Abstract
Klinisk embryo forglasning udviklet sig med udvikling af unikke vitrificeringsmidler enheder i det 21. århundrede og med den misforståelse, at ultra-hurtig afkøling i en "åben" systemet (dvs. direkte LN 2 kontakt) var en nødvendighed for at optimere vitrifikation succes. Dogmet omkring vigtigheden af nedkølingshastigheder førte til usikre fremgangsmåder underlagt teknisk variation og til skabelsen af vitrificeringsmidler enheder, bort vigtige kvalitetskontrol faktorer (f.eks, brugervenlighed, repeterbarhed, pålidelighed, sikkerhed mærkning og opbevaring sikkerhed). Forståelse af kvalitetskontrol fejl af andre enheder er tilladt for udviklingen af en sikker, gentagelig, og pålidelig uS-VTF metode til formål at minimere intra- og inter-tekniker variation. Lige så vigtigt, det kombinerede tilgængeligheden af to eksisterende FDA-kompatible enheder: 1) en 0,3-ml ionomer harpiks embryo strå med internaliseret, dual-farvet, pille-ptag mærkning med gentagelig svejsningsforsegling potentiale; og 2) forkortes, almindeligt anvendte, sterile 300-um ID flexipettes til direkte indlæse embryo (er) for at skabe et højt effektiv global vitrifikation enhed. Ligesom andre aseptisk, lukket sintringszonerne systemer (f.eks Høj sikkerhed Forglasning (HSV), Rapid-i, og VitriSafe) effektivt i reproduktiv medicin, microSecure Forglasning (uS-VTF) har bevist, at det kan opnå høj post-opvarmning overlevelse og graviditet resultater med sin opmærksomhed på enkelhed og reduceret teknisk variation. Selv om 0,3-ml embryo strå indeholder en intern hydrofob stik kommercielt blev erstattet med en standard sæd strå besidder bomuld polyvinylpyrrolidon (PVP) stik, det fastholdt sin ionomer harpiks sammensætning for at sikre svejse forsegling. Dog kan de bomuld stik væge ud væske-embryo indholdet af flexipettes ved kontakt. En modificeret uS-VTF metoden blev tilpasses til at omfatte en ekstra intern svejsningforsegle før stikket på enhedens lastning side. Den ekstra teknisk skridt til uS-VTF procedure har ikke påvirket dets succesfuld anvendelse, da høje overlevelsesrater (> 95%) og graviditet satser fortsat i dag.
Introduction
Vitrifikation er den mest gennemslagskraftige assisteret reproduktiv teknologi i in vitro fertilisering (IVF) industrien siden udviklingen af ICSI. I dag er blastocyster er kryokonserveret uden tab i embryo levedygtighed tidligere var forbundet med konventionelle langsomt indefrysning metode 1. Med pålidelig post-opvarmning embryo overlevelse, er infertilitet industrien omdanne til det foretrukne brug af kryopræserverede embryo transfer cykler, der giver tilsvarende eller højere graviditetsudfald end traditionel frisk ægoplægning. I samarbejde med blastocyst biopsi og præimplantationsperioden genetisk screening (PGS), er forglasning blevet et vigtigt klinisk redskab til at optimere sunde levende fødsel resultater via euploid enkelt ægoplægning 2, 3.
Murint embryo forglasning blev udviklet i midten af 1980'erne 4, 5 og tilpasset dyr landbrug med 1990 6. Baseret på den forudsætning, at vitrificeringsopløsninger danner en metastabil glasseous tilstand, uden at beskadige iskrystaldannelse, har det vist sig mere effektivt bevare fuldstændig cellulær integritet af embryoner. Interessant, har lovende accept af forglasning i human embryologi ikke begynde at blive realiseret indtil det 21. århundrede. Tidlige publikationer fremme af anvendelsen af forglasning faldt sammen med udviklingen af unikke "åbne" systemenheder 7, 8, 9. Men vedtagelsen af forglasning til klinisk praksis var langsom, da det kom på et tidspunkt, hvor forbedringer i langsom blastocyst frysning også forekommer. Vellykket konventionel langsom hastighed frysning, udover forglasning, var tilpasset til hinanden med forbedringer i embryo dyrkningssystemer, samt med indeholdendion af blastocoelen-kollapse tilgange, som forbedret både den samlede overlevelse trophectoderm og efterfølgende implantation 10.
I det sidste årti har forglasning teknologi hurtigt fortrængt konventionelle frysning praksis. I vid udstrækning, dette skyldtes udvikling af specialiserede vitrificeringsmidler enheder. Nogle af disse enheder har hæmmet den overordnede sikkerhed, effektivitet og klinisk forglasning ved at indføre iboende konstruktionsfejl til enheder, der anvendes i IVF industri 11. Faktisk nuancerne i forskellige enheder indfører betydelig teknisk variation mellem programmer, der almindeligvis omtales som "tekniske underskrifter" 12. Således videnskabelige tidsskrifter, ligesom Tidende visualiseres Forsøg (JOVE), kan tjene som en værdifuld ressource for at demonstrere tekniske detaljer, der vil bidrage til at reducere resultatet variation. Et andet vedvarende problem er at sogle embryologer fortsat misinformeret, selv i dag, er baseret på påstande om, at de "ultra-hurtig afkøling af embryoner eller oocytter i en 'åben vitrifikation system" (dvs. direkte embryo kontakt med flydende nitrogen (LN 2)) er en forudsætning for at optimere succesrater. " Det er klart, denne tro er unøjagtige, baseres på afprøvede succes aseptisk lukkede systemer 13, 14, 15.
