Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

संशोधित MicroSecure कांच में रूपांतर: एक सुरक्षित, सरल और अत्यधिक मानव ब्लास्टोसिस्ट के लिए प्रभावी Cryopreservation प्रक्रिया

Published: March 2, 2017 doi: 10.3791/54871
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Ovation Fertility

Abstract

नैदानिक भ्रूण कांच में रूपांतर 21 वीं सदी में और गलत धारणा के साथ अद्वितीय कांच में रूपांतर उपकरणों है कि एक "खुली" प्रणाली (यानी, प्रत्यक्ष एल.एन. 2 संपर्क) में अल्ट्रा तेजी से ठंडा कांच में रूपांतर सफलता अनुकूलन करने के लिए एक आवश्यकता थी के विकास के साथ विकसित हुआ। ठंडा दरों के महत्व आसपास हठधर्मिता तकनीकी बदलाव के लिए और कांच में रूपांतर उपकरणों के निर्माण के लिए विषय असुरक्षित प्रथाओं कि महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण कारकों (जैसे, इस्तेमाल में आसानी, repeatability, विश्वसनीयता, लेबलिंग सुरक्षा, और जगह सुरक्षित) की अवहेलना करने के लिए नेतृत्व किया। अन्य उपकरणों के लिए एक सुरक्षित, repeatable, विश्वसनीय और μS-VTF अंतर और अंतर-तकनीशियन भिन्नता को कम करने के उद्देश्य से विधि के विकास के लिए अनुमति की गुणवत्ता नियंत्रण खामियों को समझना। 1) एक 0.3 एमएल भाँति, दोहरी रंग, छेड़छाड़ पी के साथ ionomeric राल भ्रूण भूसे: समान रूप से महत्वपूर्ण है, यह दो मौजूदा एफडीए अनुरूप उपकरणों की उपलब्धता संयुक्तrepeatable वेल्ड मुहर क्षमता के साथ छत लेबलिंग; और 2) छोटा, सामान्य रूप से प्रयुक्त, 300 माइक्रोन आईडी बाँझ flexipettes सीधे आदेश में एक अत्यधिक प्रभावी वैश्विक कांच में रूपांतर डिवाइस बनाने के लिए भ्रूण (s) लोड करने के लिए। अन्य मम्मियाँ की तरह, बंद कर दिया कांच में रूपांतर सिस्टम (जैसे, उच्च सुरक्षा कांच में रूपांतर (एचएसवी), रैपिड-मैं, और VitriSafe) को प्रभावी ढंग से प्रजनन चिकित्सा में इस्तेमाल किया, microSecure कांच में रूपांतर (μS-VTF) सिद्ध किया है कि यह उच्च पद वार्मिंग अस्तित्व और गर्भावस्था को प्राप्त कर सकते हैं सादगी पर अपना ध्यान, और कम तकनीकी बदलाव के साथ परिणाम। हालांकि 0.3 एमएल भ्रूण एक आंतरिक हाइड्रोफोबिक प्लग युक्त भूसे व्यावसायिक रूप से एक मानक वीर्य पुआल रखने कपास polyvinyl pyrrolidone (पीवीपी) प्लग के साथ बदल दिया गया था, यह वेल्ड सील सुनिश्चित करने के लिए अपनी ionomeric राल संरचना को बनाए रखा। हालांकि, कपास प्लग संपर्क पर flexipettes के तरल पदार्थ से भ्रूण सामग्री बाहर बाती कर सकते हैं। एक संशोधित μS-VTF विधि एक अतिरिक्त आंतरिक वेल्ड शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया थाडिवाइस लोड हो रहा तरफ प्लग से पहले सील। μS-VTF प्रक्रिया को जोड़ा तकनीकी कदम इसके सफल आवेदन, के रूप में उच्च जीवित रहने की दर (> 95%) प्रभावित नहीं किया है और गर्भावस्था दरें आज जारी है।

Introduction

कांच में रूपांतर एक सबसे प्रभावी सहायता प्रदान की प्रजनन इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आईवीएफ) उद्योग में शुक्राणु इंजेक्शन के विकास के बाद से तकनीक है। आज, ब्लास्टोसिस्ट्स पहले पारंपरिक धीमी गति से ठंड तरीकों 1 के साथ जुड़े भ्रूण व्यवहार्यता में बिना किसी नुकसान के cryopreserved हैं। विश्वसनीय के बाद वार्मिंग भ्रूण अस्तित्व के साथ, बांझपन उद्योग cryopreserved भ्रूण स्थानांतरण चक्र है, जो पारंपरिक ताजा भ्रूण हस्तांतरण की तुलना में समान या उच्च गर्भावस्था के परिणामों उपज के पसंदीदा उपयोग में बदल रहा है। ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी और आनुवांशिक स्क्रीनिंग (पीजीएस) के सहयोग से, कांच में रूपांतर euploid एकल भ्रूण हस्तांतरण 2, 3 के माध्यम से स्वस्थ जीवित जन्म परिणामों का अनुकूलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण नैदानिक उपकरण बन गया है।

