ringe hver består af syv forskellige a-underenheder og to indre ringe omfatter hver syv forskellige p-underenheder; proteolytisk aktivitet bopæl inden tre af p-underenheder. Derimod er CP ringe af archaea og bakterier består sædvanligvis af kun en type α og én type β underenhed. Arke proteasomer har givet et vigtigt modelsystem til at studere proteasom samling på grund af både deres kompositoriske enkelhed og deres deler en fælles samling mekanisme med deres eukaryote modstykker 9-13. Kort fortalt, a-underenheder samles til a ringe første, der tjener som et stillads, på hvilket p underenheder samle. De resulterende halve proteasomer (α 7 β 7) dimeriserer, der giver anledning til fuldt samlet CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Under dimerisering, propeptiderne stede på p-underenhederer autokatalytisk fjernes, og udsætter de katalytiske N-terminale threoniner. Anvendelsen af arke proteasomer at modellere samling ofte drager fordel af produktionen af rekombinante arke proteasom proteiner i Escherichia coli. Dette er et værdifuldt fremgangsmåde, fordi den gør det muligt underenhederne, der skal produceres i forskellige kombinationer, som både WT og mutant versioner, i en værtsorganisme, der ikke producerer sine egne proteasomer.
Overvågning samlingen af multi-proteinkomplekser kræver biokemisk eller anden form for fraktionering metode, der adskiller færdigsamlede komplekser fra assembly mellemprodukter og precursorer. På grund af sin overlegne løse kapacitet, ikke-denaturerende polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) har vist sig at være særligt anvendelige i fraktioneringen af forskellige store multiprotein komplekser 14-17. Kombinationen af rekombinant arke proteasom produktion og ikke-denaturerende PAGE er blevet en kraftfuld tilgang dissecting proteasom samling 9,11,12,18. Men den sædvanlige fremgangsmåde, hvorved denne metode anvendes (dvs.. Via rekombinante coekspression af a- og p-underenheder) har en vigtig ulempe. Assembly reaktioner er samarbejdsvillig og stærkt koncentrationsafhængig 3. Da proteinkoncentrationen i celler er meget høj 19, på grund af udelukkede volumen virkninger, assembly reaktioner foregår hurtigt in vivo. Derfor er det muligt at gå glip af vigtige assembly mellemprodukter når a- og p-underenheder er co-udtrykt.
Her vil vi argumentere for en kombineret tilgang i studiet af proteasom samling anvendelse af rekombinante arke proteasom underenheder. I denne fremgangsmåde er både coekspression og lysat blandingsmetoder anvendes. Førstnævnte tillader hurtig analyse af samlingen, fordi co-ekspression er mindre arbejdskrævende. Sidstnævnte afhænger separat ekspression af a- og p-underenheder, efterfulgt af blanding. Selvom dette vandskraveneres en smule mere indsats end co-ekspression, er det mere end opvejes af evnen til at opdage mellemprodukter, der mistede under co-ekspression. Sammen kan de to metoder giver et mere fuldstændigt billede af proteasom forsamling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakterieekspression.
Bemærk: Ekspressionsplasmider anvendt i denne undersøgelse, er beskrevet i tabel 1. Opløsninger, medier og buffere anvendt i denne undersøgelse, er beskrevet i tabel 2. Kloningen af arke proteasom subunit gener og frembringelsen af ekspressionsplasmider er beskrevet andetsteds 18,20. Kort fortalt plasmider til rekombinant coekspression af underenheder anvender en bicistronisk operon strategi, som hjælper med at opnå sammenlignelige ekspressionsniveauer af enkelte underenheder 18,20. Ekspressionsniveauerne parametre er anført nedenfor var empirisk bestemt at være optimalt for proteasom underenheder i denne undersøgelse. Det kan være nødvendigt at optimere ekspression af andre proteasom mutanter, for proteasomer fra andre arke arter, eller for andre rekombinante proteinkomplekser (se Diskussion).
- Transform ekspressionsplasmid af interesse i kemisk kompetente E. coli BL21 (DE3) celler.
