Abstract
임상 배아의 유리화는 "오픈"시스템 (즉, 직접 LN 2 접촉)에 매우 급속 냉각이 유리화 성공을 최적화하기위한 필요성 것을 21 세기와 오해 독특한 유리화 장치의 발달과 함께 진화. 냉각 속도의 중요성을 둘러싼 교의 중요한 품질 제어 요소 (예를 들어, 사용의 용이성, 반복성, 신뢰성, 라벨 보안, 저장 안전성)을 무시 기술 변화 및 유리화 장치의 작성 대상 불안전되었다. 인트라 및 인터 - 기술자의 변화를 최소화하는 것을 목표로 안전하고, 보안, 반복 가능하고 신뢰성 μS-VTF 방법의 개발을 허용, 다른 디바이스의 품질 관리 결함 이해. 내면화, 이중 색상, 변조-페이지 1) 0.3 mL의 이오노머 수지 배아 짚 : 마찬가지로 중요한 두 개의 기존 FDA 호환 장치의 가용성을 결합반복 용접 밀봉 가능성이있는 지붕 라벨; 2) 직접 매우 효과적인 전역 유리화 장치를 생성하기 위하여 태아 (들)을로드 300 μm의 ID가 멸균 flexipettes을 일반적으로 사용되는 단축. 다른 무균처럼, 유리화 시스템 (예를 들어, 높은 보안 유리화 (HSV), 빠른-I 및 VitriSafe) 효과적으로 생식 의학에서 사용이 microSecure 유리화 (μS-VTF)를가 높은 포스트 온난화의 생존과 임신을 달성 할 수 있음을 입증 폐쇄 단순함에 대한 관심, 감소 기술 변화에 결과. 내부 소수성 플러그를 함유하는 0.3 mL의 배아 짚 상업적 솜 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVP) 플러그를 갖는 표준 정액 빨대로 대체되지만, 용접 밀봉을 보장하기 위해 이오노머 수지 조성물을 유지 하였다. 그러나, 면화 플러그 접촉시 flexipettes 유체 배아 내용을 심지 할 수있다. 수정 된 μS-VTF 방법은 추가 내부 용접을 포함하도록했다장치로드 측의 플러그 전에 봉인. μS-VTF 절차에 대한 추가 기술 단계는 성공적인 응용 프로그램, 높은 생존율 (> 95 %)에 영향을하지 않은 임신 율은 오늘 계속합니다.
Introduction
유리화는 세포질 내 정자 직접 주입술의 개발 이후 체외 수정 (IVF) 업계에서 가장 영향력있는 보조 된 생식 기술입니다. 오늘, 포배 이전에 기존의 느린 냉동 방법 1과 관련된 태아의 생존 능력의 손실없이 냉동 보관한다. 신뢰할 수있는 포스트 온난화 배아 생존, 불임 산업은 전통적인 신선한 배아 이식보다 비슷하거나 더 높은 임신 결과를 얻을 냉동 보존 배아 이식주기의 바람직한 사용로 변신한다. 배반포 생검 및 착상 전 유전 검사 (PGS)와 관련하여, 유리화는 euploid 단일 배아 이식 2, 3을 통해 건강한 출산 결과를 최적화 할 수있는 중요한 임상 도구가되었습니다.
쥐 배아의 유리화는 1980 년대 중반 4에서 개발 된 5 1990 년 6 축산업에 적응. 유리화 솔루션 얼음 결정의 형성을 손상없는 glasseous 준 안정 상태를 형성한다는 전제에 기초하여,보다 효율적 배아의 전체 세포의 무결성을 유지하기 위해 입증되었다. 흥미롭게도, 인간의 발생학에 유리화의 유망 수용은 21 세기까지 실현되기 시작하지 않았다. 유리화의 사용을 촉진 초기 공보 독특한 "열기"시스템 장치 7, 8, 9의 발전과 일치한다. 느린 배반포 동결 개선도 발생했다 때 한 번에 온 그러나, 임상 실습에 유리화의 채택은 느렸다. 성공적인 종래의 느린 속도 동결 유리화 이외에뿐만 아니라 incorporat와 배아 배양 시스템에서의 개선 된 정렬이후, trophectoderm의 모두 전체 생존율을 향상하고 blastocoele-붕괴 방식의 이온, 주입 10.
지난 10 년 동안 유리화 기술은 빠른 속도로 기존의 냉동 관행을 대체하고있다. 크게이 전문 유리화 장치의 발전에 기인 하였다. 이들 장치 중 일부는 IVF 산업 (11)에 사용되는 장치 고유의 디자인에 결함을 도입함으로써 임상 유리화의 전체 안전 효율 및 효과를 장애인있다. 사실, 다른 장치의 뉘앙스는 일반적으로 "기술 서명"(12)라고 프로그램 사이에 상당한 기술 변화를 소개합니다. 따라서, 과학 저널은 시각 실험의 저널 (주피터)와 같은 결과 편차를 개선하는 데 도움이 될 것입니다 기술적 인 세부 사항을 입증하기위한 귀중한 자원으로 역할을 할 수 있습니다. 또 다른 지속적인 문제는이 s입니다오메 발생 학자는 '오픈 유리화 시스템'의 배아 나 난자의 "매우 빠른 냉각 (즉, 액체 질소 (LN 2) 직접 배아 접촉) 최적화의 전제 조건임을 주장에 따라, 오늘날에도, 잘못 알고 계시는 계속 성공률. " 분명히,이 믿음은 시스템 13, 14, 15 폐쇄 무균의 검증 된 성공을 기반으로 부정확하다.