Baseret på de cryobiological principper forglasning, effekten af forglasning er mere stærkt afhængig af opvarmning satser end ved afkøling satser 16, 17, 18. I almindelighed uafhængigt af forglasning anordning, der anvendes, skal den opvarmningshastighed overstige afkølingshastigheden at forsikre høje overlevelsesrater. Høje opvarmning satser minimere risikoen for eventuel is vækst (dvs. Recrystallization af kerneholdige urenheder i cryo-løsninger) under afglasning fase af opvarmning. Indrømmet, kan stabiliteten af vitrificeringsopløsningen (dvs. typen og koncentrationen af kryobeskyttelsesmidler anvendt) have en forstyrrende effekt, men dette behandles i en særskilt publikation 11. I betragtning af de kølende-opvarmning forrentede spørgsmål blev MicroSecure vitrifikation (uS-VTF) udviklet i 2008 som en billig, ikke-kommerciel, FDA-kompatible metode, optimeret kvalitetskontrol aspekter af vitrifikation. Det var enestående, fordi det tilbudt forfalskes, internaliseres, dual-farvet mærkning. Endvidere ved lastning og lagring af embryoner direkte i sterile flexipette anvendes til pipettering (dvs. uden pipettering til en sekundær enhed overflade) og ved anvendelse af ionomer-harpiks sugerør, der fuldstændig svejsningsforsegling anvendelse af en automatiseret sealer, teknisk variation reelt er fjernet.
Ved vurderingen af completeness af vitrificeringsmidler udstyr til potentielle anvendelse, er der flere kvalitetskontrol faktorer, der bør tages i betragtning, herunder: 1) mærkning potentielle -Kan etiketter være sikkert levet? Er de Tamperproof? Har de tilbyder tofarvet potentiale identifikation? Kræver det en sekundær etiket, og kan etiketten let fjernes for registreringsformål (dvs. patientens kontrol) efter opvarmning? 2) Teknisk lethed -Kan embryoner let indlæst i / på enheden i tide og simpelthen identificeres og spores efter opvarmning? 3) Procedural enkelhed / Repeterbarhed -Er det vitrifikation metode tilbyde enkelhed og pålidelighed, der nemt giver mulighed for repeterbarhed, hvilket minimerer variationen mellem teknikere (interne) og programmer (eksterne)? 4) LN 2 lagringskapacitet -Kan enhederne nemt og sikkert håndteres og identificeret? Er deres storase potentiel plads effektiv? Kan enheden tilbyde sikkerhed mod fysisk skade eller mulige forureninger som et aseptisk lukket system? 5) Inddrivelse potentiale / Overlevelsesevne -Er enhedens design udsat for potentielle problemer i den garanterede inddrivelse af embryoner, og de vil sikkert sintre og opretholde fuldstændig cellulær integritet post-opvarmning? Sidstnævnte specifikke kvalitet bekymring, recovery rate, rent faktisk er blevet overraskende minimeret i offentliggjorte rapporter; dette gøres ved generelt at skjule det ugunstige resultat (dvs. tabte embryo eller æg) i typisk-god overlevelsesrater. Alle enheder udsat for inkonsekvent opsving (<99%) er behæftet med alvorlige fejl og udgør en proceduremæssig forpligtelse.
Vores aseptisk, lukkede uS-VTF metode er strategisk udviklet til at redegøre for hver kvalitet-kontrolforanstaltning. Men efter 5 års overlegen klinisk succes og validering 14, proceduren havde to være ændret. De oprindelige 0,3-ml embryo strå (som har et hydrofobt prop) blev fjernet fra IVF industrien og erstattes med en 0,3-ml sæd strå besidder en standard bomuld / PVP stik (dvs. relabeled som sæd / embryo halm). Denne proceduremæssige papir beskriver de specifikke skridt og strategier, der er nødvendige for at gennemføre uS-VTF sikkert, simpelthen, og effektivt. Desuden fremhæver vi modifikationen (s) til pålidelig redegøre for begrænsninger forsyning, indtil alternativ ideal halm container genindføres tilbage i det kliniske laboratorium.
Protocol
Udviklingen af uS-VTF proceduren blev udført som en del af et godkendt Institutional Review Board (IRB) undersøgelse i 2008-2009 (Aspire IRB, Santee, CA) på menneskers oocyt og embryo kryopræservering. Proceduren er siden blevet rutinemæssigt anvendt til klinisk behandling af infertilitet patienter, der har underskrevet informeret samtykke former.
1. kvalitetskontrol Overvejelser
- Brug forskellige farver (f.eks penne, etiketter eller identifikation (ID) stænger eller stik) at skelne mellem patienter, hvis kryopræservering mere end én gruppe af embryoner på en dag.
- Brug forskellige retter og pipetter for hver patient. Minimer mængden af mediet overføres, når flytter blastocyster fra én løsning til en anden.
- Cryopreservering en blastocyst pr halm eller enhed. Oprethold aseptisk / steril teknik og overholde alle sikkerhedsregler.
- Bekræft Physicians 'Henvisning Form og underskrevet patient samtykke inden initiating procedurerne. Tjek disponeringen af patienternes embryo (r) i opgørelsen.
- Brug en "Frigivelse af ansvar og Samtykke for transport", hvis der skal overføres til en anden facilitet de blastocyster. Sørg for, at alle underskrifter er vidne til onsite eller notarized.
- Bekræft passende foranstaltninger kvalitetskontrol på mellemlang og protein kosttilskud, som er relevant, herunder bioassays, endotoksin bestemmelser og udløb / lotnummer verifikation og sporing.
- Fastsætte kritiske grænser (dvs. lavt bekymring) til klinisk kryopræservering udfald overvågning og evaluering, såsom genvindingskvoterne: <95%, overlevelsesrater: <80%, og kliniske graviditet satser bruger enkelte-euploid blastocyster: <50%.
2. Kryopræservering Procedure
- Forberedelse
- Udfyld relevante papirer, herunder indtastning af data i de regneark og kryopræservering database og inventar log(S).
