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Cancer Research

Anticancro Efficacia della terapia fotodinamica con cancro del polmone con targeting nanoparticelle

Published: December 1, 2016 doi: 10.3791/54865
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University Bundang Hospital, 2College of Pharmacy, Kangwon National University, 3Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University College of Medicine

Protocol

NOTA: Tutti i protocolli di studio sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali di Seoul National University Hospital Bundang (BA1308-134 / 072-01).

1. Sintesi di acido ialuronico-Ceramide (HACE)

  1. Solubilizzare 12.21 mmoli di acido ialuronico (HA) oligomero e 9.77 mmoli di tetra- idrossido n -butylammonium (TBA) in 60 ml di acqua bidistillata (DDW). Agitare per 30 min.
  2. Per sintetizzare il linker DS-Y30 sciogliere 8.59 mmoli di DS-Y30 ceramide e 9.45 mmoli di trietilammina in 25 ml di tetraidrofurano (THF). Mescolare con 8.59 mmol di cloruro di 4-chloromethylbenzoyl in THF. Mescolare per 6 ore a 60 ° C.
  3. Sciogliere il sintetizzato 8.10 mmoli di HA-TBA e 0,41 mmoli di DS-Y30 linker in una miscela di THF e acetonitrile (4: 1, v / v). Mescolare per 5 ore a 40 ° C.
  4. Rimuovere impurità filtrando con un agente di filtro, ed eliminare il solvente organico mediante evaporazione sotto vuoto. Purificare il prodotto utilizzando una membrana di dialisi (peso molecolare cut-off: 3,5 kDa) e liofilizzato.

2. Preparazione delle nanoparticelle

  1. Sciogliere 1 mg di HB e 1 mg di paclitaxel in 0,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO) e miscelare con 0,5 ml di DDW da vortex-miscelazione per 5 min. Poi, solubilizzazione HACE nella mischia dal vortice di miscelazione per un ulteriore 5 min.
  2. Per eliminare il solvente, il calore a 70 ° C per 4 ore sotto leggera corrente di azoto.
  3. Risospendere il film composto da HACE, HB, e paclitaxel con 1 ml di DDW. Filtrare con un filtro a siringa (0,45 micron dimensione dei pori) per rimuovere farmaci incapsulati.