유리화 cryobiological의 원리에 기초하여, 유리화의 효능 등급 16, 17, 18 냉각보다 온난화 속도에 따라 더 크게 달라진다. 일반적으로 사용되는 유리화 장치 독립적 온난화 속도가 높은 생존율을 보장하기 위하여 냉각 속도를 초과한다. 높은 온난화 속도는 얼음 성장 (즉, recr 기회를 최소화온난화의 실투 단계에서 극저온 솔루션의 핵 불순물)의 ystallization. 부여 유리화 액 (즉, 유형 및 사용 cryoprotective 제의 농도)의 안정성은 교란 효과를 가질 수 있지만, 이것은 별도의 발행 (11)에 어드레싱된다. 냉각 온난화 속도 문제를 고려, MicroSecure 유리화 (μS-VTF)은 유리화의 품질 관리 측면을 최적화 비용이 들지 않는, 상업, FDA 준수하는 방법으로 2008 년에 개발되었다. 그것은 변조 방지, 내면화, 듀얼 컬러 라벨을 제공하는 것을 유일했다. 또한, 로딩 (보조 장치의 표면에 피펫 팅없이 IE) 피펫에 사용되는 멸균 flexipette 직접 배아를 저장함으로써 자동화 된 시일 재를 사용하여 완벽하게 용접 밀봉 기술 변화가 효과적으로 제거 된 이오노머 수지 빨대를 이용하여.
는 C를 평가할 때1) 라벨링 가능한 라벨 - 수 단단히 부착 될 : 잠재적 용도 유리화 장치 ompleteness 포함 고려해야 할 여러 가지 품질 관리 요인이 있는가? 그들은 부정 조작하고 있습니까? 그들은 이중 색상 식별 가능성을 제공합니까? 이 보조 라벨을 필요합니까, 레이블을 쉽게 기록 유지 목적 (즉, 환자 확인) 후 온난화 제거 할 수 있습니까? 2) 기술 용이성 - 수 배아 용이 적시 장치로 /에 로딩 단순히 식별 사후 온난화 추적? 3) 절차 단순 / 반복 기술자 (내부) 및 프로그램 (외부) 사이의 변화를 최소화 쉽게 반복을 허용 유리화 방법 제공 단순성과 신뢰성을 -Does? 4) LN이 저장 용량을 용이하고 안전하게 취급 식별 장치가 수 - 수? 자신의 석재입니다잠재적 인 공간을 효율적 분노? 무균 폐쇄 시스템과 같은 물리적 손상 또는 가능한 오염 물질에서 장치의 서비스 보안 및 안전합니까? 5) 복구 가능성 / 생존 결정됨 장치 배아의 보장 회복에 잠재적 인 문제가 발생하기 쉬운 디자인, 그들이 안정적 유리화하고 완전한 세포 무결성 후 온난화를 유지? 후자의 특정 품질 문제, 회복 속도는 실제로 놀라 울 게시 된 보고서에 최소화하고있다; 이것은 일반적으로 일반적으로-좋은 생존율에 불리한 결과 (즉, 손실 배아 또는 달걀을) 숨기기에 의해 이루어집니다. 일관성 복구 (<99 %)하는 경향이 모든 장치는 심각한 결함과 절차 책임을 구성한다.
우리의 무균는, μS-VTF 방법을 전략적으로 각각의 품질 관리 측정을 고려하여 개발 된 마감했다. 그러나, 우수한 임상 성공 및 유효성 검사 14 5 년 후, 절차는 t을했다오 수정을합니다. (소수성 플러그를 가진) 원래 0.3 mL의 배아 빨은 IVF 산업에서 제거하고 표준면 / PVP 플러그를 가진 0.3 mL의 정액 짚 (즉, 정액 / 배아 밀짚으로 레이블이 재 지정)로 대체되었다. 이 절차 문서는 안전하게, 간단하고 효과적으로 μS-VTF를 구현하는 데 필요한 특정 단계와 전략을 설명합니다. 대안 이상적인 짚 용기가 임상 실험에 다시 재 도입 될 때 더욱이, 우리 때까지 안정적으로 공급 제한을 고려하여 필요한 변경 (들)을 강조.
Protocol
μS-VTF 절차의 개발은 인간의 난자와 배아의 냉동 보존에 2008에서 2009 사이 (갈망 IRB, 산티, CA)에서 승인 된 임상 시험 심사위원회 (IRB) 연구의 일환으로 수행되었다. 절차는 이후 정기적으로 정보 동의서에 서명 불임 환자의 임상 치료에 적용되고있다.
1. 품질 관리 고려 사항
- 환자를 구별하기 위해 다른 색상 (예를 들면, 펜, 라벨, 또는 식별 (ID) 봉 또는 플러그)를 사용하는 경우 하루에 배아의 cryopreserving 하나 이상의 그룹.
- 각 환자에 대해 서로 다른 요리와 피펫을 사용합니다. 다른 한 용액으로부터 포배 이동시 전송 매체의 양을 최소화한다.
- 짚 또는 장치 당 하나의 배반포를 Cryopreserve. 무균 / 멸균 기술을 유지하고 모든 안전주의 사항을 준수합니다.
- 의사 '추천 양식을 확인하고 initiatin하기 전에 환자의 동의에 서명g의 절차. 재고 환자의 배아 (들)의 배치를 확인합니다.
- 포배 다른 시설로 전송 될 경우에 "운송에 대한 책임과 동의의 릴리스"를 사용합니다. 모든 서명이 현장 또는 공증 목격되어 있는지 확인합니다.