- Forbered friske kryopræservering løsninger eller bruge en kommerciel kilde (overholdelse af producentens anbefalede opbevaringsforhold og holdbarhed forhold).
- Straw præparat.
- Åbn mærkning side af de individualiserede sterile pakker. Tag fyldet dyse findes på traditionelle 0,3 ml embryo strå ved at gribe den mod emballagen og delvist løfte og trække halmen ud; dette vil udsætte etiketten ende til omgivelserne, mens halmen hviler aseptisk inde i plastik pakke.
- (Modificering) til 0,3-ml sæd / embryo strå, skubbe proppen ned 0,5 cm. Påfør et internt forsegling foran bomuld PVP stik ved brug af en grundlæggende bordplade impuls sealer.
- Indstil halmen på Teflon overflade af elektroden, lige foran proppen. Tryk håndtaget for at aktivere varmen. Slip håndtaget, når det røde lys vises. For at sikre en fuldstændig svejsningsforsegling, varme ved en temperatur, der er tilstrækkelig flattens de modstående flader, så vend det 180 ° og forsegle den modsatte overflade 19 efter behov.
- Åbn mærkning side af de individualiserede sterile pakker. Tag fyldet dyse findes på traditionelle 0,3 ml embryo strå ved at gribe den mod emballagen og delvist løfte og trække halmen ud; dette vil udsætte etiketten ende til omgivelserne, mens halmen hviler aseptisk inde i plastik pakke.
- Ved hjælp af en cryomarker, mærke hver halm / enhed og cryogoblet med patientens navn, et unikt id-nummer (f.eks SSN, DOB, eller patient-ID-nummer), og datoen for frost. Omfatter også et unikt nummer på hver strå / enhed (f.eks 1, 2, 3, osv).
- Fastgør etiketten (helst farvet) på en farve-vægtet ID stang, der skal indsættes og forseglet i en 0,3-ml embryo strå. Retur halmen til sin individuelle sterile emballage indtil brug.
Bemærk: Hvis kun 30-mm Farve-vægtede ID stænger er tilgængelige, så er der behov for yderligere indsættelse af to kuglelejer, der støder op til hver side af ID stang.
- Fastgør etiketten (helst farvet) på en farve-vægtet ID stang, der skal indsættes og forseglet i en 0,3-ml embryo strå. Retur halmen til sin individuelle sterile emballage indtil brug.
- Identificer hver stok med et unikt afmærket id-nummer. Identificere en LN2 lagertank nummer og en kanister nummer, hvor hver patients prøve (r) kan være stORed lang sigt.
- Forbered friske kryo retter (100 mm) ved mærkning undersiden med patientens navn, løsning id, og embryo / holder dråbe ID (figur 1A). Konkret oprettet 4 rækker dråber: isotoniske hepes-buffer medium (øverst), V1 (ækvilibreringsopløsningen (ES)), V2 (mellemløsning (IS)), V3 (vitrificeringsopløsning (VS), nederst). Skriv embryo-id i øverste højre side med mærkede kolonner.
Bemærk: En serie af 25- til 50-pi vaske dråber (n = 3) anvendes til at sikre, at hver enkelt endelig 10- til 15-pi holding dråbe / løsningstype (dvs. V1, V2 eller V3) er ren og ufortyndet. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde kan op til fem individuelle embryoer kan ved forglasset ved anvendelse af en enkelt skål. Hold hver ret dækket, når ikke er i brug for at undgå enhver stuetemperatur fordampning / dehydrering af dråberne. - Forbered sterile flexipettes ved at skære 3 cm fra deres base ende (benævnt "VTF tips"). Sæt dem på individuelpipetter (fastsat til 3 uL) og indstille pipette-VTF tips oprejst i en styrofoam rør rack (figur 1B).
- Embryo Selection
- Bekræft patient / prøveeksemplar identifikation.
- Ved hjælp af en omvendt mikroskop (200 - 400X forstørrelse), grad og klassificere blastocyster ifølge Gardner klassificeringssystem 20, ved hjælp af en numerisk klassifikation af 1 til 6 for tidligt at skraverede blastocyster henholdsvis og en A, B eller C klasse tildelt til den indre cellemasse (ICM) og trophectoderm (TE).
Bemærk: Som forberedelse til blastocyst biopsi og euploidy analyse, zona pellucida er pre-udklækket med laser ablation på dag 3 for at fremme den tidlige herniation af TE og kræver således en modificeret grading klassifikation 2. Kort sagt, grad 3 fuld blastocyster udviser op til 10% TE herniation, Grad 4 udvidede blastocyster er 10 - 50% udklækket, og Grade 5 udrugning blastocyster har> 50% TE extrusion (Figur 2A-C).
Bemærk: Vi foretrækker at kryopræservere grad 3 eller højere blastocyster af ≥BB kvalitet på dag 5 eller 6. Dog, forglasset blastocyster af lavere kvalitet (C) og post-komprimering embryoner på tidligere stadier (herunder sent morula til grad 1 eller 2 blastocyster ) kan sikkert overleve opvarmning helt intakt og give levedygtige embryoner stand til at opnå levende fødsler. - Kollapse blastocoelen af hver blastocyst før igangsættelsen af cryodilution proces ved micropuncturing en trophectoderm vejkryds eller ved at udføre en laser pulse ablation af en trophectodermal celle 21, hvis anvendelse af lav-molær vitrificeringsopløsninger (<6,5 M eller 40% v / v).
Bemærk: Det er nødvendigt at skjule blastocyster er ikke enhed afhængig. I vores egen tidlige udvikling af uS-VTF (2008), vi oprindeligt brugt ethylenglycol (EG) / DMSO-opløsninger succes med oocytter (1 ud af 1 fuldbårne graviditet), men en sub-optimale (<80%)overlevelse / udvikling af museblastocyster 16 blev oplevet af andre 21. Eftersom høje molære glycerol-baserede løsninger (over 7,9 M) anvendes i vores nuværende VTF systemet (2009-), fysisk blastocoelen kollaps er unødvendig. Men den selektive udklækning af udklækkede blastocyster er tilrådeligt i almindelighed.