Murine भ्रूण कांच में रूपांतर 1980 के मध्य 4 में विकसित किया गया था, 5 और 1990 के 6 से पशु कृषि के लिए अनुकूलित। आधार यह है कि कांच में रूपांतर समाधान एक metastable glasseous राज्य, बर्फ क्रिस्टल के गठन को नुकसान पहुँचाए की नि: शुल्क फार्म के आधार पर यह और अधिक कुशलता से भ्रूण की पूरी सेलुलर अखंडता की रक्षा करने के लिए साबित कर दी है। दिलचस्प बात यह है मानव भ्रूण में कांच में रूपांतर के होनहार स्वीकृति 21 वीं सदी तक महसूस किया जा करने के लिए शुरू नहीं किया था। प्रारंभिक कांच में रूपांतर के उपयोग को बढ़ावा देने के प्रकाशनों अद्वितीय "खुले" प्रणाली उपकरणों 7, 8, 9 के विकास के साथ हुई। हालांकि, नैदानिक ​​व्यवहार में कांच में रूपांतर के गोद लेने, धीमी थी क्योंकि यह एक समय में आया है जब धीमी ब्लास्टोसिस्ट ठंड में सुधार भी होने वाली थे। सफल पारंपरिक धीमी गति से दर ठंड, कांच में रूपांतर के अलावा, भ्रूण संस्कृति प्रणाली में सुधार के साथ गठबंधन किया गया है और साथ ही साथ incorporatblastocoele-टूट दृष्टिकोण के आयन, जो ट्रोफेक्टोडर्म के दोनों समग्र अस्तित्व बढ़ाया और बाद में, आरोपण 10।

पिछले दशक में, कांच में रूपांतर प्रौद्योगिकी तेजी से पारंपरिक प्रथाओं ठंड supplanted गया है। एक हद तक, यह विशिष्ट कांच में रूपांतर उपकरणों के विकास की वजह से था। इन उपकरणों में से कुछ आईवीएफ उद्योग 11 में इस्तेमाल उपकरणों के लिए निहित डिजाइन दोषों को शुरू करने से समग्र सुरक्षा, दक्षता और नैदानिक कांच में रूपांतर की प्रभावशीलता विकलांग है। दरअसल, विभिन्न उपकरणों की बारीकियों कार्यक्रमों के बीच महत्वपूर्ण तकनीकी बदलाव, सामान्यतः "तकनीकी हस्ताक्षर" 12 के लिए भेजा परिचय। इस प्रकार, वैज्ञानिक पत्रिकाओं, कल्पना प्रयोगों के जर्नल (जौव) की तरह, तकनीकी जानकारी है, जो परिणाम भिन्नता को कम करने में मदद मिलेगी के प्रदर्शन के लिए एक मूल्यवान संसाधन के रूप में सेवा कर सकते हैं। एक अन्य समस्या चल रही है कि s हैome embryologists, गलत कह जा करने के लिए आज भी, दावों पर आधारित है कि "अल्ट्रा तेजी से एक 'खुला कांच में रूपांतर प्रणाली' में भ्रूण या oocytes की शीतलन (यानी, तरल नाइट्रोजन (एल.एन. 2) के साथ सीधे संपर्क भ्रूण) के अनुकूलन के लिए एक शर्त है जारी सफलता दर। " जाहिर है, यह धारणा गलत है, मम्मियाँ के सिद्ध सफलता के आधार पर बंद सिस्टम 13, 14, 15 है।