- 생물 검정, 독소의 결정 및 만기 / 로트 번호 확인 및 추적을 포함한 적절한 매체에 대한 품질 관리 방법 및 단백질 보충, 적절한를 확인합니다.
- <95 %, 생존율 : <80 %, 및 단일 euploid 배반포를 이용하여 임상 적 임신율 : <50 % 임상 냉동 보존 결과 모니터링 및 평가 등의 복구 속도와 같은 중요 제한 (관심 즉, 낮은 수준)을 설정합니다.
2. 냉동 보존 절차
- 예비
- 워크 시트에 들어가는 데이터와 냉동 보존 데이터베이스 및 재고 로그를 포함하여, 해당 서류를 완료(에스).
- 신선한 냉동 보존 솔루션을 준비 또는 상용 소스 (제조업체에서 권장하는 보관 및 저장 수명 조건 준수)를 사용합니다.
- 짚 준비.
- 개별화 된 멸균 패킷의 라벨면을 엽니 다. 포장에 대해 그것을 잡고 부분적으로 해제 및 빨대를 잡아 당겨 기존의 0.3 mL의 배아 빨대에있는 충전 노즐을 분리; 빨대가 플라스틱 패키지 내부의 무균 달려 동안이 주변 환경에 레이블 끝을 노출됩니다.
- 0.3 mL의 정액 / 배아 빨대를 들어 (수정)은, 아래로 0.5 cm를 플러그를 밀어 넣습니다. 기본 탁상 임펄스 실러의 사용을 통해면-PVP 플러그의 앞에 내부 도장을 적용합니다.
- 그냥 플러그의 앞에, 전극의 테플론 표면에 빨대를 설정합니다. 열을 활성화하기 위해 핸들을 우울. 붉은 빛이 나타날 때 핸들을 해제합니다. 온도 충분히 flatte에서 완벽한 용접 도장, 열을 보장하기 위해ns의 반대 표면은 180 ° 이상을 뒤집어 필요에 따라 반대면 (19)을 다시 봉인.
- 개별화 된 멸균 패킷의 라벨면을 엽니 다. 포장에 대해 그것을 잡고 부분적으로 해제 및 빨대를 잡아 당겨 기존의 0.3 mL의 배아 빨대에있는 충전 노즐을 분리; 빨대가 플라스틱 패키지 내부의 무균 달려 동안이 주변 환경에 레이블 끝을 노출됩니다.
- cryomarker를 사용하여 각 짚 / 장치 라벨과 환자 이름, 고유 ID 번호 (예를 들면, SSN, DOB 또는 환자의 ID 번호)와 결빙 날짜 cryogoblet. 각 짚 / 장치 (예를 들어, 1, 2, 3 등)의 고유 번호를 포함한다.
- 색상 가중 ID로드에 라벨 (바람직 컬러)를 고정 삽입 및 0.3 mL의 배아 빨대로 밀봉한다. 사용할 때까지 개별 멸균 패키지에 빨대를 돌려줍니다.
참고 : 30-mm 색 가중로드 ID가 ID로드의 각 측면에 인접하여, 두 개의 볼 베어링의 추가의 삽입이 필요하고, 가능한 경우.
- 색상 가중 ID로드에 라벨 (바람직 컬러)를 고정 삽입 및 0.3 mL의 배아 빨대로 밀봉한다. 사용할 때까지 개별 멸균 패키지에 빨대를 돌려줍니다.
- 고유 새겨진 ID 번호와 각 지팡이를 식별합니다. LN이 저장조 수 및 각 환자의 시료 (들) 일 수있는 용기의 개수를 파악논리합 장기.
- 방울 ID (그림 1A)를 들고 / 환자 이름, 솔루션 ID 및 배아와 바닥면 라벨로 신선한 냉동 요리 (100mm)를 준비합니다. 특히, 물방울의 4 행 설정 : 등장 HEPES 완충 매체 (위), V1 (평형 솔루션 (ES)), V2 (중간 솔루션 (IS)), V3 (유리화 용액 (VS) 아래). 레이블 열 상단 오른쪽에있는 배아 ID를 작성합니다.
주 : 25-에 일련의 50-μL가 (N = 3) 각각의 마지막 10- 15 μL에 방울 / 액형 유지되도록하는 데 사용되는 액 적을 세척 (즉, V1은 V2 또는 V3)를 순수 및 희석. 다섯 개인 배아까지이 방법을 사용하여 하나의 접시를 사용하여 유리화있다. 사용하지 않는 액적 중 상온 증착 / 탈수를 방지하는 경우에 적용 각 접시 유지. - 그 기단부 오프 3cm 절단하여 멸균 flexipettes 준비 ( "VTF 팁"라 함). 개인에 그들을 삽입피펫 (3 μL로 설정) 및 스티로폼 튜브 랙 (그림 1B)에 수직 피펫 - VTF 팁을 설정합니다.
- 배아 선택
- 환자 / 시료의 식별을 확인합니다.
- - (400X 배율 200) 등급과 분류 포배를 가드너 등급 시스템 (20)에 따르면, 초기 각각 부화 배반포로 6 1의 숫자 분류를 사용하고 A, B 또는 C 등급 할당 거꾸로 현미경을 사용하여 내부 세포괴 (ICM) 및 trophectoderm (TE)에.
참고 : 배반포 생검 및 euploidy 분석을위한 준비에, 투명대가 TE의 초기 탈출증을 촉진하기 위해 3 일에 레이저 어블 레이션에 의해 사전 부화하고, 따라서 수정 된 등급 분류이 필요합니다. 50 % 부화하고, 5 학년 부화 배반포가> 50 % TE의 extrusio이 - 간단히, 10 % TE 탈출증 최대 3 학년 전체 배반포 전시는, 4 학년은 배반포 10있다 확장N (그림 2A-C).