- Cryodilution og Blastocyst Loading
- Fjern patienten kultur fad fra inkubatoren og bekræft patient / prøveeksemplar identifikation med en anden person (dvs. bevidnet af en sekundær kilde) før du fjerner fosteret (r), der skal forglasset.
- Bekræft blastocyst udvikling per trin 2.2.2, opdatere cryo datablad, og, under stereomikroskopi, pipette blastocyst (r) fra kulturen fadet i en isotonisk beholdning dråbe af kryo parabol.
- Flyt hver blastocyst i individuelle bedrift dråber ved hjælp af vitrifikation flexipette (dvs. VTF spids).
- flytte hverblastocyst i V1 (ES) opløsning.
- Udfyld forud for flexipette med V1 løsning (3 pi) og placere halvdelen af indholdet på embryoet.
- Aspirer embryo og flytte til den første af tre V1 vaske dråber (nævnt i trin 2.1.6), pipette embryonet 2 - 3 gange rundt omkredsen, og rydde indholdet af pipetten i dråben (undgå bobledannelse) eller udenfor på skål overflade.
- Fyld VTF spids med den næste V1 vask drop og gentage aspiration af embryo (r). Gentag en tredje gang og flyt blastocyst (er) til et individ V1 bedrift dråbe. De fortynding / vasketrin bør tage 30 til 45 s. Pre-load hver VTF spids med næste løsning (f.eks V2), indsæt pipetten i et rack, og bruge det næste pipette (ifølge opsætningen i trin 2.1.7) (figur 1B).
Bemærk: Da den samlede eksponeringstid i ikke-dimethylsulfoxid (DMSO) indeholdende V1 og V2 løsninger er 5 min hver, pipettering af indobbelte blastocyster bør være jævnt forskudt inden dette interval, betragtning af, at den endelige V3 skridt vil kræve mindst 1 min pr blastocyst at udføre. For eksempel, hvis der er 4 blastocyster i en forglasning gruppe, pipettespidser blastocyster # 1-2-3-4 ved 75-s intervaller.
Bemærk: Den Innovative Cryo Enterprises (ICE) fortynding protokol beskrevet ovenfor, er tydeligt anderledes end de fleste andre kommercielle sintringszonerne procedurer, som generelt involverer DMSO-opløsninger. Disse protokoller opnå de samme trinvise fortyndinger ved en gradvis, men mindre kontrolleret, sammenlægning af vaskeopløsning (dvs. isotonisk medium), ES, og VS. - Gentag trin 2.3.4 og 2.3.5 ved hjælp V2 (IS) løsninger.
- Gentag trin 2.3.4 og 2.3.5 ved hjælp V3 (VS) løsninger.
- Ved at placere hver blastocyst i V3 holde dråben, rydde den tilbageværende opløsning og bobler fra VTF spids (uden dråben), og derefter udfylde spidsen helt med rent V3 omkring fosteret. Expel omtrent en tredjedel af volumenet (1 pi) og pipette blastocysten (er) og resterende V3 helt ind i VTF spids.
- Fjern VTF tip fra pipetten, tørre spidsen tørre af resterende V3 på den ydre overflade ved anvendelse af en steril gaze, og indsætte den spidse ende-først i den åbne ende af præ-mærkede halm. En "tør tip" er kritisk for at forhindre eventuel indre halm tilslutning.
- Vend halm (etiket ende ned), observere spidsen på den indre prop eller segl, og sikkert forsegle den åbne ende med 1 cm af luftrummet. Fortrinsvis bruge en automatisk lukkeanordning (f.eks Syms I) for at fjerne tekniske variation.
Bemærk: Fordelen ved at bruge sugerør, der er sammensat af en ionomer harpiks plast (f.eks HSV eller uS-VTF) er, at ved hjælp af en korrekt betjente varme forsegling Enheden opretter en pålidelig "svejse" segl, som noteret i trin 2.1.3.1. - Når forseglet, kaste den lukkede halm direkte ind i LN 2 i en rustfriess stål Dewar-kolbe og placere halmen (er) i det åbne bæger fastgjort til patientens sukkerrør til opbevaring.
Bemærk: Fordi uS-VTF sugerør bruge 40 mm vægtede ID stænger til at opveje opdrift det luftfyldte halm, til brug af omvendte pokaler eller tomme kryoglas dække prøven (e) er ikke påkrævet, medmindre transporten er involveret.
- Warming og Cryo-løsning Eluering / Fortynding
- Bekræft Physicians 'Referral Form vedrørende forglasset ægoplægning dato, planlagt tid, og embryo detaljer (antal at tø / overførsel, specifik embryo nummer, hvis PGS testet, etc.).
- Forbered friske opvarmning løsninger (1,0 M sucrose stamopløsning) og / eller bruge en kommerciel kilde (anbefalet en uge-1 måneds holdbarhed gang i brug, 4 ° C opbevaring).
- Portion 17,1 g saccharose i 50-ml sterile kolber upon indledende åbning (f.eks ugentlig forsyningskilde) på grund af risikoen for endotoksin ophobning i saccharose graNules ved gentagen omgivende eksponering.
- Bland forvejet granulære saccharose i opløsning (1,0 M stamopløsning = 3,42 g / 10 ml hepes pufret human tubal væske [H-HTF]) og opvarme opløsningen op til 37 ° C for at forøge opløseligheden af granulerne. Bland beholderen for at hjælpe med at fremskynde og færdiggøre den endelige blanding.