- Tilsæt 1 - 2 pi plasmid (typisk 50 - 100 ng) til en alikvot af DE3 celler, som var frisk optøet på is, og fortsætte med at inkubere på is i 20 minutter.
- Varmechok cellerne ved 42 ° C i 45 s og returrør til is i additionl 2 min.
- Der tilsættes 1 ml LB-medium og inkuberes ved 37 ° C under omrystning (150 rpm) i 1 time.
- Spred 100 - 200 pi af transformationsblandingen på LB-kan plader (plader indeholdende faste LB-medier suppleret med kanamycin (alle plasmider anvendt i denne undersøgelse indkode resistens over for dette antibiotikum)). Pladerne inkuberes ved 37 ºC O / N.
- Næste morgen inokuleres en enkelt koloni fra LB-kan plade i 3 ml flydende LB-kan medier i et glas kultur rør. Der inkuberes ved 37 * C under omrystning (150 rpm) i ca. 2,5 - 3 timer, eller indtil turbiditet iagttages.
- Mål den optiske densitet af kulturen ved 600 nm (OD600) i et spektrofotometer. Fortynd cellen kulture med en passende mængde forvarmet LB-can be medier til en OD600 på 0,4 i et slutvolumen på 6 ml. Genoptag omrystning ved 37 ºC i 40 minutter.
- Inducere proteinekspression i de flydende kulturer ved tilsætning af IPTG fra en stamopløsning til en slutkoncentration på 1 mM. Der inkuberes ved 37 * C under omrystning (150 rpm) i ca. 6 - 7 timer.
- Harvest bakterielle cellekulturer i deres helhed i 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilføj 1,5 ml af en kultur i mikrocentrifugerør. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 1 min.
- Supernatanten fjernes, og tilføje yderligere 1,5 ml af den samme kultur til pelleten. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 1 min.
- Gentag trin 1.11, indtil hele kulturen høstes i mikrocentrifugerør.
- Opbevar de inducerede pellets ved -80 ° C indtil lysis.
2. Bakteriel Lysis og lysat Mixing.
Note: (dvs. den kontrollerer, at protein blev udtrykt og opløselig). Således anbefaler vi herunder TSP analyse i første omgang. Når en optimal protokol er opnået for en bestemt underenhed kombination, er TSP analyse ikke strengt nødvendigt, hvorfor det er beskrevet som ekstraudstyr nedenfor.
- Lysis af bakterieceller og fremstilling af opløselige fraktioner.
- Optø den inducerede cellepellet på is i 5 min. Pellet resuspenderes i 600 pi lysisbuffer.
- IncUbate suspensionen ved 30 ºC under omrystning (150 rpm) i 30 min for at generere samlede råt lysat.
Bemærk: Følgende trin og underafsnit, der følger er valgfri. - Fjern to 25 pi prøver fra den samlede rå lysat i separate 1,5 ml mikrocentrifugerør og udføre TSP analyse som følger.
- Til en af de to 25 pi alikvoter, tilføje 5X SDS-prøvebuffer til en slutkoncentration på 1X. Mærk røret med "T" til "total rå lysat".
- Inkubér "T" prøve ved 100 ºC i 5 min til helt denaturere proteiner.
- I mellemtiden tager den anden 25 uL portion og centrifugere det ved 10.000 x g i 10 min. Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre den lille pille, og overføre det til en ny 1,5 ml mikrocentrifugerør. Mærk denne nye rør "S" for "opløselig fraktion".
- Til den lille pille venstre behind i det foregående trin, tilsættes 25 pi lysisbuffer og vortex for at resuspendere. Mærk dette rør "P" for "pellet fraktion".
- Tilføj 6 pi 5X SDS prøve buffer til "S" og "P" rør og inkuberes ved 100 ºC, som beskrevet ovenfor.
Bemærk: Hvis TSP prøverne ikke skal bruges den dag til at analysere udtryk, kan de fryses ved -20 ºC indtil brug. Når optøet, skal de inkuberes igen ved 100 ºC, som beskrevet ovenfor, umiddelbart før de lastes på en 12% og / eller 15% standard SDS-PAGE-gel.