कांच में रूपांतर के cryobiological सिद्धांतों के आधार पर, कांच में रूपांतर की प्रभावकारिता अधिक उच्च दरों में 16, 17, 18 को ठंडा करने पर की तुलना में वार्मिंग दरों पर निर्भर है। सामान्य तौर पर, कांच में रूपांतर प्रयुक्त उपकरण के स्वतंत्र, वार्मिंग दर ठंडा दर उच्च जीवित रहने की दरों बीमा के लिए अधिक होना चाहिए। उच्च वार्मिंग दरों किसी भी बर्फ विकास (यानी, recr के लिए अवसर कम से कमवार्मिंग की विकांचीकरण चरण के दौरान क्रायो समाधान में केन्द्रक दोष) के ystallization। दी, कांच में रूपांतर समाधान (यानी, प्रकार और cryoprotective इस्तेमाल किया एजेंटों की एकाग्रता) की स्थिरता एक confounding प्रभाव हो सकता है, लेकिन यह एक अलग प्रकाशन 11 में संबोधित किया है। ठंडा-वार्मिंग दर मुद्दों को ध्यान में रखते, MicroSecure कांच में रूपांतर (μS-VTF) एक सस्ती, गैर वाणिज्यिक, एफडीए अनुरूप तरीका है कि कांच में रूपांतर की गुणवत्ता नियंत्रण पहलुओं अनुकूलित के रूप में 2008 में विकसित किया गया था। यह है कि यह छेड़छाड़ के सबूत, भाँति, दोहरी रंग लेबलिंग की पेशकश की अद्वितीय था। इसके अलावा, लदान और सीधे भ्रूण के भंडारण बाँझ pipetting के लिए इस्तेमाल किया flexipette में (यानी, एक माध्यमिक डिवाइस की सतह के लिए pipetting के बिना) द्वारा और एक स्वचालित मुहर का उपयोग कर पूरी तरह से सील वेल्ड, तकनीकी बदलाव को प्रभावी ढंग से समाप्त कर दिया गया है कि ionomeric राल तिनके का उपयोग करके।

जब आकलन ग1) लेबल संभावित -Can लेबलों सुरक्षित रूप से पालन किया: संभावित उपयोग के लिए कांच में रूपांतर उपकरणों की ompleteness, वहाँ कई गुणवत्ता नियंत्रण कारक है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए, सहित रहे हैं? वे tamperproof रहे हैं? वे दोहरे रंग पहचान संभावित प्रदान करते हैं? यह एक माध्यमिक लेबल की आवश्यकता है, और लेबल आसानी से रिकॉर्ड रखने प्रयोजनों (यानी, रोगी सत्यापन) के बाद वार्मिंग के लिए हटाया जा सकता है? 2) तकनीकी आसानी -Can भ्रूण आसानी से एक समय पर ढंग से डिवाइस पर / में लोड किया और बस की पहचान की और बाद वार्मिंग पर नज़र रखी? 3) प्रक्रियात्मक सादगी / Repeatability कांच में रूपांतर विधि की पेशकश सादगी और विश्वसनीयता है कि आसानी से repeatability के लिए अनुमति देता है, जो तकनीशियनों (आंतरिक) और कार्यक्रमों (बाह्य) के बीच भिन्नता को कम करता है -Does? 4) एल.एन. 2 भंडारण क्षमता आसानी से और सुरक्षित रूप से संभाला और पहचान -Can उपकरणों जा सकता है? उनकी एसटू हैसंभावित अंतरिक्ष क्रोध कुशल? डिवाइस की पेशकश सुरक्षा और शारीरिक क्षति या एक मम्मियाँ बंद व्यवस्था के रूप में संभव contaminants से सुरक्षा करता है? 5) वसूली संभावित / Survivability -Is डिवाइस डिजाइन भ्रूण की गारंटी वसूली में संभावित समस्याओं से ग्रस्त है, और वे मज़बूती vitrify और पूर्ण सेलुलर अखंडता के बाद वार्मिंग बनाए रखना होगा? बाद के विशिष्ट गुणवत्ता चिंता का विषय है, वसूली दर, वास्तव में आश्चर्यजनक रूप से प्रकाशित रिपोर्ट में कम से कम किया गया है; यह आम तौर पर आम तौर पर अच्छा-जीवित रहने की दरों में प्रतिकूल परिणाम (यानी, खो भ्रूण या अंडा) छुपा कर किया जाता है। किसी भी डिवाइस असंगत वसूली (<99%) होने का खतरा गंभीरता से त्रुटिपूर्ण है और एक प्रक्रियात्मक दायित्व का गठन किया।

हमारे मम्मियाँ, बंद μS-VTF विधि रणनीतिक प्रत्येक गुणवत्ता नियंत्रण के उपाय के लिए खाते में करने के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, बेहतर नैदानिक सफलता और मान्यता 14 के 5 साल के बाद, प्रक्रिया टी थाओ संशोधित किया जाना है। मूल 0.3 एमएल भ्रूण तिनके (एक हाइड्रोफोबिक प्लग रखने) आईवीएफ उद्योग से हटा दिया है और एक 0.3 एमएल वीर्य भूसे एक मानक कपास / पीवीपी प्लग रखने (यानी, एक वीर्य / भ्रूण भूसे के रूप में relabeled) के साथ बदल दिया गया था। इस प्रक्रिया संबंधी कागज विशेष कदम और μS-VTF को लागू करने के लिए सुरक्षित रूप से, बस, और प्रभावी ढंग जरूरत रणनीतियों की रूपरेखा। इसके अलावा, हम संशोधन (ओं) मज़बूती से आपूर्ति सीमाओं के लिए खाते में करने की जरूरत है, ऐसे समय जब तक के रूप में एक विकल्प के आदर्श भूसे कंटेनर वापस नैदानिक ​​प्रयोगशाला में पुनः शुरू कर रहा है पर प्रकाश डाला।