Bemærk: Filtrering (0,22 um filter) udføres ved hjælp af positive pres filtreringsenheder anbefales til tyktflydende løsninger (> 0,5 M saccharose) eller store mængder. Hand trykpumper er tilstrækkelige og billig, mens en elektrisk pumpe er støjende, forårsager vibrationer, og er simpelthen ikke nødvendig.
- Varm (37 ° C) en 10-ml rør hver 1,0 M saccharoseopløsning og H-HTF-medium per patient for uS-VTF opvarmning bad brug.
- Forbered friske optøning retter (6-brønds plade) ved at mærke dækslet overflade med patientens navn og opløsningen id'er.
Bemærk: I dette tilfælde brugte vi: (1) T1 vask (200 μL uden olie overlay, (2) T1 (100 pi) med 1 ml olie, (3) T2 (100 pi) med olie, (4) T3 (100 pi) med olie, (5) T4 (100 pi) med olie, og (6) T5 / 200 pi isotoniske HEPES-bufret medium med 10% humant serumalbumin (HSA) eller 20% serumsubstitut uden en olie overlay. Påfør en universel saccharoseopløsning nedtrapningsmetode-T1 = 1,0 M, T2 = 0,5 M, T3 = 0,25 M, og T4 = 0,125 M-hvis ICE eller anden kommerciel kilde ikke er tilgængelig, som foreslået for slow-frosne embryoner 22 . Endvidere bemærkes, at den oprindelige T1 vask, og de endelige T5 equilibrations kan udføres i 30-mm petriskåle og 4-brønds skål anvendes til trin 2-5 ovenfor, involverer en olie overlay. - Optø kun én patientens embryo (er) ad gangen.
- Kontroller Physicians 'Henvisning Form og bekræft cyklen før opvarmning det angivne antal (dvs. 1 eller 2 blastocyster); vurdere overlevelsen / sandsynlig levedygtighed ved at observere osmotiske ændringer (dvs. SHRinkage og rehydrering) og intakte membraner, og hvis tvivlsom, kontakte lægen og / eller patienten før opvarmning anden blastocyst.
- Bekræft patient / eksemplar identifikation med en kollega (dvs. bevidnet af en sekundær kilde).
- Placer patienten sukkerrør i en Dewar-kolbe fyldt med LN2 og isolere identificere halmen skal opvarmes.
- Bring 6-brønds fortynding skålen til centrum af stereomikroskop fase. Placering af et 60-mm petriskål ud til den ene side (dvs. afhængigt af den venstre eller højre præference teknikeren), tilsæt opvarmet saccharose (1,0 M) og H-HTF løsninger for at skabe en 0,5 M saccharose opvarmning bad (afdækket).
Bemærk: VTF tip er kun varmes i 0,5 M saccharose løsninger som en QC sikkerhedsforanstaltning, for at sikre opretholdelsen af embryo levedygtighed i sjældne tilfælde, at et foster er bortvist på hurtig opvarmning 22. - Hold det øverste halm tætning over væskeniveauetat bekræfte identiteten, og derefter gribe og fastgør halmen under den interne stik ved hjælp Mayo saks (den VTF spidsen skal stadig nedsænkes i LN 2).
- Bankes saksen på Dewar kolben (et par gange) for at fjerne VTF tip fra den indre halm sidevæg som en QC sikkerhedsforanstaltning; hvis VTF tip er klæbende, aftapningen sikrer, at spidsen basen falder til den tætnede ende modsat den mærkede ende, hvorved der tilvejebringes et luftrum nær proppen ende.
- Løft halm med saksen i luften i en vandret position (ved siden af eller under Stereoskopet overflade) og gribe den ikke-mærkede ende (etiket til højre side). Skær halm på den indre prop eller forsegle og løft den over opvarmning bad fad. Hæld VTF spids i det varme saccharose bad ved en 60 ° vinkel, indtil det er helt ekstruderet og har været hurtigt opvarmet (> 6.000 ° C / min); bunden af flexipette vil hvile over skålen sidevæg.
- Lad VTF tip til frit fald i badet. Bank forsigtigt på den øverste halm overfladen, hvis spidsen ikke umiddelbart opstå. Hvis det synes kun delvis måde, bistå ved ekstrudering ved at gribe skaftet af flexipette med saks eller fine tænger.
- Efter 5 - 10 s, fat pipetten base og indsætte i en engangs pipettering enhed; et hul i pæren virker til at frigive trykket ved indsættelse. Dæk pæren hul med en pegefinger og forsigtigt klemme pæren for at frigøre forglasset blastocyst ind i T1 vask (# 1), mens du ser ved stereomikroskopi. Når bekræftet, rydde resterende V3 (VS) løsning, og boblerne ved overtryk, evakuere indholdet ind til centrum, ubrugt udsmid godt. Start en 5-minutters timer.
Bemærk: Alle saccharose fortyndingstrin udføres ved stuetemperatur (21 ± 2 ° C). - Fjern VTF tip og placere den på en pipette. Fortsæt ved at flytte embryo i T1 # 2 under olie for den resterende tid (ca. 3 - 4 min). <ol>
- Hvis en anden blastocyst er nødvendig for overførsel, straks varm en anden halm og VTF tip (gentage trin 2.4.9 - 2.4.11) fra patienten før initiering trin 2.4.12. Bevæge begge blastocyster sammen i mindst eluering i T1 (1,0 M saccharose) på mindst 3 min.
- Pre-fylde flexipette med den næste opløsning, og derefter flytte og fortynde blastocyst (r) i T2, T3 og T4 på 3-minutters intervaller. Hvis zona pellucida er ikke tidligere blevet laser ablateret (dvs. skraveret), gøres i T4. Sæt fadet ind på scenen af et omvendt mikroskop og image embryoet på en computerskærm. Juster zona inden for et udpeget rød cirkel og aktivere 2 eller 3 impulser en diodelaser (begynder ved kanten af perivitelline plads og flytte udad) for at oprette en åbning 2, 19.