참고 : 우리의 환경 설정 (1 급 또는 2 포배에 늦게 상실 배를 포함하여 3 학년 또는 그러나 5 일 또는 6에 ≥BB 품질 높은 배반포 이전 단계에서 낮은 품질 (C) 및 사후 압축 배아의 유리화 배반포를 cryopreserve하는 것입니다 )는 확실히 완전히 그대로 온난화 생존과 출산을 달성 할 수있는 실행 가능한 배아를 얻을 수 있습니다. - 낮은 몰 농도 유리화 용액을 사용하는 경우 cryodilution 프로세스의 개시에 앞서 trophectoderm 접합 micropuncturing 의해 또는 trophectodermal 셀 (21)의 레이저 펄스의 절제를 수행하여 각각의 배반포의 blastocoele 축소 (<6.5 M 또는 40 % V / V).
참고 : 배반포를 축소 할 필요가 장치에 의존하지 않는다. μS-VTF (2008)의 우리 자신의 초기 개발에서, 우리는 처음에 에틸렌 글리콜 (EG) / 난 모세포와 성공적으로 DMSO 용액 (1 일 만삭 임신 중)를 사용하지만, 차선 (<80 %)마우스 포배 (16)의 생존 / 발전은 다른 사람 (21)에 의해 발생했다. 높은 몰 글리세롤 기반 솔루션 때문에, 물리적 blastocoele 붕괴는 불필요하다 (2009) 현재 VTF 시스템에 사용된다 (7.9 M이 초과). 그러나 부화 배반포의 선택 부화는 일반적으로 좋습니다.
- Cryodilution 포배기 배아로드
- 인큐베이터에서 환자 배양 접시를 제거하고 배아 (들) 유리화 할를 제거하기 전에 다른 사람 (즉, 보조 소스에 의해 목격) 환자 / 시료의 식별을 확인합니다.
- 실체 현미경 아래 단계 2.2.2 당 배반포 개발을 확인 크라이 데이터 시트를 업데이트하고, 크라이 요리의 등장 유지 방울로 배양 접시에서 피펫 배반포 (들).
- 유리화 flexipette (즉, VTF 팁)를 사용하여 개별 지주 방울로 각 배반포를 이동합니다.
- 이동 각V1 (ES) 용액에 배반포.
- V1 용액 (3 μL)와 flexipette를 미리 기입 및 배아에 절반 내용을 넣습니다.
- 배아를 흡인한다 (단계 2.1.6로 칭함) 세 V1 세척 액적 제 이동 배아 2 피펫 - 둘레에 3 회, 그리고 밖에 (기포 형성을 방지) 방울에 피펫 콘텐츠를 삭제하거나 접시 표면.
- 다음 V1 세척 드롭으로 VTF 팁을 입력하고 배아 (들)의 포부를 반복합니다. 세 번째를 반복하고 개별 V1 유지 하락 배반포 (들)을 이동합니다. 희석 / 세척 단계는 30 ~ 45의를해야한다. 사전로드는 다음 해결 각 VTF 팁 (예를 들어, V2)은 랙에 피펫을 삽입하고, 다음 피펫 (단계 2.1.7의 설정에 따라) (그림 1B)를 사용합니다.
주 : V1 및 V2 솔루션 함유 비 디메틸 술폭 시드 중의 전체 노출 시간 (DMSO) 이후 INDIVI의 피펫 5 분마다 인이중 배반포 균등 최종 V3 단계를 수행 배반포 당 적어도 1 분 필요합니다 점을 감안, 그 간격 내에서 시차를해야합니다. 예를 들면, 유리화 그룹 4 포배, 피펫 포배 75의 간격 # 1-2-3-4가있는 경우.
참고 : 혁신적인 알아내는 기업 (ICE) 희석 프로토콜은 위에서 설명한 일반적으로 DMSO 함유 솔루션을 포함하는 대부분의 다른 상업 유리화 절차를보다 분명히 다르다. 이러한 프로토콜 세척 용액 (즉, 등장 매체)의 병합, 점진적를 통해 같은 단계적으로 희석을 달성, 미만 제어, ES 및 VS. - 반복 V2 (IS) 솔루션을 사용하여 2.3.4와 2.3.5 단계를 반복합니다.
- 반복 2.3.4과 2.3.5 사용 V3 (VS) 솔루션 단계를 반복합니다.
- V3가 들고 방울 각 배반포를 배치하면, (액적 외부)를 VTF의 끝에서 잔류 용액 거품을 취소 한 다음 배아 주위에 깨끗한 V3 완전히 끝을 입력합니다. 특급EL 약 볼륨 (1 μL)의 1/3 완전히 VTF 팁에 포배 (들) 및 나머지 V3 피펫.
- , 피펫에서 VTF 팁을 제거 멸균 거즈 패드를 사용하여 외부 표면에 잔류 V3의 팁 건조를 닦아하고, 미리 라벨링 짚의 개방 단부에 최종 먼저 팁을 삽입합니다. A "건조 팁은"가능한 내부 짚 부착을 방지하는 것이 중요합니다.
- (라벨 아래로 종료) 빨대를 반전 내부 플러그 또는 실의 끝을 준수하고 안전하게 공기 공간의 1cm로 열린 끝을 밀봉. 바람직하게는, (예를 들어, I을 Syms)은 기술 변화를 제거 할 수 있도록 자동 밀봉 장치를 사용한다.