3. In Vitro Fototossicità

  1. L'assorbimento di nanoparticelle in linee cellulari di cancro al polmone
    1. Preparare RPMI-1640 (v / v) di siero fetale bovino medio contenente 10% e 1% (w / v) di penicillina-streptomicina.
    2. Cellule Seed A549 in piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti ad una densità di 1 × 10 5 cellule / pozzetto (triplicato per ognigruppo). Incubare per 24 ore a 37 ° C in un umidificata 5% aria atmosfera di CO 2 e il 95%.
    3. Dopo l'adesione cellulare, rimuovere il terreno e lavare le cellule aggiungendo 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    4. Sciogliere le nanoparticelle in PBS ad una concentrazione finale di 2 micron / ml HB. Poi, incubare le cellule con 1 ml di PBS, NP vuoti, HB-NP, o HB-P-NP in ciascun pozzetto per 4 ore al buio.
    5. Rimuovere tutta la soluzione e lavare le cellule aggiungendo 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta. Aggiungere mezzo di coltura fresco.
  2. saggio vitalità cellulare
    1. Posizionare la piastra di coltura cellulare sotto la fibra PDT (con 1 cm di distanza dalla fibra PDT al pozzo). Indossare occhiali di protezione laser e illuminare le cellule con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) al buio per diversi periodi di tempo: 0, 5, 10, 20, 30, e 40 sec (0, 2, 4 , 8, 12, e 16 J / cm 2). Poi, incubare le cellule per 24 ore al buio.
    2. Aspirare il medio e lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta.
    3. Aggiungere 10 ml di soluzione di misura citotossicità in ciascun pozzetto. Incubare al buio per 2 ore.
    4. Misurare l'assorbanza a 450 nm usando un lettore di micropiastre.
  3. analisi microscopica
    1. Posizionare la piastra di coltura cellulare sotto la fibra PDT (con 1 cm di distanza dalla fibra PDT al pozzo). Indossare occhiali di protezione laser e illuminare le cellule con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) al buio per 0, 20, o 40 sec (0, 8, o 16 J / cm 2). Poi, incubare le cellule per 24 ore al buio.
    2. Aspirare il medio e lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta.
    3. Aggiungere 50 ml di annessina V-FITC e 50 ml di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1,5 mg / ml). Agitare delicatamente la piastra e incubare per 15 min a temperatura ambiente al buio.
      NOTA: Utilizzare annessina V-FITC dal kit microscopio a fluorescenza.
    4. Lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta. Mantenere le cellule in PBS fresco. Identificare le cellule apoptotiche mediante microscopia ottica a ingrandimento 100X.
  4. ordinamento fluorescenza delle cellule attivate (FACS) Analisi
    1. Posizionare la piastra di coltura cellulare sotto la fibra PDT (con 1 cm di distanza dalla fibra PDT al pozzo). Indossare occhiali di protezione laser e illuminare le cellule con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) per 0, 20, o 40 sec (0, 8, o 16 J / cm 2). Poi, incubare le cellule per 24 ore al buio.
    2. Aspirare il medio e lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta.
    3. Risospendere le cellule in 1 ml di 1 × tampone di legame (diluire 1 parte di tampone legante 10x; 0,1 M Hepes / NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, e 25 mM CaCl 2 a 9 parti di acqua distillata) e trasferimento 100 microlitri della soluzione campione 5 mltubo di cultura.
    4. Aggiungere 5 ml di annessina V-FITC e 5 ml di ioduro di propidio (PI). Agitare delicatamente la provetta e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) al buio. Aggiungere 400 ml di 1 × tampone vincolante.
      NOTA: Utilizzare annessina V-FITC e PI dal kit microscopio a fluorescenza.
    5. Identificare le cellule apoptotiche utilizzando FACS 14. Le linee laser di eccitazione di PI e annessina V-FITC sono 488 nm e 635 nm, rispettivamente. Misurare l'emissione di fluorescenza di PI e annessina V-FITC a 610 ± 20 nm e 660 ± 20 nm, rispettivamente. Raccogliere le cellule acquisite sul citometro di flusso per 10.000 eventi.

4. In vivo l'efficacia antitumorale nei topi portatori di tumore

  1. Lung modello murino di cancro indotto
    1. Preparare 1 × 10 6 cellule A549 in 0,1 ml di mezzo RPMI-1640; tenerlo in ghiaccio.
    2. Anestetizzare i topi con una iniezione ip di xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Verificare il corretto anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del mouse. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
      NOTA: Se si osserva alcun movimento, l'animale è sufficientemente anestetizzati per avviare gli esperimenti.
    3. Iniettare le cellule per via sottocutanea nei fianchi sinistra del BALB / C maschile topi nudi (6 - 7 settimane di vita, 20 - 22 g).
    4. Mantenere osservando il mouse fino a quando iniziano a muoversi intorno alla gabbia.
      NOTA: Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato. Mantenere i topi in condizioni specifiche esenti da organismi patogeni (SPF).
    5. Misurare la dimensione del tumore con pinze ogni giorno. Calcolare il volume del tumore (mm 3) come (lunghezza x larghezza 2) / 2. Quando la dimensione del tumore raggiunge circa 200 mm 3 di volume, iniziare l'esperimento.
    6. studio di efficacia antitumorale
      1. Casualmente dividere i topi in 4 gruppi (n = 10 per ciascun gruppo).
      2. Anestetizzare i topi con una iniezione ip di xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Verificare il corretto anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del mouse. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
        NOTA: Se si osserva alcun movimento, l'animale è sufficientemente anestetizzati per avviare gli esperimenti.
      3. Sciogliere le nanoparticelle in PBS ad una concentrazione finale di 2 mg / ml HB. Iniettare PBS, libero HB, HB-NP, o HB-P-NP attraverso la vena della coda (2 mg / kg come HB) due volte nei giorni 0 e 7.
      4. Mantenere osservando il mouse fino a quando iniziano a muoversi intorno alla gabbia.
        NOTA: Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino al completorecuperato. Mantenere le gabbie buio e in condizioni SPF specifiche.
      5. 24 ore dopo ciascuna iniezione, anestetizzare i topi con una iniezione ip di xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Verificare il corretto anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del mouse. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
        NOTA: Se si osserva alcun movimento, l'animale è sufficientemente anestetizzati per avviare gli esperimenti.
      6. Posizionare il sito del tumore sotto della fibra PDT (di 1 cm di distanza dalla fibra PDT al tumore). Indossare occhiali di sicurezza laser, spegnere l'interruttore, e illuminare il tumore con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) per 500 sec (200 J / cm 2) due volte nei giorni 1 e 8.
      7. Mantenere osservando il mouse fino a quando iniziano a muoversi intorno alla gabbia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha oggetto d'importanti lavorie un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
      8. Mantenere le gabbie in condizioni SPF. Mantenere le gabbie al buio per 24 ore dopo il trattamento laser.
      9. Visivamente controllare il volume del tumore ed i cambiamenti al sito del tumore ogni giorno. Misurare la dimensione del tumore con pinze, e calcolare il volume (lunghezza x larghezza 2) / 2 (mm 3). Scattare foto dei siti tumorali ogni giorno per verificare la presenza di alterazioni della superficie del tumore dopo PDT.
      10. Il giorno 16, sacrificare cinque topi per gruppo da anestesia terminali che utilizzano isoflurano.
      11. Con pinze e forbici, tagliare la pelle esterna ed esporre i tumori 15. li raccolto con cura. Fissarli in formalina al 10%, incorporarli in paraffina, e li macchiare con ematossilina e eosina (H & E) per l'analisi istologica 16.
      12. Dopo 45 giorni di monitoraggio, sacrificare i topi rimanenti anestesia terminali che utilizzano isoflurano.