- Medens TSP analysen udføres, centrifugeres den resterende 550 pi total råt lysat (eller hele 600 pi samlede rålysat hvis TSP analyse udføres ikke) ved 10.000 x g i 10 min. Opsaml supernatanten i en frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør. Dette er den opløselige lysat, der skal bruges til oprensning.
- Lysat blanding.
- Udfør lyse som beskrevet i trin 2.1.1 og 2.1.2 ovenfor.
- Bland 600 pi total råt lysat fra bakterier, der udtrykker det ønskede α-underenheden med 600 pi total råt lysat fra bakterier, der udtrykker det ønskede β-underenheden. Der inkuberes ved 37 * C med langsom rystning i 30 min.
Bemærk: Det kan være nødvendigt at optimere inkubationstid for at opnå maksimal samling under lysat blanding (se Diskussion). Tiden og temperaturen præsenteres her er optimale for de rekombinante proteiner i denne undersøgelse, og blev bestemt andre steder 18. - Centrifuger blandede lysat ved 10.000 x g i 10 min for at separere opløselige materiale fra uopløselige pellet. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Brug denne blandede opløselige lysat i proteinoprensning.
3. Protein Purification via immobiliseret Cobalt Affinity Resin(ICAR).
- Ækvilibrering af harpiksen.
- Grundigt resuspender resinet ved at vende flasken og overføre 50 pi af opslæmningen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Der centrifugeres ved 700 x g i 2 minutter for at pelletere harpiks. aspirere omhyggeligt supernatant.
Bemærk: Vi udfører pipette aspiration ved anvendelse af en blå 1 ml pipettespids for at fjerne hovedparten af væsken. En hvid 2 pi spids anvendes til fin styring af fjernelse af den resterende supernatant, hvilket efterlader et meget tyndt lag væske dækker perlerne. - Tilsæt 1 ml buffer A. Bland forsigtigt at resuspendere harpiks og der centrifugeres ved 700 x g i 2 minutter for at pelletere harpiks. aspirere omhyggeligt supernatanten og gentag dette vasketrin en gang til.
- Grundigt resuspender resinet ved at vende flasken og overføre 50 pi af opslæmningen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Der centrifugeres ved 700 x g i 2 minutter for at pelletere harpiks. aspirere omhyggeligt supernatant.
- Påfør opløselige lysat tidligere opnåede i afsnit 2.1 eller 2.2 til ligevægt harpiks. Inkubér røret med forsigtig rotation ved 4 * C i 60 minutter. Centrifugeres røret ved 700 x g </ Em> i 5 minutter og forsigtigt aspirere supernatanten.
- harpiksen vaskes som følger for at fjerne ikke-specifikt bundne proteiner.
- Resuspender harpiks med 1 ml puffer A og inkuberes under forsigtig vipning ved 4 * C i 10 minutter. Centrifugeres røret ved 700 x g i 5 minutter og forsigtigt aspirere supernatanten. Gentag dette vasketrin en gang til.
- Resuspender harpiksen med 1 ml puffer B (puffer A med 5 mM imidazol) og inkuberes under forsigtig vipning ved 4 * C i 5 minutter. Centrifugeres røret ved 700 x g i 5 minutter og forsigtigt aspirere supernatanten. Gentag dette vasketrin en gang til.
- Resuspender harpiksen med 1 ml buffer C (buffer A med 10 mM imidazol) og inkuberes under forsigtig vipning ved 4 * C i 5 minutter. Centrifugeres røret ved 700 x g i 5 minutter og forsigtigt aspirere supernatanten.
- Eluering af proteinet ved tilsætning af 400 pi buffer E (buffer A med 200 mM imidazol) to harpiksen. Der inkuberes med blide vuggende ved 4 ºC i 5 min. Der centrifugeres ved 700 x g i 5 min.
- Overfør supernatanten indeholdende oprenset protein til en ny 1,5 ml centrifugerør.
- Afsalte oprenset protein ved seriel centrifugering som følger.
- Til 400 pi oprenset protein, tilsættes 100 pi Buffer A (dette reducerer imidazolkoncentration fra 200 mM til 160 mM). Påfør oprenset protein til 0,5 ml ultracentrifugal filtre med en 10 kDa molekylvægtsafskæring-off. Der centrifugeres ved 14.000 x g i 5 min.