- Ækvilibrering af blastocyster i T5 (dvs. isotonisk medium) i 5 minutter på en varm overflade (37 ° C).
- Vurdere den indledende embryo overlevelse baseret på den dominerende tilstedeværelse af intakte cellemembraner med endnu, gennemskinnelige cytoplasmaer blottet for pyknotiske mørkfarvning. Placer embryo (er) i kultur i 2 - 6 timer før ægoplægning, på hvilket tidspunkt, embryo udvikling / overlevelse bør revurderes og dokumenterede.
Bemærk: Hvis der findes mere end en levedygtig blastocyst på tidspunktet for overførslen, og patienten vælger at gå videre med kun 1 blastocyst, den supplerende blastocyst derefter med held igen forglasset (rVTF) ved at gentage trin 2.3.3 - 2.3.11. Vi har flere bekræftede levendefødte efter enkelt rVTF begivenheder.
Bemærk: rVTF er blevet eksperimentelt udført op til 5 gange uden en signifikant virkning på overlevelsen / levedygtighed aneuploidi humane blastocyster forglasset i en metastabil glycerol-baseret løsning.
Representative Results
1.341 forglasset blastocyster blev varmet mellem 2012 til juni 2014 og 1.341 embryoner inddrevet (100%), mens 1316 overlevede (98,1%). Biopsi blastocyster oplevet i 99,5% overlevelse. Ved at overføre overvejende enkelt, genetisk testet, euploid, forglasset embryoner, var vi i stand til at opnå nogle af de højeste implantation satser og levende fødselstal i USA, uafhængigt af alder (figur 3) 20, ifølge de seneste nationale statistikker rapporteret af Center for Disease Control og Society for assisteret reproduktionsteknologi (tabel 1 og 2). Evaluering en god prognose patientpopulation (mindre end 35 år) for kryopræserverede cykler alene (tabel 1), vores laboratorium overgik landsgennemsnittet for både implantation satser (dvs. til effektiviteten af et foster etablere en graviditet) og i sidste ende lever fødselstal med over 30%. Derudover den indledende validering / verificering af vores modificerede storage sugerør i midten af 2014 ved hjælp af 70 forsknings-givet samtykke re-forglasset aneuploide blastocyster resulterede i 100% genvinding og 100% overlevelse.
Figur 1. MicroSecure VTF Setup. Den VTF parabol (A) er samlet med 3 forskellige rækker af vitrificeringsopløsninger, der udnytter 3 vask dråber før placering i distinkte, nummererede bedrift dråber. Derudover er enkelte pipetter med forkortede VTF tips (dvs. 300-um id flexipettes) sikret og organiseret i en styrofoam rør rack (B), som kan drejes til ordnet anvendelse. Bemærk, at en repræsentant engangs mikropipette pære pipettering samling hviler på styrofoam rack. Arget = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Modificeret Blastocyst Grading System. Vores modificeret Gardner blastocyst klassificeringssystem udgør den inducerede herniation af TE-celler for at lette blastocyst biopsi. Ændringen anser den for tidlige udklækning af fulde blastocyster (A: grad 3 = mindre end 10% herniation) og udvidede blastocyster (B: Grade 4 = op til 50% herniation), mens en udrugning blastocyst (C) har mere end 50% herniation 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
54871fig3.jpg "/>
Figur 3. Sammenlignende graviditetsudfald. Over en kumulativ 1,5-års interval, blev graviditet data i forhold til at vurdere virkningerne af overførsel forglasset-varmet euploid blastocyster (n = 172 cyklusser / 144 overførsler) sammenlignet med ikke-PGS cykler (n = 160 cyklusser / 153 overførsler) involverer overvejende frisk overfører 18. Til vores eksperimentelle formål, disse data viser klart, at biopsi blastocyster forglasset ved uS-VTF procedure bevare deres levedygtighed. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Datakilde | # Cycles | Mean # af embryoner overføres | Implantation Priser (%) | Levende fødselstal (%) |
| NB Lab * | 144 | 1.2 | 74.00% | 74.50% |
| landsgennemsnittet | 20.423 | 1.7 | 39.60% | 44.10% |
| * Data blev gennemsnit baseret på 2014 udførelsen af Orange County Fertilitet, det sydlige Californien Fertility Center og Southern California Center for Reproductive Medicine klinikker bruger den aktuelle Ovation Fertility laboratorium (NB Lab), som grundlagde microSecure forglasning procedure i 2008. | ||||
Tabel 1. 2014 CDC Assisted Reproductive Statistik. Frosne ægoplægning graviditet data for kvinder under 35 år fra tre rapportering læge klinikker bruger vores NB Lab forhold til USA 2013 landsgennemsnittet på over 450 rapportering klinikker.
| SART nationale gennemsnit | ||||
| Clinic - State | Kvinder | Kvinder | Kvinder | Kvinder |
| <35 år | 35-37 år | 38-40 år | 41-42 år | |
| SCCRM-CA * | 63,1% | 58,3% | 40,6% | 32,3% |
| CCRM-CO * | 64,7% | 61,5% | 40,4% | 32,2% |
| RMA-NJ * | 63,2% | 59,7% | 34,6% | 18,7% |
| landsgennemsnittet | 48,6% | 38,3% | 24,3% | 12,3% |
| SCCRM-Southern California Center for Reproductive Medicine; CCRM-Colorado Center for for Reproductive Medicine; og RMA-Reproductive Medicine Associates | ||||
| * Disse førende klinikker har alle overvejende implementeret forglasset embryo transfer cykler i samarbejde med præimplantationsperioden gentest, ind i deres standard praksis med patientpleje at optimere levende fødsel succes per embryo transplanteret. | ||||
Tabel 2. 2014 Kumulative levende fødselstal, som rapporteret af Society for assisteret reproduktionsteknologi (SART), for SCCRM Clinic ved hjælp af vores Ovation Fertilitet Lab i Newport Beach, Californien, i kontrast til flere andre respekterede programmer, såvel som med SART nationale gennemsnit.
