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Cancer Research

फेफड़ों के कैंसर-लक्षित नैनोकणों के साथ Photodynamic थेरेपी के कैंसर विरोधी प्रभावकारिता

Published: December 1, 2016 doi: 10.3791/54865
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University Bundang Hospital, 2College of Pharmacy, Kangwon National University, 3Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University College of Medicine

Protocol

नोट: सभी जानवर अध्ययन प्रोटोकॉल सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी Bundang अस्पताल के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (BA1308-134 / 072-01) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. एसिड-Ceramide का संश्लेषण (हरे)

  1. डबल आसुत जल (DDW) के 60 मिलीलीटर में solubilize hyaluronic एसिड (हेक्टेयर) oligomer के 12.21 mmol और 9.77 mmol tetra- n -butylammonium हाइड्रॉक्साइड (टीबीए) के। 30 मिनट के लिए हलचल।
  2. डी एस-Y30 लिंकर के संश्लेषण के लिए, tetrahydrofuran के 25 मिलीलीटर (THF) में डी एस-Y30 Ceramide की 8.59 mmol और 9.45 mmol triethylamine के भंग। THF में 4-chloromethylbenzoyl क्लोराइड का 8.59 mmol के साथ मिक्स। 60 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए हिलाओ।
  3. THF का एक मिश्रण और acetonitrile में संश्लेषित 8.10 mmol हा-टीबीए की और 0.41 mmol डी एस-Y30 लिंकर के भंग (4: 1, वी / वी)। 40 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के लिए हिलाओ।
  4. एक फिल्टर एजेंट के साथ छान कर दोष निकालें, और निर्वात वाष्पीकरण द्वारा कार्बनिक विलायक को समाप्त। उत्पाद एक डायलिसिस झिल्ली का उपयोग कर शुद्ध (आणविक वजन कट ऑफ: 3.5 केडीए) और lyophilize।

2. नैनोकणों की तैयारी

  1. एचबी के 1 मिलीग्राम और डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 0.5 मिलीलीटर में Paclitaxel के 1 मिलीग्राम भंग और भंवर मिश्रण 5 मिनट के लिए द्वारा DDW के 0.5 मिलीलीटर के साथ मिश्रण। फिर, एक और 5 मिनट के लिए भंवर मिश्रण से उस मिश्रण में हरे solubilize।
  2. नाइट्रोजन गैस का एक कोमल धारा के अंतर्गत विलायक, 4 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी खत्म करने के लिए।
  3. DDW के 1 मिलीलीटर के साथ हरे, एचबी की रचना की फिल्म है, और पैक्लिटैक्सेल Resuspend। एक सिरिंज फिल्टर (0.45 माइक्रोन रोमकूप आकार) के साथ फिल्टर unencapsulated दवाओं हटा दें।