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Representative Results

Abbiamo preparato sia HB-NP e HB-P-NP con le tecniche di cui sopra. I diametri medi di HB-NP e HB-P-NP erano 220,9 ± 3,2 nm e 211.9 ± 1.6 nm, rispettivamente.

La vitalità cellulare delle cellule A549 dopo 4 ore di incubazione con PBS, NP vuoti, HB-NP e HB-P-NP seguito da irradiazione di luce (0 a 16 J / cm 2) è mostrato in Figura 1. Senza luce, la gruppo di trattamento HB-NP non ha mostrato citotossicità a tutti, mentre le cellule HB-P-NP-trattati hanno mostrato la vitalità delle cellule 81.28 ± 0.14%. Ciò può essere dovuto all'effetto antitumorale di paclitaxel, che è stato rilasciato dalle nanoparticelle. Sotto PDT, la vitalità cellulare è stata diminuita a seconda del tempo di esposizione alla luce sia HB-NP- e cellule HB-P-NP-trattata. Le cellule HB-P-NP-trattati hanno mostrato un aumento fototossicità rispetto al gruppo HB-NP nelle stesse condizioni di irraggiamento. Quando 16 J / cm 2 di irradiazione è stata data, solo 7,52 ± 0,38% delle cellule sopravvissuto nel gruppo di trattamento HB-P-NP.

I risultati coerenti sono stati visualizzati con annessina V-FITC colorazione (Figura 2). Le cellule apoptotiche PDT-indotte sono state colorate con annessina V-FITC, esprimendo fluorescenza verde. Il segnale di fluorescenza verde più forte è stata rilevata nelle cellule HB-P-NP-trattati nelle stesse condizioni di irraggiamento.

Le tappe delle cellule apoptotiche PDT-indotti sono stati classificati mediante citometria di flusso. Facendo doppio-colorazione con annessina V-FITC e PI, i primi cellule apoptotiche (solo annessina V-FITC positivo), in ritardo per apoptosi delle cellule (sia annessina-V e PI positivo) e le cellule necrotiche (solo pi positivo) erano distinti. Alle stesse condizioni PDT, la porzione di cellule apoptotiche fine è stata aumentata nel gruppo HB-P-NP-trattate (Figura 3).

"Fo: together.within-page keep-=" 1 "> in vivo la crescita del tumore nei topi portatori di tumore al polmone dopo l'iniezione endovenosa di doppio PBS, libero HB, HB-NP, e HB-P-NP seguita da irradiazione di luce è mostrati in Figura 4. le superfici dei siti tumorali sono stati anche esaminati (Figura 5). i topi HB-P-NP-trattati hanno mostrato le reazioni veloci, compresi emorragia e necrosi, e la crescita del tumore più lenta. inoltre, l'analisi istologica confermato la la maggior parte delle cellule tumorali gravemente danneggiate erano nel gruppo di trattamento HB-P-NP (Figura 6).