주 : 이오노머 수지 플라스틱으로 구성되어 빨대 사용의 장점 (예를 들어, HSV 또는 μS-VTF)는 단계 2.1.3.1에 명시된 바와 같이 소자 밀봉 임의 제대로 작동되는 열을 이용하여 신뢰성있는 "용접"밀봉을 생성하는 것이다. - 일단 밀봉하는 스테인레스에 LN 2에 직접 폐쇄 짚 급락ESS는 철강 듀어 플라스크 및 저장에 대한 환자의 지팡이에 부착 된 오픈 잔에 빨대 (들)을 배치합니다.
주 : μS-VTF 빨 공기 충진 짚의 부력을 상쇄 40 mm 가중 ID로드를 사용하기 때문에, 반전 된 받침 또는 빈 크리오 바이알 (cryovial)의 사용은 수송 관여하지 않으면 필요하지 않은 시료 (S)를 포함하는.
- 온난화 및 곳을 알아내는 - 솔루션 용출 / 희석
- 의사 '추천 유리화 배아 이식 날짜에 관한 양식, 예약 된 시간 및 배아 세부 사항 (PGS 테스트하는 경우 해동 할 수 / 전송, 특정 배아 번호 등)를 확인합니다.
- 상용 소스를 신선한 온난화 솔루션 (1.0 M 자당 원액) 및 / 준비 또는 사용 (한 번 유통 기한 1 주일 1개월 사용, 4 ℃로 보관 권장).
- 때문에 자당 이쁜에서 독소 축적의 위험에 초기 개방 (예를 들어, 주 공급원)에 따라 50 mL의 멸균 플라스크에 자당의 나누어지는 17.1 g반복 주위 노출시 nules.
- 솔루션에 미리 무게 과립 설탕을 섞는다 (1.0 M 재고 = 3.42 g / 10 ㎖의 HEPES 완충 인간 난관 유체를 [H-HTF]) 및 과립의 용해도를 증가시키기 위해 37 ° C에 솔루션을 따뜻하게. 반복 속도를 위로하고 그 최종 혼합을 완료 용기를 반전한다.
참고 : 여과 (0.22 μm의 필터) 정압 여과 장치를 사용하여 수행하는 점성 솔루션 (> 0.5 M 자당) 또는 대량 사용하는 것이 좋습니다. 손 압력 펌프 전기 펌프가 시끄러운 반면, 진동이 발생하고, 간단하게 필요하지 않습니다, 충분하고 저렴.
- 따뜻한 (37 ° C) 한 10 ML의 튜브 μS-VTF 온난화 화장실 사용을위한 환자 당 1.0 M 자당 솔루션 및 H-HTF 매체의 각.
- 환자 이름과 솔루션 ID를 가진 덮개 표면을 라벨로 신선한 해동 요리 (6 웰 플레이트)를 준비합니다.
주 :이 경우 사용한다 : (1) T1 워시 (200 μ를; 오일 오버레이없이 L 오일 오일 오일 1 mL를, (2) T1 (100 μL), (3) T2 (100 μL), (4) T3 (100 μL), (5) T4 (100 μL) 오일 오버레이없이 오일, 10 % 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 20 % 혈청 대체물로 (6) T5 / 200 μL 등장 HEPES 완충 매체. 보편적 인 자당 솔루션 스텝 다운 프로토콜-T1 = 1.0 M, T2 = 0.5 M, T3 = 0.25 M, 및 적용 T4 = 0.125 M-경우 느린 냉동 배아 (22)에 대한 제안과 ICE 또는 다른 상용 소스는 사용할 수 없습니다 . 또한, 초기 T1 세척 최종 T5의 equilibrations 30-mm 배양 접시에서 수행 될 수 있고, 4 웰 접시 오일 오버레이를 포함하는, 상기 단계 2-5에 대해 사용했다. - 한번에 한 환자의 태아 (들)을 해동.
- 의사 '추천 양식을 확인하고 표시된 번호 (예 : 1 또는 2 배반포)를 따뜻하게하기 전에주기를 확인; SHR, 즉 (삼투압 변화를 관찰함으로써 생존 / 가능한 생존 능력을 평가inkage과 수분 보충) 그대로 막하고, 의심스러운 경우, 다른 배반포를 따뜻하게하기 전에 의사 및 / 또는 환자에게 문의하십시오.
- 동료와 환자 / 시료 식별 확인 (즉, 보조 소스에 의해 목격).
- LN이 가득 듀어 플라스크에서 환자 지팡이를 놓고 따뜻하게 할 수있는 빨대를 식별 분리.
- 실체 현미경 스테이지의 중앙에 6 잘 희석 접시를 가져옵니다. 한면에 60 mm 페트리 접시를 배치하면 (즉, 왼쪽 또는 기술자의 오른쪽 선호도에 따라 다름), 가온 자당 (1.0 M)을 추가하고 H-HTF 솔루션은 0.5 M 자당 온난화를 만들 목욕 (발견).
참고 : VTF 팁은 배아가 급속한 온난화 (22)에 배출되는 드문 경우에 태아의 생존 능력의 유지를 보장하기 위해, 품질 관리 보호 0.5 M 자당 솔루션을 따뜻하게한다. - 액체 레벨 위의 상부 짚 실을 잡아신원을 확인하고 파악과 메이요 가위를 사용하여 내부 플러그 아래에 빨대를 고정합니다 (VTF 팁은 여전히 LN 2에 빠져들해야한다).