3. इन विट्रो Phototoxicity

  1. फेफड़ों के कैंसर के सेल लाइनों में नैनोकणों के तेज
    1. RPMI 1640 मध्यम युक्त 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% (w / v) पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन तैयार करें।
    2. 1 × 10 5 कोशिकाओं के घनत्व / अच्छी तरह से कम 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों में बीज A549 कोशिकाओं (प्रत्येक के लिए triplicatesसमूह)। एक humidified 5% सीओ 2 और 95% हवा वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सेते हैं।
    3. सेल लगाव के बाद, मध्यम हटाने और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें।
    4. 2 माइक्रोन / एमएल एचबी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में नैनोकणों भंग। फिर, कोशिकाओं पीबीएस, खाली एनपीएस, एचबी-एनपीएस, या एचबी-P-एनपीएस के 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक में अच्छी तरह से अंधेरे में 4 घंटे के लिए सेते हैं।
    5. समाधान के सभी निकालें और ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। धोने कदम एक बार दोहराएँ। ताजा संस्कृति के माध्यम जोड़ें।
  2. सेल व्यवहार्यता परख
    1. (अच्छी तरह से करने के लिए पीडीटी फाइबर से दूरी का 1 सेमी) के साथ पीडीटी फाइबर के तहत सेल संस्कृति की थाली रखें। लेजर सुरक्षा चश्मा पहनते हैं और एक पीडीटी लेजर (630 एनएम, 400 मेगावाट / 2 सेमी) समय के विभिन्न अवधियों के लिए अंधेरे में साथ कोशिकाओं को रोशन: 0, 5, 10, 20, 30, और 40 सेकंड (0, 2, 4 , 8, 12, और 16 जे / 2 सेमी)। फिर, अंधेरे में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    2. मध्यम Aspirate और ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। धोने कदम एक बार दोहराएँ।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से cytotoxicity मापने समाधान के 10 μl जोड़ें। 2 घंटे के लिए अंधेरे में सेते हैं।
    4. 450 एनएम पर absorbance के उपाय एक microplate रीडर का उपयोग कर।
  3. सूक्ष्म विश्लेषण
    1. (अच्छी तरह से करने के लिए पीडीटी फाइबर से दूरी का 1 सेमी) के साथ पीडीटी फाइबर के तहत सेल संस्कृति की थाली रखें। लेजर सुरक्षा चश्मा पहनें और 0, 20, या 40 सेकंड (0, 8, या 16 जे / 2 सेमी) के लिए एक पीडीटी लेजर (630 एनएम, 400 मेगावाट / 2 सेमी) अंधेरे में साथ कोशिकाओं को रोशन। फिर, अंधेरे में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    2. मध्यम Aspirate और ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। धोने कदम एक बार दोहराएँ।
    3. Annexin वी FITC के 50 μl और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, / एमएल 1.5 माइक्रोग्राम) के 50 μl जोड़ें। धीरे थाली हिला और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए यह सेते हैं।
      नोट: Annexin वी-फाई का उपयोगप्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी किट से टीसी।
    4. ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। धोने कदम एक बार दोहराएँ। ताजा पीबीएस में कोशिकाओं रखें। 100X बढ़ाई प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग apoptotic कोशिकाओं को पहचानें।
  4. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) विश्लेषण
    1. (अच्छी तरह से करने के लिए पीडीटी फाइबर से दूरी का 1 सेमी) के साथ पीडीटी फाइबर के तहत सेल संस्कृति की थाली रखें। लेजर सुरक्षा चश्मा पहनें और 0, 20, या 40 सेकंड (0, 8, या 16 जे / 2 सेमी) के लिए एक पीडीटी लेजर (630 एनएम, 400 मेगावाट / 2 सेमी) के साथ कोशिकाओं को रोशन। फिर, अंधेरे में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    2. मध्यम Aspirate और ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। धोने कदम एक बार दोहराएँ।
    3. 1 × बाध्यकारी बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend (पतला 10x बाध्यकारी बफर के भाग 1, 0.1 एम Hepes / NaOH (पीएच 7.4), 1.4 एम NaCl, और 25 मिमी 2 CaCl से 9 भागों आसुत जल) और हस्तांतरण 100 μl एक 5 मिलीलीटर नमूना समाधान केसंस्कृति ट्यूब।
    4. Annexin वी FITC के 5 μl और propidium आयोडाइड (पीआई) के 5 μl जोड़ें। धीरे ट्यूब भंवर और अंधेरे में कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। 1 × बाध्यकारी बफर के 400 μl जोड़ें।
      नोट: प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी किट से Annexin वी FITC और पीआई का प्रयोग करें।
    5. FACS 14 का उपयोग करके apoptotic कोशिकाओं को पहचानें। पीआई और Annexin वी FITC की उत्तेजना लेजर लाइनों 488 एनएम और 635 एनएम, क्रमशः रहे हैं। 610 ± 20 एनएम और 660 ± 20 एनएम पर पीआई और Annexin वी FITC की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को मापने, क्रमशः। 10,000 घटनाओं प्रति प्रवाह कोशिकामापी पर हासिल की कोशिकाओं को ले लीजिए।