Figura 1
Figura 1:. In vitro Fototossicità di cellule A549 cellule A549 sono stati trattati con PBS, NP vuoti, HB-NP, o HB-P-NP e irradiazione di luce è stata data per 0, 5, 10, 20, 30, o 40 sec (0, 2, 4, 8, 12, o 16 J / cm 2). sotto tegli stesso tempo di irraggiamento, il gruppo di trattamento HB-P-NP ha mostrato fototossicità superiore rispetto al gruppo di trattamento HB-NP. I valori sono espressi come media ± deviazione standard (SD; n = 3). *** P <0,001, rispetto al gruppo PBS-trattata. ## P <0.01, ### p <0,001, rispetto al gruppo di trattamento HB-NP. Adattato da Chang et al. 10 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:. Cellule A549 Analisi al microscopio di cellule apoptotiche A549 sono stati trattati con PBS, HB-NP o HB-P-NP, e irradiazione di luce è stato dato per 0, 2, o 4 J / cm 2. Il doppio-macchia di DAPI (blu, prima colonna) e annessina V-FITC (verde, seconda colonna) indicano nucleie cellule apoptotiche rispettivamente. Le cellule HB-P-NP-trattati hanno mostrato segnali di fluorescenza verde più forti rispetto alle cellule HB-NP-trattati nelle stesse condizioni di irraggiamento, che indica un fototossicità molto più alto. Scala bar = 200 micron, ingrandimento = 100X. Adattato da Chang et al. 10 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Cellule A549 FACS analisi di apoptotici cellule A549 sono stati trattati con PBS, HB-NP, o HB-P-NP, e irradiazione di luce è stato dato per 0, 2, o 4 J / cm 2. Le cellule sono state suddivise in quattro gruppi. I) Sia annessina V-FITC e cellule PI-negativi sono considerati, ii) le cellule annessina V-FITC-positivi e PI-negativi non danneggiatisono apoptotico precoce, iii) sia annessina V-FITC e cellule PI-positive sono in ritardo apoptotico, e iv) le cellule annessina V-FITC-negativi e PI-positivi sono o in ritardo apoptotico o necrotico. In accordo con l'analisi microscopica, alle stesse condizioni di irraggiamento, le cellule HB-P-NP-trattati hanno mostrato fototossicità superiore alle cellule HB-NP-trattati, e livelli tardivi cellule apoptotiche sono stati aumentati. Adattato da Chang et al. 10 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. Tumore Volume Monitoraggio della A549 topi portatori di tumore cuscinetto nei giorni 0 e 7, le doppie iniezioni di PBS, la connessione HB, HB-NP, e HB-P-NP sono stati eseguiti. La PDT (200 J / cm 2) è stato performed 1 giorno dopo ogni iniezione, nei giorni 1 e 8. I trattamenti hanno mostrato diversi livelli di effetto terapeutico, con HB <HB-NP <HB-P-NP. Il giorno 45, il gruppo di trattamento HB-P-NP mostrato una diminuzione significativa del volume tumorale rispetto agli altri gruppi. I valori sono presentati come media ± deviazione standard (SD; n = 4). Il volume del tumore (mm 3) è stata definita come (lunghezza x larghezza 2) / 2. Adattato da Chang et al. 10 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5:. Le alterazioni superficiali sul sito del tumore della A549 topi portatori di tumore cuscinetto I siti tumorali sono stati monitorati dopo le iniezioni endovenose doppie (nei giorni 0 e 7) di PBS, libero HB, HB-NP, e HBP-NP con 200 J / cm 2 irradiazione di luce 1 giorno dopo ogni iniezione (nei giorni 1 e 8). Sia l'HB-NP e gruppi di trattamento HB-P-NP iniziato a mostrare le reazioni il giorno dopo la prima PDT. Il gruppo di trattamento HB-P-NP mostrava grave emorragia e lo sviluppo più veloce di necrosi. Adattato da Chang et al. 10 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6:. Analisi istologica dei tessuti tumorali in topi portatori di tumore A549-cuscinetto Il giorno 16, la conferma istologica è stata effettuata da una macchia di H & E di tessuti tumorali escisse. Il gruppo di trattamento HB-P-NP ha dimostrato la morte più completa delle cellule tumorali. Barra di scala = 500 micron, ingrandimento = 40X. Adattato da Chang et al. 10 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La fase più critica in questo studio sta selezionando le condizioni appropriate laser: lunghezza d'onda, il potere, e il tempo di irradiazione. La corretta lunghezza d'onda della luce adatta per il fotosensibilizzatore specifico è necessario per la PDT. Abbiamo utilizzato un laser a 630 nm, che era appropriato per hypocrellin B. La potenza di uscita è stato un altro fattore importante, che è stato fissato a 400 mW / cm 2 sulla base di molti studi pilota. Potenze di uscita superiore a 400 mW / cm 2 danneggiato le cellule o la superficie della pelle degli animali a causa della radiazione stessa, mentre potenze di uscita inferiori a 400 mW / cm 2 erano troppo deboli per mostrare alcun effetto terapeutico. I tempi di irraggiamento appropriate per la in vitro e in vivo sono stati 40 sec (16 J / cm 2) e 500 sec (200 J / cm 2), rispettivamente. La distanza dalla fibra PDT alle cellule o ai tessuti tumorali dei modelli animali è stato anche un fattore critico in questo studio. Per coprire l'intera cella o superficie del tumore con laluce, 1 cm è risultato essere la distanza ottimale.