Discussion
Dag, er der en høj forventning om at opnå fuldstændig blastocyst overlevelse (> 95%) og opnå implantation succes ligner den i friske embryoner. Nogle grupper har foreslået, at de levende fødselstal af forglasset embryo transfer cyklusser er måske endnu højere end friske blastocyster når den intakte kryopræserverede embryo er transplanteret ind i en sund, ikke-hormonelt-stimuleret livmoder. Vores data indikerer klart, at forglasning effektivt og pålideligt fastholder levedygtighed friske embryo. Desuden har vi bevist, at vores aseptisk, lukket metode, kaldet MicroSecure Forglasning (uS-VTF), kan opnå et optimalt resultat kan sammenlignes med eller større end de kommercielle standarder (dvs. åbne enhed systemer), der anvendes i IVF industrien.
Variation er forbundet med teknisk repeterbarhed og pålidelighed mellem personer, der bruger et væld af vitrificeringsmidler enheder / metoder. Til gengæld har dette resulteret i inconsistencies mellem programmer anvender vitrifikation. Derfor er det ikke overraskende, at enheden fortrolighed er en vigtig faktor med hensyn til laboratoriets præstationer og vellykkede resultater. Det er dette koncept af "teknisk signatur" 11, der forklarer, hvorfor repeterbarhed mellem programmer kan være problematisk. Ikke alene har udviklingen af mere end et dusin kommercielle enheder kompliceret dette fænomen, har det skabt kvalitetskontrol bekymringer. Heldigvis lukket sintringszonerne systemer, ligesom uS-VTF, Rapid-I, og VitriSafe, nu viser sig at være lige så effektiv til at åbne enhedens systemer 12, 13, 14.
MicroSecure VTF er en roman, aseptisk forglasning teknik udviklet med teknisk lethed, pålidelighed og cryo-sikkerhed i tankerne. Ved at kombinere brugen af to tidligere godkendt, FDA-kompatible enheder, det er en ikke-kommerciel vitrifikation systemet wed den klare fordel af at have en etableret lav pris i modsætning til specialiserede enheder. Desuden har sin unikke Manipuleringssikker og internaliseret dual-farvet mærkningsordning, samt talrige andre kvalitetskontrol fordele, lavet uS-VTF en attraktiv global løsning 11. Som en ikke-kommerciel VTF enhed, dog er dens udbredte industri ansøgning udvikler sig langsomt. Kun gennem den fortsatte offentliggørelse af dets sikkerhed, og klinisk effektivitet vil uS-VTF gevinst voksende udnyttelse.
I august 2014 når de står med den manglende evne til at erhverve den oprindelige 0,3 ml embryo strå fremstillet med en indre, ikke-fugtspredende hydrofobe stik, var vi i stand til pålideligt ændre uS-VTF metoden. Kort sagt, blev de nye 0,3-ml sæd / embryo strå med deres bomuld-PVP stik effektivt tilpasset. Dette blev simpelthen opnået ved at skabe en indvendig forsegling før bomuldsprop, hvilket forhindrer kontakt og fluidvægende medåben VTF spids (dvs. flexipette indeholdende embryo eller æg). Desuden, hvis 40-mm ID-stænger er ikke tilgængelige, opdrift problem forbundet med de lysere 30 mm stænger kan kontravægt ved hjælp af to kuglelejer.
Disse yderligere trin har gjort teknikken lidt mindre enkel, men stadig meget effektiv. I dag, økonomi og effektivitet bliver stadig bekymringer, som biopsi blastocyster typisk forglasset individuelt indtil deres euploidy status er bekræftet på en genetik rapport. Blastocyster med et bekræftet ikke-levedygtige aneuploidi status typisk bliver kasseret, med patient samtykke, inden ugen. Således er et flertal (> 50%) af VTF udstyr kasseres efter kortvarig opbevaring, der forårsager en eskalerende årlige omkostninger ved brug af kommercielle enheder. Samlet, uS-VTF er en yderst effektiv, pålidelig og gentagelig procedure for kryopræservering af humane blastocyster. Den overlegne kvalitet-kontrol design securely etiketter og sikkert gemmer embryoner / oocyter samtidig fjerne recovery fiasko og optimering af post-opvarmning overlevelse og levedygtighed, hvilket begrunder systemets anvendelse som en universel tilgang til embryo vitrifikation.
Disclosures
MC Schiewe fungerer som et medlem af det videnskabelige advisory board til Innovative Cryo Enterprises og som en teknisk direktør til California Cryobank. Produktion af denne video-artikel er blevet betalt af Ovation Fertilitet. Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle aftaler eller interessekonflikter at oplyse om vitrifikation af kønsceller og embryoner.