4. विवो ट्यूमर असर चूहों में कैंसर विरोधी प्रभावकारिता

  1. फेफड़ों के कैंसर प्रेरित माउस मॉडल
    1. 0.1 मिलीलीटर RPMI 1640 मध्यम में 1 × 10 6 A549 कोशिकाओं को तैयार; यह बर्फ में रहते हैं।
    2. एक xylazine के एक आईपी इंजेक्शन और tiletamine और zolazepam (1 का एक मिश्रण के साथ चूहों anesthetize: 2, 1 मिलीग्राम /किलोग्राम)। धीरे माउस त्वचा के एक छोटे गुना pinching द्वारा उचित anesthetization की पुष्टि करें। जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
      नोट: कोई आंदोलन मनाया जाता है, पशु पर्याप्त प्रयोगों शुरू करने के लिए anesthetized है।
    3. (- 7 सप्ताह पुराने, 20 - 22 ग्राम 6) subcutaneously BALB / सी पुरुष नग्न चूहों की बाईं flanks में कोशिकाओं इंजेक्षन।
    4. चूहों को देख जब तक वे पिंजरे के चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए शुरू रखें।
      नोट: एक जानवर की पहुंच से बाहर छोड़ जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए नहीं है। एक जानवर जब तक यह पूरी तरह से ठीक हो गया है कि अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है वापस नहीं है। विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) की शर्तों के तहत चूहों रखें।
    5. हर दिन नली का व्यास के साथ ट्यूमर के आकार को मापने। (चौड़ाई 2 × लंबाई) / 2 के रूप में ट्यूमर की मात्रा (3 मिमी) की गणना ट्यूमर के आकार की मात्रा में लगभग 200 मिमी 3 तक पहुँच जाता है, प्रयोग शुरू करते हैं।
    6. कैंसर विरोधी प्रभावकारिता अध्ययन
      1. बेतरतीब ढंग से 4 समूहों (एन = 10 प्रत्येक समूह के लिए) में चूहों को विभाजित।
      2. (: 2, 1 मिलीग्राम / किग्रा 1) एक xylazine के एक आईपी इंजेक्शन और tiletamine और zolazepam का एक मिश्रण के साथ चूहों anesthetize। धीरे माउस त्वचा के एक छोटे गुना pinching द्वारा उचित anesthetization की पुष्टि करें। जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
        नोट: कोई आंदोलन मनाया जाता है, पशु पर्याप्त प्रयोगों शुरू करने के लिए anesthetized है।
      3. 2 मिलीग्राम / एमएल एचबी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में नैनोकणों भंग। पूंछ नस (2 मिलीग्राम / एचबी रूप किलो) में दो बार 0 दिन और 7 पर के माध्यम से पीबीएस, नि: शुल्क एचबी, एचबी एनपीएस, या एचबी-P-एनपीएस इंजेक्षन।
      4. चूहों को देख जब तक वे पिंजरे के चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए शुरू रखें।
        नोट: एक जानवर की पहुंच से बाहर छोड़ जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए नहीं है। एक जानवर है कि पूरी तरह से जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है वापस नहीं हैबरामद किए। पिंजरों अंधेरे और विशिष्ट एसपीएफ की शर्तों के तहत रखें।
      5. (: 2, 1 मिलीग्राम / किग्रा 1) प्रत्येक इंजेक्शन के बाद 24 घंटे, एक xylazine के एक आईपी इंजेक्शन और tiletamine और zolazepam का एक मिश्रण के साथ चूहों anesthetize। धीरे माउस त्वचा के एक छोटे गुना pinching द्वारा उचित anesthetization की पुष्टि करें। जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
        नोट: कोई आंदोलन मनाया जाता है, पशु पर्याप्त प्रयोगों शुरू करने के लिए anesthetized है।
      6. पीडीटी फाइबर के तहत ट्यूमर साइट (ट्यूमर को पीडीटी फाइबर से दूरी का 1 सेमी) के साथ रखें। लेजर सुरक्षा चश्मा पहनते हैं, स्विच बंद कर देते हैं, और एक पीडीटी लेजर (630 एनएम, 400 मेगावाट / 2 सेमी) 500 सेकंड (200 जम्मू / 2 सेमी) दो बार दिन 1 और 8 पर के लिए के साथ ट्यूमर रोशन।
      7. चूहों को देख जब तक वे पिंजरे के चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए शुरू रखें। एक जानवर की पहुंच से बाहर छोड़ जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए नहीं है। एक पशु undergon है कि वापस नहीं हैअन्य जानवरों की कंपनी के लिए ई सर्जरी जब तक पूरी तरह से बरामद किया।
      8. एसपीएफ की शर्तों के तहत पिंजरों रखें। लेजर उपचार के बाद 24 घंटे के लिए अंधेरे में पिंजरों को बनाए रखें।
      9. दिखने में ट्यूमर की मात्रा और ट्यूमर साइट पर हर दिन कम से परिवर्तन की निगरानी। नली का व्यास के साथ ट्यूमर के आकार को मापने, और (चौड़ाई 2 × लंबाई) / 2 (मिमी 3) के रूप में की मात्रा की गणना। पीडीटी के बाद ट्यूमर सतह परिवर्तन के लिए जाँच करने के लिए हर दिन ट्यूमर साइटों की तस्वीरें ले लो।
      10. 16 दिन, isoflurane का उपयोग टर्मिनल संज्ञाहरण से समूह के प्रति पांच चूहों बलिदान।
      11. संदंश और कैंची के साथ, बाहरी त्वचा में कटौती और ट्यूमर 15 बेनकाब। ध्यान से उन्हें फसल। उन्हें 10% formalin में फिक्स, उन्हें पैराफिन में एम्बेड करते हैं, और उन्हें ऊतकीय विश्लेषण के लिए 16 hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ दाग।
      12. निगरानी के 45 दिनों के बाद, isoflurane का उपयोग टर्मिनल संज्ञाहरण से शेष चूहों बलिदान।