- 단단히 QC 예방 조치로 내부 짚 측벽에서 VTF 팁을 제거하기 위해 듀어 플라스크에 가위 (몇 번)을 누르십시오; VTF 팁이 부착되면, 탭핑은 팁베이스 따라서 플러그 끝 근처 에어 스페이스를 제공 한 끝 대향 밀봉 단부 떨어진다 것을 보장한다.
- (옆에있는 입체경 표면에 이하) 수평 위치에서 주변 공기에 가위로 빨대를 들어 올려 비 표지 끝 (오른쪽에 레이블을) 파악. 내부 플러그에 빨대를 잘라 또는 밀봉 온난화 목욕 접시 위에 올립니다. 완전히 압출 및 (> 6,000 ° C / 분) 급속 예열 될 때까지 60 ° 각도로 따뜻한 자당 욕조에 VTF 팁을 붓고; flexipette의 기부는 측벽 접시 위에 쉴 것이다.
- VTF의 TI 허용p는-자유 낙하 목욕으로합니다. 팁이 바로 등장하지 않는 경우 조심스럽게 위 짚 표면을 누릅니다. 그것은 단지 일부 길 나타나는 경우, 가위 또는 미세 집게로 flexipette의 샤프트를 잡고 압출에 도움이됩니다.
- 오 후 - 10 초, 피펫 기반을 잡고 일회용 피펫 팅 장치에 삽입; 전구에 구멍 삽입에 압력을 해제하는 역할을합니다. T1의 세척에 유리화 배반포를 해제 전구를 짜 부드럽게 인덱스 손가락으로 전구 구멍을 덮고 (# 1) 실체 현미경으로 보면서. 일단 확인, 음, 중심으로 내용을 대피, 긍정적 인 압력에 의해 사용되지 않는 폐기를 잔류 V3 (VS) 솔루션과 거품을 취소합니다. 5 분 타이머를 시작합니다.
참고 : 모든 자당 희석 단계가 실내 온도 (21 ± 2 ° C)에서 수행된다. - VTF 팁을 제거하고 피펫에 배치합니다. (- 4 분 약 3) 남은 시간 동안 오일에서 T1 # 2로 배아를 이동하여 진행합니다. <올>
- 단계 2.4.12를 시작하기 전에 환자에서 - 두 번째 배반포가 전송을 위해 필요한 경우, 즉시 (2.4.11 단계 2.4.9 반복) 두 번째 짚과 VTF 팁을 따뜻하게. 적어도 3 분의 T1에서 최소 용출 (1.0 M 자당) 함께 모두 배반포를 이동합니다.
- 다음 해결 방법으로 flexipette 사전 입력 한 다음 이동 3 분 간격으로 T2, T3와 T4의 배반포 (들)을 희석. pellucida 이전에 레이저 절제되지 않은 조나 (즉, 부화), T4에서 그렇게합니다. 거꾸로 현미경 및 이미지는 컴퓨터 모니터에 배아의 무대에 접시를 놓습니다. 지정된 빨간색 원 안에 조나을 맞추고 다이오드 레이저 (난황 주위 공간의 가장자리에서 시작하여 바깥쪽으로 이동)의 개구부 (2), (19)을 만들 수의 2 또는 3 충동을 활성화합니다.
- 따뜻한 표면 (37 ° C)에서 5 분 동안 T5 (즉, 등장 매체)의 포배를 평형.
- pyknotic 어둡게없는 심지어 반투명 세포질과 세포막 손상의 주된 존재에 기초하여 상기 초기 배아 생존율을 평가. 배아 이식 전에 6 시간,이 시간에, 배아 개발 / 생존이 다시 평가되고 문서화되어야한다 - 2 문화에 배아 (들)을 놓습니다.
주 : 1 개 이상의 실행 가능한 배반포는 전송시에 존재하고 환자가 단계 2.3.3 반복하여 단 1 배반포, 보조 배반포가 성공적 다시 유리화 할 수 있습니다 (rVTF)를 진행 옵트 경우 - 2.3.11입니다. 우리는 하나의 rVTF 이벤트 다음과 같은 몇 가지 확인 출산 있습니다.
참고 rVTF 실험적 준 안정 글리세롤 계 용액 유리화 이수성 인간 배반포의 생존 / 생존에 중요한 영향없이 5 회까지 수행되었다.
Representative Results
1316는 (98.1 %)을 살아있는 동안 1341 유리화 배반포 6 월 2014 2012 사이 따뜻하게하고, 1341 배아는 (100 %)를 회수 하였다. 생검 배반포는 99.5 %의 생존율을 통해 경험했다. 주로 단일 유전자 테스트, euploid, 유리화 배아를 전송하면, 우리는 센터에 의해보고 된 최근 국가 통계에 따르면, (그림 3) (20) 최고 주입 속도와 미국에서 출산 비율, 나이 무관의 일부를 달성 할 수 있었다 질병 통제 및 보조 생식 기술에 대한 사회 (표 1 및 표 2)에 대한. 혼자 냉동 보관주기 (표 1)에 대한 (이하 35 세) 좋은 예후 환자 인구를 평가, 우리 연구소는 모두 주입 속도 (즉, 배아의 효율이 임신을 확립하기 위해)에 대한 전국 평균을 상회하고 궁극적으로 출산율 살 이상 30 %. 또한, 70 연구 합의 된, 다시 유리화 이수성 배반포를 사용 중반 2014 년 우리의 수정 저장 빨대의 초기 유효성 검사 / 검증 100 % 복구 및 100 % 생존의 결과.