- Kassér filtrat og tilsættes 400 pi Buffer A at fortynde retentatet og centrifugeres igen. Fortsæt cyklusser centrifugering / fortynding indtil imidazolkoncentration falder under 4 mM. Som et eksempel, hvis hver centrifugation koncentrater 500 pi ned til ~ 70 pi (eller ca. 7 gange), derefter to cyklusser vil reducere start 160 mM imidazol koncentration (7 × 7 = 49-fold) til ca.oximately 3,3 mm.
- Mål proteinkoncentration afsaltede prøve ved anvendelse af BCA-assay 21.
Bemærk: Afsaltning er forpligtet til at reducere Imidazol niveauer under tolerancegrænse for BCA assay, som beskrevet i producentens anvisninger. Vores laboratorium foretrækker BCA assay, fordi det er følsomt, har et stort dynamisk område, og udviser meget mindre protein-til-protein variation. Imidlertid kan andre metoder til at bestemme proteinkoncentration erstattes BCA assay. Det centrale er at være opmærksom på hver metodens fordele og begrænsninger.
- Tilføj 5X native prøvebuffer til en slutkoncentration på 1X og fortsæt til elektroforese. Alternativt, gemme prøver ved -20 ºC til senere analyse.
4. Ikke-denaturerende polyacrylamidgelelektroforese (PAGE).
Forsigtig: Upolymeriseret acrylamid er en nervegift. Bær passende beskyttelsesudstyr gear.
- Forbered denaturerende PAGE-gel som følger.
- Forbered gel kassette til støbning ved hjælp rene glasplader og støbning stativ. Placer gradient maker på toppen af en lille magnetomrører og placere en lille omrører i hvert kammer.
- Anvendelse af 40% (vægt / volumen) acrylamid og 2% (vægt / volumen) bisacrylamid stamopløsninger, forberede 5% og 10% (vægt / volumen) acrylamid gel opløsninger i en nativ løse buffer. Sørg for, at forholdet mellem den samlede acrylamid at bisacrylamid er 37,5: 1. Chill på is før hælde.
Bemærk: denaturerende SIDE system, der anvendes her er det væsentlige identisk med den Laemmli SDS-PAGE-system, med SDS udeladt 22. - Tilføj ammoniumpersulfat (fra en 10% (vægt / volumen) stamopløsning fremstilles i vand) til de acrylamid løsninger til at initiere polymerisering. Slutkoncentration på ammoniumpersulfat er 0,1% (vægt / volumen).
- Hæld acrylamid løsninger i de to kamre i gradient maker. Med afgangen slange indsat between pladerne af gel kassette, aktivere magnetomrører og åbne gradient maker ventiler. Hæld 5 - denaturerende gradient gel 10%.
- Når hældes, overlejrer gelen med et tyndt lag af isopropanol og tillade gelen at polymerisere i 30 minutter. I løbet af denne tid, forberede frisk 5% acrylamidgel opløsning i nativ løsning puffer. Efter gelen sæt, hæld isopropanol og skyl toppen af gelen med deioniseret vand fra en sprøjteflaske.
- Til 5% gel opløsning fremstillet ovenfor, tilsættes ammoniumpersulfat (nøjagtigt som beskrevet i 4.1.3) og hæld på toppen af den polymeriserede gel indtil glasplader er fulde. Indsæt gel kam. Tillad overlejret gelen polymerisere i yderligere 30 min.
- Når gelen er polymeriseret, samle gel kassetten i elektroforese apparat. Alternativt, gemme gelen ved 4 ºC, pakket ind i fugtede papirhåndklæder og plast wrap indtil den er klar til brug.
- Når ikke-denaturerende PAGE-gel er samlet i elektrophoresis apparat, fyld tanken med 1X indfødte kører buffer forberedt frisk fra en 10X indfødt kører buffer lager.
- Belastning 10 ug oprenset protein, opnået i slutningen af afsnit 3, i hver brønd med et glas sprøjte.