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Representative Results

हम तकनीक ऊपर उल्लेख के साथ दोनों एचबी एनपीएस और एचबी-P-एनपीएस तैयार किया। एचबी एनपीएस और एचबी-P-एनपीएस का मतलब व्यास 220.9 ± 3.2 एनएम और 211.9 ± 1.6 एनएम, क्रमशः थे।

पीबीएस, खाली एनपीएस, एचबी-एनपीएस, और एचबी-P-एनपीएस के साथ ऊष्मायन के 4 घंटा प्रकाश विकिरण के द्वारा पीछा (0 16 जे / 2 सेमी) के बाद A549 कोशिकाओं के सेल व्यवहार्यता चित्र 1 में दिखाया गया है। प्रकाश के बिना, एचबी-एनपी इलाज के समूह सब पर कोई cytotoxicity से पता चला है, जबकि एचबी-P-एनपी इलाज कोशिकाओं 81.28 ± 0.14% सेल व्यवहार्यता दिखाया। इस पैक्लिटैक्सेल के कैंसर विरोधी प्रभाव है, जो नैनोकणों से जारी किया गया था के कारण हो सकता है। पीडीटी के तहत, सेल व्यवहार्यता दोनों एचबी NP- और एचबी-P-एनपी इलाज कोशिकाओं में प्रकाश जोखिम समय के अनुसार कम था। एचबी-P-एनपी इलाज कोशिकाओं ही विकिरण की शर्तों के तहत एचबी एनपीएस समूह की तुलना में वृद्धि हुई phototoxicity दिखाया। जब 16 जे / 2 सेमी के विकिरण दिया गया था, कोशिकाओं का केवल 7.52 ± 0.38% एचबी-P-एनपी इलाज के समूह में बच गया।

अनुरूप परिणाम Annexin वी FITC धुंधला (चित्रा 2) के साथ कल्पना कर रहे थे। पीडीटी प्रेरित apoptotic कोशिकाओं Annexin वी FITC के साथ दाग थे, हरी प्रतिदीप्ति व्यक्त। सबसे मजबूत हरी प्रतिदीप्ति संकेत ही विकिरण की शर्तों के तहत एचबी-P-एनपी इलाज कोशिकाओं में पाया गया था।