1. MicroSecure VTF 설정 그림. VTF 접시 (A)의 고유 번호가 매겨지지 방울 배치 전에 세척 3 방울을 이용 유리화 용액의 3 행 별개로 조립된다. 또한, 단축 VTF 팁 (즉, 300 μm의 아이디 flexipettes) 개별 피펫을 확보하고 질서있는 사용을 위해 회전 할 수 스티로폼 튜브 랙 (B)로 구성됩니다. 대표 일회용 마이크로 피펫 전구 피펫 어셈블리는 스티로폼 선반에 놓여 있습니다. arget = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 포배 등급 시스템을 수정. 변형 된 가드너 배반포 등급 시스템은 배반포 생검을 용이하게 TE 셀의 유도 탈출증 차지한다. 해칭 배반포 (C)이 50 % 이상 탈출증을 가지고있는 동안, (4 학년 = 최대 탈출증 50 % B) : (3 학년 = 10 % 미만 탈출증 A)와 확장 된 배반포 수정 전체 배반포의 조기 부화를 고려 16. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
54871fig3.jpg "/>
3. 비교 임신 결과를 그림. 누적 1.5 년 간격 임신 데이터 유리화 예열 euploid 포배 전사의 효과를 평가하기 위해 비교 하였다 비 PGS 사이클 비교 (N = 172 사이클 / 144 전송) 주로 신선한 관련된 (N = 160 사이클 / 153 전송) (18)를 전송합니다. 우리의 실험을 위해,이 데이터는 명확 μS-VTF 절차에 의해 유리화 된 생체 검사 포배 그들의 생존을 유지하는 것을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 데이터 소스 | # 사이클 | 전송 된 배아의 # 평균 | 주입 요금 (%) | 라이브 출생 요금 (%) |
| NB 연구소 * | (14)4 | 1.2 | 74.00 % | 74.50 % |
| 전국 평균 | 20423 | 1.7 | 39.60 % | 44.10 % |
| * 데이터는 오렌지 카운티 불임, 남부 캘리포니아 불임 센터와 2008 년 microSecure 유리화 과정을 설립 현재의 박수 불임 연구소 (NB 연구소)를 사용하여 생식 의학 클리닉의 남부 캘리포니아 센터의 2014 년 실적을 기준으로 평균되었다. | ||||
표 1. 2014 CDC는 생식 통계를 보조. 세 35 세 미만 여성의 냉동 배아 전송 임신 데이터는 450보고 클리닉의 미국 2013 전국 평균에 비해 우리의 NB 랩을 사용하여 의사의 진료를보고.
| SART 국가 평균 | ||||
| 클리닉 - 주 | 여자들 | 여자들 | 여자들 | 여자들 |
| <35 세 | 35-37 세 | 38 ~ 40 세 | 41 ~ 42 세 | |
| SCCRM-CA * | 63.1 % | 58.3 % | 40.6 % | 32.3 % |
| CCRM-CO * | 64.7 % | 61.5 % | 40.4 % | 32.2 % |
| RMA-NJ * | 63.2 % | 59.7 % | 34.6 % | 18.7 % |
| 전국 평균 | 48.6 % | 38.3 % | 24.3 % | 12.3 % |
| 생식 의학 SCCRM - 남부 캘리포니아 센터; 생식 의학에 대한 CCRM - 콜로라도 센터; 및 RMA-Reproductive 의학 동료 | ||||
| *이 최고의 병원은 모든 주로 이식 배아 당 출산 성공을 최적화하기 위해 환자 치료의 자신의 표준 관행으로, 착상 전 유전자 검사와 관련하여, 유리화 배아 이식주기를 구현했습니다. | ||||
표 2. 2014 누적 라이브 출산율, 여러 가지 다른 존경받는 프로그램뿐만 아니라 SART와 대조 뉴 포트 비치, CA, 우리의 박수 불임 연구소를 사용하여 SCCRM 클리닉에 대한 보조 생식 기술 학회 (SART)에 의해보고 된 국가 평균.
Discussion
오늘날 완전히 배반포 생존율 (> 95 %) 달성 신선한 배아 유사한 이식 성공을 달성 높은 기대가있다. 일부 그룹은 유리화 배아 전송 사이클의 출산 비율이 그대로 동결 보존 배아 건강 비 호르몬 자극 자궁에 이식되어 신선한 포배보다 아마도 더 높은 것을 제안했다. 우리의 데이터는 명확 유리화 효과적이고 안정적으로 신선한 배아의 생존을 유지하고 있음을 나타냅니다. 또한, 우리는 MicroSecure 유리화 (μS-VTF)라는 우리의 무균, 폐쇄 방법은, 상기 IVF 산업에서 사용되는 상용 표준 (즉, 개방 장치 시스템)보다 비슷하거나 더 최적의 결과를 달성 할 수 있음을 입증했다.
변화는 유리화 장치 / 방법의 다수를 사용 개인간 기술 재현성 및 신뢰성과 관련된다. 차례로, 이것은 inconsi 가져왔다유리화을 적용 프로그램 사이 stencies. 따라서, 장치 친숙 실험실 능력 성공적인 결과에 관한 중요한 요소이다 것은 놀라운 일이 아니다. 이 프로그램 간의 반복성이 문제가 될 수 있습니다 이유를 설명 "기술 서명"11이 개념이다. 뿐만 아니라 상업 장치가이 현상을 복잡 이상 다스의 개발이, 그것은 품질 관리 문제를 만들었습니다. 다행히 μS-VTF, 빠른-I와 같은 유리화 시스템을 폐쇄하고, VitriSafe, 지금 장치 시스템 12, 13, 14을 열 동등하게 효과적인 것으로 증명된다.