- Belastning 2 pi høj molekylvægt native protein standard (fortyndet i 1X native løbebufferen) i en af brøndene.
- Kør gel ved 55 V og 4 ºC, indtil farvefronten løber af gel (ca. 4 - 4,5 timer).
- Ud over den ikke-denaturerende gel, analysere prøver af oprensede protein ved standard SDS-PAGE 22.
- Bland portioner (10 ug) af det rensede protein prøver, opnået i slutningen af afsnit 3, med 5X SDS-prøve buffer til en slutkoncentration på 1X.
- Inkuber ved 100 ºC i 5 min og indlæse på standard 12% og / eller 15% SDS-PAGE-geler 22.
- Kørt ved 80V i 20 minutter og derefter ved 120 V, indtil farvefronten løber af gelen (dette er omtrent en addtionelle 75 min i en 12% gel og 120 minutter for en 15% gel).
5. Visualisering Aktivitet og Protein Farvning.
- Efter elektroforese omhyggeligt adskilte glasplader og overfør denaturerende gel til en gel bakke indeholdende 50 ml deioniseret vand. Skyl gel med forsigtig vipning i 5 minutter. Kassér vandet og gentage dette vasketrin tre gange.
- Udfør substrat overlay assay som følger.
- Tilsæt 1 ml udvikle buffer indeholdende det fluorogene peptidsubstrat Suc-LLVY-AMC og spredes ensartet over gelen. Der inkuberes ved 37 ºC i 30 minutter.
Bemærk: En glasstang eller en gel releaser (lille kile af plast, der anvendes til separate glasplader) kan anvendes til at sprede væsken over gelen. - overføre forsigtigt gelen på UV-transilluminator af gelen imaging system og observere fluorescens som følge af det spaltede peptidsubstrat. Optag billedet. overføre forsigtigt gel back til gelen bakken.
- Skyl gelen to gange med 50 ml deioniseret vand i 5 minutter under forsigtig vipning.
- Farv gelen med 10 ml af en kolloid coomassieplet reagens i 60 minutter under forsigtig vipning. Affarves gel med 50 ml vand, indtil baggrunden bliver klar. Denne farvning trin gælder for faste SDS-PAGE geler samt.
- Tilsæt 1 ml udvikle buffer indeholdende det fluorogene peptidsubstrat Suc-LLVY-AMC og spredes ensartet over gelen. Der inkuberes ved 37 ºC i 30 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteasom samling (figur 1) begynder, når a-underenheder kombineres til at danne ringe 9. Dette kan illustreres ved a-underenheder fra archaeon Methanococcus maripaludis S2 udtrykkes i E. coli som C-terminalt hexahistidin-mærkede (his-mærkede) derivater (Tabel 1). Når det rekombinante α-His-protein blev oprenset ved ICAR og analyseret ved denaturerende PAGE blev to bånd observeret (figur 2A, bane 1). Vi har tidligere vist, at disse svarer til Single a Rings (SR) og Double a-Rings (DR) 18. DR er en blindgyde arter, der ikke er produktive for efterfølgende samling 9,18.
Når a-hans subunits blev co-udtrykt med p-underenheder, som repræsenterer den sædvanlige fremgangsmåde, hvorved samling af rekombinante arke proteasomer analyseres, blev der observeret en hidtil ukendt art migrerer nær 670 kDa størrelse stativard (figur 2A, bane 3). Denne art var proteolytisk aktiv (figur 2B, bane 3) og indeholdt kun helt modne p underenheder (mβ), hvis propeptider er fjernet (figur 2C, bane 3). Denne art er den fuldt modne CP. Denne prøve indeholdt også nogle SR arter, som var forventet, fordi SR er en kendt samling mellemliggende, men ingen DR arter. Manglen på DR, når a-hans og p-underenheder er co-udtrykt tyder på, at korrekt montage foregik hurtigt nok sådan, at inkorporering af p-subunits var i stand til at udkonkurrere uproduktive dannelse af DR (for en mere detaljeret gennemgang findes 18).