पीडीटी प्रेरित apoptotic कोशिकाओं के चरणों से फ्लो द्वारा वर्गीकृत किया गया। और परिगलित कोशिकाओं (केवल पीआई सकारात्मक) Annexin वी FITC और पीआई, जल्दी apoptotic कोशिकाओं (केवल Annexin वी FITC सकारात्मक) के साथ डबल धुंधला हो जाना, देर apoptotic कोशिकाओं (दोनों Annexin V और पीआई सकारात्मक) द्वारा प्रतिष्ठित थे। एक ही पीडीटी शर्तों के तहत, देर apoptotic कोशिकाओं के हिस्से एचबी-P-एनपी इलाज समूह (चित्रा 3) में वृद्धि की गई थी।

"Fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> पीबीएस, नि: शुल्क एचबी, एचबी एनपीएस, और एचबी-P-एनपीएस के डबल नसों में इंजेक्शन के बाद फेफड़ों के ट्यूमर असर चूहों में vivo ट्यूमर के विकास को प्रकाश विकिरण के द्वारा पीछा किया है चित्रा 4 में दिखाया गया है। ट्यूमर साइटों की सतहों की भी जांच कर रहे थे (चित्रा 5)। एचबी-P-एनपी इलाज चूहों सबसे तेजी से प्रतिक्रियाओं नकसीर और गल जाना, और धीमी ट्यूमर के विकास सहित दिखाया। इसके अलावा, ऊतकीय विश्लेषण की पुष्टि की सबसे बुरी तरह से क्षतिग्रस्त ट्यूमर कोशिकाओं एचबी-P-एनपी इलाज के समूह में (चित्रा 6) थे।