MicroSecure VTF 염두에 기술 용이성, 안정성 및 극저온 보안 개발 한 소설, 무균 유리화 기술이다. 두 이전에 승인 FDA 호환 장치의 사용을 조합함으로써, 비상업적 유리화 시스템 w는특수한 장치 달리 설정된 낮은 비용을 갖는 별개의 장점 번째. 또한, 독특한 조작 방지 및 내면화 이중 색상 라벨링 시스템뿐만 아니라 수많은 다른 품질 관리의 장점은 만든 μS-VTF 매력적인 글로벌 옵션 11. 비상업적 VTF 장치로서, 그러나, 널리 산업 응용 서서히 발전하고있다. 단지 그것의 안전, 보안 및 임상 효과의 지속적인 발간을 통해 활용도를 μS-VTF 이득 성장합니다.
2014 년 8 월, 때 내부, 비 심지 소수성 플러그 제조 원래 0.3 mL의 배아 빨대를 획득 할 수 없다는 직면, 우리는 확실하게 μS-VTF 방법을 수정 할 수 있었다. 즉, 자신의 솜 PVP 플러그와 함께 새로운 0.3 mL의 정액 / 배아 빨 효과적으로 적응했다. 이것은 단순히 따라서,면 플러그하기 전에 내부 실을 만드는 접촉을 방지하고 유체가에 심지에 의해 달성되었다개방형 VTF 팁 (즉, 배아 또는 계란을 포함하는 flexipette). 40 mm의 ID 봉 액세스 할 수없는 경우 또한, 라이터 30 mm로드와 연관된 부력 문제는 두 개의 볼 베어링을 사용 counterweighted 수있다.
이러한 추가 단계는 여전히 매우 효과적인 기술이 약간 덜 간단하게 만들었지 만했다. 자신의 euploidy 상태는 유전학 보고서를 확인할 때까지 생체 검사 배반포는 일반적으로 개별적으로 유리화되는 오늘날, 경제 및 효능은 점점 더 중요한 문제가되고있다. 확인 된 비 가능한 이수성 상태 배반포는 일반적으로 주 이내에 환자의 동의를 폐기하자. 따라서 VTF 장치의 대부분 (> 50 %)의 상업적 장비를 사용할 때 확대 연간 비용을 초래 단기 보관 후 폐기된다. 전반적으로, μS-VTF 인간 배반포의 냉동 보존을위한 매우 효과적인 신뢰성과 반복 과정이다. 우수한 품질 관리 설계 SECUREL복구 실패를 제거하고 배아의 유리화에 대한 보편적 인 접근 방식으로 시스템의 사용을 정당화 후 온난화의 생존과 생존을 최적화하면서 안전하게 Y 라벨 및 배아 / 난 모세포를 저장합니다.
Disclosures
MC Schiewe 혁신적인 알아내는 기업에 과학 자문위원회의 구성원으로하고 캘리포니아 Cryobank에 기술 이사 역할을합니다. 이 비디오 문서의 생산은 박수 불임에 의해 지불되었습니다. 저자는 배우자와 배아의 유리화에 대한 공개에는 경쟁 금융 계약 또는 이해 관계의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
MC Schiewe 분석하고 연간 CDC와 SART 데이터를 평가하는 자신의 통계 전문 지식 라스 베이거스의 불임 센터에서 씨 숲 가너에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한, 저자는 우리의 기술 능력과 전문 지식을 자신의 헌신적 인 지원과 믿음에 대한 자신의 의료 감독, 로버트 E. 앤더슨, 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Cane | IVM | XC055 | |
| Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel |
| CBS semen/embryo straw, 0.3 mL | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile |
| Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted |
| Culture tubes, 15 mL | Falcon | 352099 | Conical |
| Culture tubes, 10 mL | Falcon | 352057 | Snap-cap |
| Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | |
| Filter, 250 mL | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm |
| Flasks, Tissue Culture 50 mL | Falcon | 353014 | |
| Flexipettes, 300 μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack |
| Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | |
| Forcep, Splinter - fine | Miltex | 17-305 | |
| Goblet | IVM | PA003 | |
| Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110 V or 220 V with adapter |
| Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100 mL, or | stored at 2 - 8 ºC |
| Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100 mL | with non-essential AA's | |
| Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors |
| Liquid Nitrogen Tank, 40 L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage |
| LN2; Dewar flask, 0.5 L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel |
| 6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case |
| Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex |
| Petri Dishes, 35 mm | Falcon | 351006 | |
| Petri Dishes, 58 mm | Nunc | 150288 | |
| Petri Dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10 - 100 μL |
| Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable |
| Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| Pipettes, Serological 1 mL | Falcon | 357521 | |
| Pipettes, Serological 2 mL | Falcon | 357507 | |
| Pipettes, Serological 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Pipettes, Serological 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | |
| Sterile Gauze pads, 4" x 4" | Kendall Healthcare | 6939 | |
| Synthetic serum | Life Global, or | LGPS-20; 20 mL, or | stored at 2 - 8 ºC |
| Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10 mL | purchase low endotoxin lot | |
| Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50 mL flasks, 1 year; 17.1 g/flask + Medium to 50 mL; makes a 1 M solution; Filter with 0.22 µm unit |
| Timer | Nalgene | 5016-001 | |
| Thawing Solution | Innovative Cryo Enterprises | BL-TS (≤1.0 M Sucrose) | T1, T2, T3, T4; tored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening |
| Vitrification Solution*,** | Innovative Cryo Enterprises | BL-VS (≥7.9 M [Glycerol/EG]) | V1, V2, V3; stored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening |
| * Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | |||
| ** Other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8 M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2 M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. | |||
References
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