For at demonstrere begrænsningen af coekspression metode, og argumentere for anvendeligheden af en kombineret fremgangsmåde, α-His og p-underenheder blev udtrykt separat i E. coli. Efter lysis, de opløselige fraktioner blev blandet og proteiner blev oprenset ved ICAR føranalyse ved ikke-denaturerende PAGE. Fuldt funktionelle proteasomer blev også genereret via lysatet blanding tilgang (figur 2A og 2B, bane 2), og SR arter blev også observeret som forventet. Den tilbagevenden af DR arter i lysatet blande prøven viser, at når der dannes, p-underenheder er i stand til reversibelt demontere det; dette understreger den blindgyde karakter af DR. Interessant, en ny art optrådte også i lysatet blande prøven, migrere lige under CP (betegnet "halv"). For nylig viste vi, at denne art svarer til den halve proteasomet (a 7 β 7) 18. For at illustrere dette her blev en β-subunit mutant (R166W) ansat. Denne mutation afbryder β-β ring interaktion, hvilket fører til forringet halv-proteasomer dimerisering 18. Da halve proteasomer er de umiddelbare forstadier til CP bør R166W mutationen føre til både akkumulering af halve proteasomer enda fald i CP formation. Når lysat blanding med a-hans og p (R166W) subunits blev udført, lavere niveauer af CP og forøgede niveauer af de "halve" arter blev observeret (figur 2A, bane 4). Dette stemmer overens med en precursor-produkt forholdet for disse to bånd, og bekræfter identiteten af de "halve" art som den halve proteasom. Den lidt hurtigere migration af den halve proteasom i mutanten prøve (bane 4 versus bane 2) skyldes sandsynligvis den R166W mutationen ændring af masse-til-ladningsforhold på den β-underenheden.
Evnen til at visualisere den halve proteasom under lysat blanding skyldes primært koncentrationer meget lavere protein i lysatet i forhold til de høje proteinkoncentrationer i celler. Lavere koncentrationer resulterer i mindre effektiv (dvs. langsommere) samling, som gør det muligt mellemprodukter til at blive mere befolkede og dermed detekterbar. Udover forekomsten af den halve proteasomet, en ekstra observation fremhæver faldt samling effektivitet under lysat blanding: uforarbejdede Ø underenheder, som bevarer deres propeptider, bliver påviselige (proβ). Da propeptid behandling ikke finder sted indtil halvdelen proteasomer dimeriserer, udseendet af det umodne proβ formular korrelerer med niveauet af halv-proteasom akkumulering (sammenlign figur 2C, bane 3 versus bane 2 versus bane 4). I tilfælde af R166W mutanten, propeptidet forarbejdning svigt under lysat blanding er absolut selvom en lille mængde af CP gør formen. Dette skyldes propeptid behandling kræver ikke blot halv-proteasom dimerisering, men også en korrekt dannet β-β ring grænseflade 23, som den R166W mutationen ikke giver. En mere detaljeret fortælling af co-ekspression versus lysat blanding, som den vedrører rekombinant proteasom forsamling, kan findes her 18.
gur 1 "src =" / files / ftp_upload / 54.860 / 54860fig1.jpg "/>
Figur 1: En forenklet Skematisk af Core Particle (CP) forsamling.
De a-underenheder kan samles til en enkelt α-ring først (SR), der tjener som template for inkorporering af p-underenheder. Dette fører til dannelsen af den halve proteasomet mellemprodukt (halv), som hurtigt dimeriserer. Samtidig med dimerisering, er β subunit propeptider (ikke vist) autokatalytisk fjernet giver anledning til fuldt funktionel kernepartikel (CP). Dobbelt a-ringe (DR) kan opstå fra SR og er ikke kompetent til montering i CP. Deres dannelse er en non-samling vejen (stiplet pil) i modsætning til produktive montage begivenheder (massive pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: En kombineret tilgang til undersøgelse Proteasome Assembly.