आकृति 1
चित्रा 1:। इन विट्रो Phototoxicity A549 कोशिकाओं की A549 कोशिकाओं पीबीएस, खाली एनपीएस, एचबी-एनपीएस, या एचबी-P-एनपीएस, और प्रकाश विकिरण के साथ इलाज किया गया 0, 5, 10, 20, 30, या 40 सेकंड के लिए दिया गया था (0, 2, 4, 8, 12, या 16 जे / 2 सेमी)। टी के तहतवह एक ही विकिरण समय, एचबी-P-एनपी इलाज के समूह एचबी एनपी इलाज के समूह की तुलना में अधिक phototoxicity दिखाया। मान व्यक्त कर रहे हैं इसका मतलब है के रूप में ± मानक विचलन (एसडी, एन = 3)। *** पी <0.001, पीबीएस इलाज समूह की तुलना में। ## पी <0.01, ### पी <0.001, एचबी-एनपी इलाज के समूह की तुलना में। चांग एट अल। 10 से अनुकूलित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। Apoptotic A549 कोशिकाओं का सूक्ष्म विश्लेषण A549 कोशिकाओं, या 4 जम्मू / 2 सेमी पीबीएस, एचबी एनपीएस या एचबी-P-एनपीएस के साथ इलाज किया गया, और प्रकाश विकिरण 0 के लिए दिया गया था 2। DAPI (नीला, पहले कॉलम) और Annexin वी FITC (हरा, दूसरे स्तंभ) की डबल दाग नाभिक का संकेतऔर apoptotic कोशिकाओं, क्रमशः। एचबी-P-एनपी इलाज कोशिकाओं ही विकिरण की शर्तों के तहत एचबी एनपी इलाज कोशिकाओं की तुलना में मजबूत हरी प्रतिदीप्ति संकेतों से पता चला है, एक बहुत अधिक phototoxicity का संकेत है। स्केल बार = 200 माइक्रोन, बढ़ाई = 100X। चांग एट अल। 10 से अनुकूलित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Apoptotic A549 कोशिकाओं के FACS विश्लेषण A549 कोशिकाओं, या 4 जम्मू / 2 सेमी पीबीएस, एचबी एनपीएस, या एचबी-P-एनपीएस के साथ इलाज किया गया, और प्रकाश विकिरण 0 के लिए दिया गया था 2। कोशिकाओं को चार समूहों। मैं) दोनों Annexin वी FITC- और पीआई नकारात्मक कोशिकाओं में वर्गीकृत किया गया undamaged, द्वितीय) Annexin वी FITC पॉजिटिव और पीआई नकारात्मक कोशिकाओं माना जाता हैहैं जल्दी apoptotic, iii) दोनों Annexin वी FITC- और पीआई पॉजिटिव कोशिकाओं देर apoptotic हैं, और iv) Annexin वी FITC नकारात्मक और पीआई पॉजिटिव कोशिकाओं या तो देर apoptotic या परिगलित कर रहे हैं। सूक्ष्म विश्लेषण के अनुसार, एक ही विकिरण की शर्तों के तहत, एचबी-P-एनपी इलाज कोशिकाओं एचबी एनपी इलाज कोशिकाओं की तुलना में अधिक phototoxicity से पता चला है, और देर apoptotic सेल का स्तर बढ़ रहे थे। चांग एट अल। 10 से अनुकूलित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। A549 ट्यूमर असर चूहों के ट्यूमर मात्रा की निगरानी 0 दिन और 7, पीबीएस के डबल इंजेक्शन, मुक्त एचबी, एचबी एनपीएस, और एचबी-P-एनपीएस पर प्रदर्शन किया गया। पीडीटी (200 जम्मू / 2 सेमी) कामकाज थामेड प्रत्येक इंजेक्शन के बाद 1 दिन, दिन 1 और 8 पर उपचार उपचारात्मक प्रभाव के विभिन्न स्तरों एचबी <एचबी एनपीएस <एचबी-P-एनपीएस के साथ दिखाया। दिन 45 पर, एचबी-P-एनपीएस इलाज के समूह में काफी अन्य समूहों की तुलना में ट्यूमर की मात्रा कम दिखाया। मान प्रस्तुत कर रहे हैं इसका मतलब है के रूप में ± मानक विचलन (एसडी, एन = 4)। ट्यूमर की मात्रा (3 मिमी) (चौड़ाई 2 × लंबाई) / 2. चांग एट अल। 10 से अनुकूलित के रूप में परिभाषित किया गया था कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। A549 ट्यूमर असर चूहों के ट्यूमर साइट पर भूतल बदलाव ट्यूमर साइटों डबल नसों में इंजेक्शन के बाद निगरानी की गई (0 दिन पर और 7) पीबीएस, नि: शुल्क एचबी, एचबी एनपीएस, और HB- की200 J प्रत्येक इंजेक्शन के बाद / 2 सेमी प्रकाश विकिरण 1 दिन के साथ पी एनपीएस (दिन 1 पर और 8)। दोनों एचबी एनपीएस और एचबी-P-एनपीएस उपचार समूहों प्रतिक्रियाओं पहले पीडीटी के बाद दिन दिखाने के लिए शुरू कर दिया। एचबी-P-एनपीएस इलाज के समूह गंभीर ख़ून का बहाव और नेक्रोसिस के सबसे तेजी से विकास दिखाया। चांग एट अल। 10 से अनुकूलित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6:। A549 ट्यूमर असर चूहों में ट्यूमर ऊतकों के histological विश्लेषण 16 दिन, ऊतकीय पुष्टि एक एच ई excised ट्यूमर ऊतकों के दाग द्वारा किया गया था। एचबी-P-एनपीएस इलाज के समूह सबसे पूरा ट्यूमर कोशिका मृत्यु का प्रदर्शन किया। स्केल बार = 500 माइक्रोन, बढ़ाई = 40X। चांग एट अल से अनुकूलित। 10 कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में सबसे महत्वपूर्ण कदम उचित लेजर की स्थिति का चयन होता है: तरंग दैर्ध्य, बिजली, और विकिरण समय। विशिष्ट photosensitizer के लिए उपयुक्त प्रकाश की उचित तरंगदैर्ध्य पीडीटी के लिए आवश्यक है। हम एक 630 एनएम लेजर कि hypocrellin बी के लिए उचित बिजली उत्पादन के अन्य महत्वपूर्ण कारक है, जो कई पायलट अध्ययन के आधार पर 400 मेगावाट / 2 सेमी पर सेट किया गया था इस्तेमाल किया गया था। से अधिक 400 मेगावाट / 2 सेमी क्षतिग्रस्त कोशिकाओं या जानवरों की त्वचा की सतह शक्तियां उत्पादन विकिरण के कारण ही है, जबकि 400 मेगावाट / 2 सेमी नीचे उत्पादन शक्तियों किसी भी उपचारात्मक प्रभाव को दिखाने के लिए भी कमजोर थे। इन विट्रो के लिए और vivo अध्ययन में उचित विकिरण बार 40 सेकंड (16 जे / 2 सेमी) और 500 सेकंड (200 जम्मू / 2 सेमी), क्रमशः थे। पीडीटी फाइबर से कोशिकाओं को या पशु मॉडल का ट्यूमर ऊतकों के लिए दूरी भी इस अध्ययन में एक महत्वपूर्ण कारक था। साथ पूरे सेल या ट्यूमर सतह को कवर करनेप्रकाश, 1 सेमी इष्टतम दूरी होना पाया गया।