Acknowledgments
MC Schiewe takker Mr. Forest Garner på fertilitet Center Las Vegas for hans statistiske ekspertise i at analysere og evaluere de årlige CDC og SART data. Også forfatterne takker deres Medical Director, Dr. Robert E. Anderson, for hans dedikeret support og tro på vores tekniske evner og ekspertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Cane | IVM | XC055 | |
| Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel |
| CBS semen/embryo straw, 0.3 mL | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile |
| Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted |
| Culture tubes, 15 mL | Falcon | 352099 | Conical |
| Culture tubes, 10 mL | Falcon | 352057 | Snap-cap |
| Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | |
| Filter, 250 mL | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm |
| Flasks, Tissue Culture 50 mL | Falcon | 353014 | |
| Flexipettes, 300 μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack |
| Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | |
| Forcep, Splinter - fine | Miltex | 17-305 | |
| Goblet | IVM | PA003 | |
| Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110 V or 220 V with adapter |
| Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100 mL, or | stored at 2 - 8 ºC |
| Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100 mL | with non-essential AA's | |
| Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors |
| Liquid Nitrogen Tank, 40 L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage |
| LN2; Dewar flask, 0.5 L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel |
| 6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case |
| Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex |
| Petri Dishes, 35 mm | Falcon | 351006 | |
| Petri Dishes, 58 mm | Nunc | 150288 | |
| Petri Dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10 - 100 μL |
| Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable |
| Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| Pipettes, Serological 1 mL | Falcon | 357521 | |
| Pipettes, Serological 2 mL | Falcon | 357507 | |
| Pipettes, Serological 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Pipettes, Serological 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | |
| Sterile Gauze pads, 4" x 4" | Kendall Healthcare | 6939 | |
| Synthetic serum | Life Global, or | LGPS-20; 20 mL, or | stored at 2 - 8 ºC |
| Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10 mL | purchase low endotoxin lot | |
| Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50 mL flasks, 1 year; 17.1 g/flask + Medium to 50 mL; makes a 1 M solution; Filter with 0.22 µm unit |
| Timer | Nalgene | 5016-001 | |
| Thawing Solution | Innovative Cryo Enterprises | BL-TS (≤1.0 M Sucrose) | T1, T2, T3, T4; tored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening |
| Vitrification Solution*,** | Innovative Cryo Enterprises | BL-VS (≥7.9 M [Glycerol/EG]) | V1, V2, V3; stored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening |
| * Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | |||
| ** Other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8 M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2 M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. | |||
References
- Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Hum. Reprod. Update. 16, 536-554 (2012).
- Schiewe, M. C., Whitney, J. B., Anderson, R. E. Potential risk of monochorionic dizygotic twin blastocyst formation associated with early laser zona dissection of group cultured embryos. Fertil. Steril. 103, 417-421 (2015).
- Schiewe, M. C. The historic development and incorporation of four assisted reproductive technologies shaping today's IVF industry. J. Fertil. In Vitro Reprod. Med. Genet. 4, 2-9 (2016).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Rall, W. F., Wood, M. J., Kirby, C., Whittingham, D. G. Development of mouse embryos cryopreserved by vitrification. J. Reprod. Fertil. 80, 499-504 (1987).
- Schiewe, M. C., Rall, W. F., Stuart, L. D., Wildt, D. E. Analysis of cryoprotectant, cooling rate and in situ straw dilution using conventional freezing or vitrification for cryopreserving sheep embryos. Theriogenology. 36, 279-293 (1991).
- Lane, M., Schoolcraft, W. B., Gardner, D. Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique. Fertil. Steril. 72, 1073-1078 (1999).
- Mukaida, T., Oka, C., Goto, T., Takahashi, K. Artificial shrinkage of blastocoeles using either a micro-needle or a laser pulse prior to the cooling steps of vitrification improves survival rate and pregnancy outcome of vitrified human blastocysts. Hum. Reprod. 21, 3246-3252 (2006).
- Kuwayama, M., Vatja, G., Ieda, S., Kato, O. Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and elimination of potential contamination. Reprod. Biomed. Online. 11, 608-614 (2005).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Hum. Reprod. 17, 744-751 (2002).
- Schiewe, M. C. Quality control factors influencing the successful and reliable implementation of oocyte and embryo vitrification. Cryopreservation. Marco-Jiménez, F., AkdemirKoç, H. , 1st Ed, InTech. Rijeka, Croatia. (2016).
- Stachecki, J. J., Garrisi, J., Sabino, S., Caetano, J. P. J., Wiemer, K., Cohen, J. A new safe, simple, and successful vitrification method for bovine and human blastocysts. Reprod. Biomed. Online. 17, 360-367 (2008).
- Panagiotidis, Y., et al. Open versus closed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme: a prospective randomized study. Reprod. Biomed. Online. 26, 470-476 (2013).
- Papatheodorou, P., et al. Open versus closed oocyte vitrification system: a prospective randomized study. Reprod. Biomed. Online. 26, 595-602 (2013).
- Schiewe, M. C., Zozula, S., Anderson, R. E., Fahy, G. M. Validation of microSecure vitrification (µS-VTF) for the effective cryopreservation of human embryos and oocytes. Cryobiology. 71, 264-272 (2015).
- Schiewe, M. C. MicroSecure vitrification for oocytes and embryos: optimum simplicity, security and cost and effectiveness combining FDA-approved products. J. Clin. Embryol. 13, 33-51 (2010).
- Rall, W. F. Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification. Cryobiology. 24, 387-402 (1987).
- Seki, S., Mazur, P. Effect of warming rate on the survival of vitrified mouse oocytes and on the recrystallization of intracellular ice. Biol. Reprod. 79, 727-737 (2008).
- Schiewe, M. C. General hygiene and quality control practices in an embryo-production laboratory. Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the Use of Embryo Transfer Technology, Emphasizing Sanitary Precautions. Stringfellow, D. A., Givens, D. , 3rd Ed, International Embryo Transfer Society. Champaign, IL. (2008).
- Whitney, J. B., Nugent, N. L., Anderson, R. E., Schiewe, M. C. Single center validation of routine blastocyst biopsy implementation. J. Asst. Reprod. Genet. , (2016).
- Liebermann, L., Conaghan, J. Artificial collapse prior blastocyst vitrification: improvement of clinical outcomes. J. Clin. Embryol. 16, 107-118 (2014).
- Parmegiani, L., Tatone, C., Cognigni, G. E., Bernardi, S., Troilo, E., Arnone, A., Maccarini, A. M., Di Emidio, G., Vitti, M., Filicori, M. Rapid warming increases survival of slow-frozen sibling oocytes: a step towards a single warming procedure irrespective of the freezing protocol. Reprod Biomed Online. , (2014).