Coekspression (C) og lysat blanding (L) blev anvendt til at studere samling af rekombinante proteasomer fra archaeon M. maripaludis. Proteiner blev oprenset ved immobiliseret Cobalt Affinity Resin (ICAR). (A, B) Oprensede proteiner (10 ug) blev fyldt på ikke-denaturerende 5 - 10% gradient geler. Efter elektroforese blev peptidaseaktivitet visualiseret ved overlejring af gelen med pufferopløsning indeholdende det fluorogene peptidsubstrat Suc-LLVY-AMC (B) før farvning af gelen med kolloid coomassie plet reagens (A). Sorte pilespidser betegne holdninger forsamlede 20S kerne partikel (CP), halv-proteasom mellemprodukt (halv), dobbelt α-ring (DR) og enkelt α-ring (SR). Migrationen af flere molekylære størrelse standarder (i kDa) er angivet til højre. (C) A blev også fyldt på 15% SDS-PAGE geler. Efter elektroforese blev gelerne farvet med et kolloidt coomassie plet reagens. Migration af α-hans underenhed og fuldt modne (mβ) og umodne (proβ) Ø underenheder er angivet. Positionen af 25 kDa molekylstørrelse standard er vist til højre. Stjerne angiver en trunkeret α-hans subunit fragment som følge af ikke-specifik proteolyse under lysis. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Plasmid | Genotype | Kilde |
| AKB191 | pET42 PSMA-His | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB464 | pET42 PSMA-hans psmB | Kusmierczyk et al., (2011) |
| AKB946 | pET42 psmB | Panfair et al., (2015) |
| AKB952 | pET42 psmB (R166W) | Panfair et al., (2015) |
Tabel 1: bakterielle plasmider anvendt i denne undersøgelse. PSMA er arke α subunit genet psmB er arke β-underenhed-genet.
| buffer A | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2. | Buffere B, C og E, er derivater af Buffer A indeholdende imidazol. Det er nyttigt at tilføje Imidazol fra en 2 M stamopløsning fremstillet i vand og opbevaret i mørke. |
| Native løse buffer | 375 mM Tris-HCI, pH 8,8, 0,1% (v / v) tetramethylethylendiamin (TEMED) og 0,1% (vægt / volumen) Ammonium Perulfate (APS). | Fremstillet frisk ikke mere end en time før gelen skal polymeriseres og holdes på is. Ved udarbejdelsen acrylamid gel-løsninger i native løsning buffer, er det nyttigt at tilføje Tris-HCI fra en 4X lager (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8). APS tilsættes umiddelbart før polymerisering. |
| Native løbebufferen 10X stock | 250 mM Tris, 1,92 M glycin, ikke justering af pH. | |
| 5X native prøvebuffer | 0,5 M Tris-HCI, pH 8,8, 50% (vol / vol) glycerol, spor af bromphenolblåt. | Traces henviser til en meget lille mængde, sædvanligvis et par korn overføres via spatel. |
| 5X SDS-prøvepuffer | 0,3 M Tris-HCl, pH 6,8, 600 mM dithiothreitol (DTT), 10% (vægt / volumen) SDS, 50% (vol / vol) glycerol og spor af bromphenolblåt. | Traces henviser til en meget lille mængde, sædvanligvis et par korn overføres via spatel. |
| udvikle puffer | 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 50 mM Suc-LLVY-AMC. | Suc-LLVY-AMC er et fluorogent peptidsubstrat anvendes til analyse proteasomaktivitet. |
Tabel 2: Løsninger, Medier og buffere anvendt i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerer fordelen ved en kombineret tilgang til at analysere proteasom samling ved denaturerende PAGE anvendelse af rekombinante arke proteasomer. Den sædvanlige metode 9,11 af bakteriel coekspression af proteasom underenheder muliggør hurtig analyse, men kan ikke afsløre vigtige assembly mellemprodukter. Vi foreslår at kombinere coekspression med lysat blanding at udvikle et bredere billede af montage begivenheder.