एक अलग photosensitizer लागू किया जाता है, तो प्रकाश की उचित तरंगदैर्ध्य के उपयोग पीडीटी प्रभावकारिता को अधिकतम कर सकते हैं। बिजली उत्पादन और विकिरण समय परीक्षण और त्रुटि के माध्यम से तय की जानी चाहिए। त्वचा की सतह प्रकाश विकिरण के दौरान जलाने के लिए शुरू होता है, बिजली उत्पादन कम निर्धारित किया जाना चाहिए। ट्यूमर सतह पीडीटी के बाद सारा दिन में कोई परिवर्तन को दर्शाता है, यह आवश्यकता बिजली उत्पादन बढ़ाने के लिए संकेत हो सकता है।

इस विधि को कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, हालांकि लक्ष्य को पीडीटी फाइबर से दूरी इस अध्ययन में एक महत्वपूर्ण कारक है, यह मुश्किल एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए है। क्योंकि यह मनुष्य के द्वारा नियंत्रित किया जाता है दूरी से थोड़ा भिन्न हो सकते हैं। दूसरे, इस तरह के रूप में फेफड़ों के अंगों में ट्यूमर के साथ पशु मॉडल के लिए, इस प्रोटोकॉल मुश्किल लागू करने के बाद एंडोस्कोपी आवश्यक है और सांस आंदोलन अपरिहार्य है।

हालांकि शल्य लकीर पहला हैफेफड़ों के कैंसर के इलाज के लिए विकल्प, पीडीटी एक गैर-आक्रामक और गैर सर्जिकल वैकल्पिक उपचार के रूप में कई फायदे हैं। जब ऑपरेशन में इस तरह के कई घाव मामलों में, उचित नहीं है, पीडीटी एक मान्य विकल्प हो सकता है। इसके अलावा, preoperative पीडीटी ट्यूमर के आकार को कम करने और सर्जरी 17 डिग्री कम कर सकते हैं। जब सर्जरी, विकिरण चिकित्सा, या endobronchial ब्रैकीथेरेपी की तुलना में पीडीटी कम साइड इफेक्ट है। इसके अलावा, पीडीटी म्यूटेशन कि विकिरण चिकित्सा या कीमोथेरेपी से 18 प्रतिरोध प्रदान करने के लिए अप्रासंगिक है।

इस अध्ययन में, हम पीडीटी के लिए एक उपन्यास photosensitizer वितरण प्रणाली के रूप में दोनों photosensitizer- और कैंसर विरोधी दवा समझाया फेफड़ों के कैंसर से लक्षित नैनोकणों का सुझाव दिया। इस अवधारणा को अन्य photosensitizers और विरोधी दवाओं के लिए लागू किया जा सकता है।