Se si applica un fotosensibilizzatore diversa, l'uso della corretta lunghezza d'onda della luce può massimizzare l'efficacia PDT. Il tempo di potenza di uscita e l'irradiazione deve essere fissato attraverso tentativi ed errori. Quando la superficie della pelle inizia a bruciare durante l'irradiazione di luce, la potenza di uscita dovrebbe essere inferiore. Quando la superficie del tumore mostra alcun cambiamento il giorno dopo PDT, può indicare la necessità di aumentare la potenza di uscita.

Questo metodo presenta alcune limitazioni. In primo luogo, se la distanza dalla fibra PDT al bersaglio è un fattore importante in questo studio, è difficile garantire l'uniformità. La distanza può variare leggermente perché è controllato dagli esseri umani. In secondo luogo, per il modello animale con tumori in organi quali il polmone, questo protocollo è difficile applicare poiché l'endoscopia è necessaria e movimento respiratorio inevitabile.

Sebbene la resezione chirurgica è il primoopzione per il trattamento del cancro del polmone, PDT ha diversi vantaggi come un trattamento alternativo non invasivo e non chirurgico. Quando l'operazione non è appropriato, come ad esempio in più casi di lesione, PDT può essere una soluzione valida. Inoltre, preoperatoria PDT può ridurre le dimensioni del tumore e ridurre il grado di intervento chirurgico 17. PDT ha meno effetti collaterali rispetto alla chirurgia, radioterapia o brachiterapia endobronchiale. Inoltre, PDT è irrilevante per le mutazioni che forniscono la resistenza alla radioterapia o chemioterapia 18.

In questo studio, abbiamo suggerito entrambi i polmoni nanoparticelle cancro mirati droga incapsulati photosensitizer- e antitumorali come un sistema di consegna fotosensibilizzante romanzo per PDT. Questo concetto può essere applicato ad altri fotosensibilizzatori e farmaci antitumorali.

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Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dalla concessione n. 14-2014-017 dal Fondo di ricerca SNUBH.

Gli autori sono in debito con J. Patrick Barron, professore emerito, Tokyo Medical University e Professore, Seoul National University Hospital Bundang per il suo pro bono la modifica di questo manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
oligo hyaluronic acid Bioland Co., Ltd. _
DS-Y30 (ceramide 3B; mainly N-oleoyl-phytosphingosine) Doosan Biotech Co., Ltd. _
adipic acid dihydrazide Sigma Aldrich A0638
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Sigma Aldrich 39391
4-(chloromethyl)benzoyl chloride Sigma Aldrich 270784
Tween 80 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. T0546
syringe filter Sartorius Stedim Biotech GmbH 17762 15 mm, RC, PP, 0.45 µm
triethylamine Sigma Aldrich T0886
Mini-GeBAflex tubes Gene Bio-Application Ltd. D070-12-100
Paclitaxel Taihua Corporations _
RPMI-1640 Gibco Life Technologies, Inc. 11875
Penicillin–streptomycin Gibco Life Technologies, Inc. 15070
Fetal bovine serum Gibco Life Technologies, Inc. 16140071
Celite (Filter agent) Sigma Aldrich 6858 See step 1.4

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References

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