Fordelen ved denne kombinerede fremgangsmåde er, at trods kræver separat ekspression af α og p-underenheder til lysat blanding, er det stadig relativt arbejdskraft med børn. Resultaterne kan også være semikvantitativ hvis man sikrer sammenlignelige og ekspressionsniveauer af de individuelle proteiner. Til dette formål anbefaler vi at udføre sædvanlige optimering af rekombinant protein-ekspression til at bestemme betingelser, der tillader sammenlignelige niveauer af udtrykte proteiner før lysat blanding. Optimering kan omfatte varierende induktion time, induktion temperatur, optisk densitet ved induktion, bakteriel ekspression stamme, og så videre, indtil ønskede niveauer af opløseligt protein opnås. Dette er især vigtigt, når man sammenligner WT og mutant versioner af et protein, fordi nogle gange mutanten kan udvise sammenlignelige ekspressionsniveauer, men nedsat opløselighed. Vi fremhæver også vigtigheden af at bestemme protein koncentrationer af ICAR-oprensede prøver forud for indlæsning af denaturerende PAGE. Selv med ekspression optimering på plads, og med den bedste omsorg for at sikre, at parallelle prøver behandles via de oprensningstrin på samme måde, varians stadig kan uforvarende indføres. En koncentrationsmåling sikrer, at den samme mængde totalt protein er indlæst pr prøvebrønden. Dette gør lane-til-lane sammenligninger af band intensiteter for en given migrerende arter mere meningsfuld.
Hvis der ikke kan opnås sammenlignelige og ensartede niveauer af protein udtryk for lysate blanding, kan man altid rense alle komponenter på forhånd og udføre blande eksperimenter med rene proteiner. Dette har den fordel, at mere præcise Proteinbestemmelser og således gør tilgangen kvantitativ. Er ulempen ved fuld oprensning er imidlertid, at processen bliver væsentligt mere arbejdskrævende, hvilket kan udelukke hurtig analyse af multiple mutanter samtidigt 18. En endelig advarsel værd at nævne er, at nogle gange adskilt udtryk for α og p-underenheder er måske ikke muligt. Dette kan forekomme, hvis en mutation forårsager en underenhed til at være uopløselig i E. coli, når det udtrykkes alene, men tillader opløselighed, der skal genvindes, når mutanten udtrykkes med dets bindingspartner. Hvis dette sker, vil det begrænse analyse kun at co-ekspression. Dette er imidlertid en advarsel, der kan opstå under rekombinant protein ekspression i almindelighed, og er ikke specifik for arke proteasom underenheder 24,25.
Vi valgte at genbejder hans-mærkede derivater af vores proteasomalaktivitet proteiner grundet lette af rensning og prisen for ICAR harpiks. Andre epitopmærker er mulige, herunder til antistofbaseret oprensning, og vi har med succes udtrykt og oprenset FLAG-mærket versioner af vores proteasom-underenheder (ikke vist). Men hvis rensning til homogenitet (eller øge omfanget af produktionen) er påkrævet, de hans-mærkede versioner giver de hurtigste og mest omkostningseffektive middel til at gøre det.
Det givet, at resultater opnået med rekombinante proteiner, være de arke eller eukaryote proteiner produceret i bakterier, vil få yderligere betydning, når fulgt op med in vivo observationer. Dog kan en in vivo fremgangsmåde ikke altid være umiddelbart tilgængelige eksperimentelt. Dette gælder især, når emnet for undersøgelsen er et stort, multisubunit kompleks såsom proteasomet. Rekombinant protein nærmer en vigtig lancering punkt for future eksperimenter. I tilfælde af proteasomet, vil parring rekombinant archaeorganisme proteasom produktion med ikke-denaturerende PAGE fortsat være meget effektive til at belyse væsentlige træk ved proteasom samling, der er delt mellem arke og eukaryote arter 9,11,12,18. En sådan tilgang vil sandsynligvis være nyttigt for at studere samling af andre store multiprotein komplekser så godt. For nylig brugte vi denne strategi at vise, at arke proteasomer kan samle via mere end én vej, og at a-ringene er ikke de obligate mellemprodukter ved montering, at de blev anset for at være 18. Det er endnu ikke fastslået, om det samme gælder for eukaryote proteasomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvist af en Research Support Funds Grant (RSFG) fra Indiana University-Purdue University, Indianapolis, og delvist af en pris fra American Heart Association 14GRNT20390154, til ARK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear |
| Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E. coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized Cobalt Affinity Resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R.
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W.
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