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Acknowledgments

इस अध्ययन अनुदान कोई द्वारा समर्थित किया गया। SNUBH रिसर्च फंड से 14-2014-017।

लेखक इस पांडुलिपि के बारे में उनकी नि: स्वार्थ संपादन के लिए जे पैट्रिक बैरन, प्रोफेसर एमेरिटस, टोक्यो चिकित्सा विश्वविद्यालय और सहायक प्रोफेसर, सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी Bundang अस्पताल के लिए आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
oligo hyaluronic acid Bioland Co., Ltd. _
DS-Y30 (ceramide 3B; mainly N-oleoyl-phytosphingosine) Doosan Biotech Co., Ltd. _
adipic acid dihydrazide Sigma Aldrich A0638
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Sigma Aldrich 39391
4-(chloromethyl)benzoyl chloride Sigma Aldrich 270784
Tween 80 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. T0546
syringe filter Sartorius Stedim Biotech GmbH 17762 15 mm, RC, PP, 0.45 µm
triethylamine Sigma Aldrich T0886
Mini-GeBAflex tubes Gene Bio-Application Ltd. D070-12-100
Paclitaxel Taihua Corporations _
RPMI-1640 Gibco Life Technologies, Inc. 11875
Penicillin–streptomycin Gibco Life Technologies, Inc. 15070
Fetal bovine serum Gibco Life Technologies, Inc. 16140071
Celite (Filter agent) Sigma Aldrich 6858 See step 1.4

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References

  1. Shang, L., Zhou, N., Gu, Y., Liu, F., Zeng, J. Comparative study on killing effect of esophageal cancer cell line between hypocrellin B-photodynamic therapy and hematoporphyrin derivative-photodynamic therapy. Chin J Cancer Prev Treat. 12, 1139-1142 (2005).
  2. Huisman, C., et al. Paclitaxel triggers cell death primarily via caspase-independent routes in the non-small cell lung cancer cell line NCI-H460. Clin Cancer Res. 8 (2), 596-606 (2002).
  3. Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
  4. Pass, H. I. Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
  5. Sutedja, T. G., Postmus, P. E. Photodynamic therapy in lung cancer. A review . J. Photochem. Photobiol. 36 (2), 199-204 (1996).
  6. Peng, C. L., Shieh, M. J., Tsai, M. H., Chang, C. C., Lai, P. S. Self-assembled star-shaped chlorin-core poly(epsilon-caprolactone)-poly(ethylene glycol) diblock copolymer micelles for dual chemo-photodynamic therapies. Biomaterials. 29 (26), 3599-3608 (2008).
  7. Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T. Liposomal delivery of photosensitising agents. Expert Opin Drug Deliv. 2 (3), 477-487 (2005).
  8. Lee, S. J., et al. Comparative study of photosensitizer loaded and conjugated glycol chitosan nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 152 (1), 21-29 (2011).
  9. Chang, J. E., et al. Anticancer efficacy of photodynamic therapy with hematoporphyrin-modified, doxorubicin-loaded nanoparticles in liver cancer. J. Photochem. Photobiol. 140, 49-56 (2014).
  10. Chang, J. E., Cho, H. J., Yi, E., Kim, D. D., Jheon, S. Hypocrellin B and paclitaxel-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles for targeted photodynamic therapy in lung cancer. J. Photochem. Photobiol. 158, 113-121 (2016).
  11. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle delivery of cancer drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  12. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
  13. Penno, M. B., et al. Expression of CD44 in human lung tumors. Cancer Res. 54 (5), 1381-1387 (1994).
  14. Wilkins, R., Kutzner, B., Truong, M., Sanchez-Dardon, J., McLean, J. Analysis of radiation-induced apoptosis in human lymphocytes: Flow cytometry using Annexin V and propidium iodide versus the neutral comet assay. Cytometry. 48 (1), 14-19 (2002).
  15. Bannas, P., et al. Validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft NIRF-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy. J Vis Exp. (98), e52462 (2015).
  16. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
  17. Lam, S. Photodynamic therapy of lung cancer. Semin Oncol. 21 (6 Suppl 15), 15-19 (1994).
  18. Simone, C. B. 2nd, et al. Photodynamic therapy for the treatment of non-small cell lung cancer. J Thorac Dis. 4 (1), 63-75 (2012).

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Chang, J. E., Cho, H. J., Jheon, S.… More

Chang, J. E., Cho, H. J., Jheon, S. Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles. J. Vis. Exp. (118), e54865, doi:10.3791/54865 (2016).

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