Protocol

μS-VTF प्रक्रिया के विकास के लिए मानव oocyte और भ्रूण cryopreservation पर 2008-2009 (अस्पायर आईआरबी, Santee, सीए) में एक अनुमोदित संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) के एक अध्ययन के हिस्से के रूप में आयोजित किया गया। प्रक्रिया के बाद नियमित रूप से बांझपन मरीजों की चिकित्सीय उपचार जो सूचित सहमति रूपों पर हस्ताक्षर किए हैं करने के लिए लागू किया गया है।

1. गुणवत्ता नियंत्रण संबंधी बातें

  1. रोगियों को अलग करने के लिए अलग अलग रंग (जैसे, कलम, लेबल, या पहचान (आईडी) छड़ या प्लग) का प्रयोग करें अगर cryopreserving एक दिन में भ्रूण के एक से अधिक समूह।
  2. प्रत्येक रोगी के लिए अलग अलग व्यंजन और pipettes का प्रयोग करें। स्थानांतरित कर दिया जब दूसरे के लिए एक समाधान से ब्लास्टोसिस्ट्स चलती माध्यम की मात्रा को कम।
  3. पुआल या डिवाइस प्रति एक ब्लास्टोसिस्ट cryopreserve। मम्मियाँ / बाँझ तकनीक बनाए रखें और सभी सुरक्षा सावधानियों का पालन करें।
  4. 'फिजिशियंस रेफरल फार्म की पुष्टि करें और initiatin से पहले मरीज की सहमति पर हस्ताक्षर किएजी प्रक्रियाओं। सूची में मरीजों के भ्रूण (एस) के स्वभाव की जाँच करें।
  5. एक "दायित्व और सहमति के लिए परिवहन की रिलीज" का प्रयोग करें अगर blastocysts एक और सुविधा के लिए स्थानांतरित किया जाना है। सुनिश्चित करें कि सभी हस्ताक्षर ऑनसाइट या नोटरी के गवाह रहे हैं।
  6. के रूप में उपयुक्त माध्यम के लिए उचित गुणवत्ता नियंत्रण उपायों और प्रोटीन की खुराक, bioassays, endotoxin निर्धारण, और समाप्ति / बहुत संख्या सत्यापन और ट्रैकिंग सहित पुष्टि करें।
  7. <95%, जीवित रहने की दरों: <80%, और एकल euploid ब्लास्टोसिस्ट का उपयोग कर नैदानिक गर्भावस्था दर: <50% इस तरह की वसूली की दरों के रूप में नैदानिक cryopreservation परिणाम निगरानी और मूल्यांकन, के लिए महत्वपूर्ण सीमा (यानी, चिंता के निम्न स्तर) स्थापित करना।

2. Cryopreservation प्रक्रिया

  1. तैयारी
    1. उचित कागजी कार्रवाई पूरी, कार्यपत्रक में प्रवेश डेटा और cryopreservation डेटाबेस और सूची लॉग सहित(एस)।
    2. ताजा cryopreservation समाधान तैयार है या एक वाणिज्यिक स्रोत (निर्माता की सिफारिश की भंडारण और शेल्फ जीवन की स्थितियों से बंधे) का उपयोग करें।
    3. स्ट्रॉ तैयारी।
      1. व्यक्तिगत बाँझ पैकेट की लेबलिंग पक्ष खोलें। पैकेजिंग के खिलाफ यह लोभी और आंशिक रूप से उठाने और पुआल बाहर खींच कर भरने नोक पारंपरिक 0.3 एमएल भ्रूण पुआल पर पाया अलग करें; जबकि भूसे प्लास्टिक पैकेज के अंदर aseptically टिकी हुई इस परिवेश की स्थिति के लिए लेबल अंत का खुलासा होगा।
        1. (संशोधन) 0.3 एमएल वीर्य / भ्रूण तिनके के लिए, प्लग नीचे 0.5 सेमी धक्का। एक बुनियादी टेबलटॉप आवेग मुहर के उपयोग के माध्यम से कपास पीवीपी प्लग के सामने एक आंतरिक मुहर लागू करें।
        2. इलेक्ट्रोड की Teflon सतह पर पुआल सेट, बस प्लग के सामने। गर्मी सक्रिय करने के लिए संभाल दबाना। संभाल रिलीज जब लाल बत्ती दिखाई देता है। एक पूरा वेल्ड सील, एक तापमान है कि पर्याप्त flatte पर गर्मी सुनिश्चित करने के लिएएनएस का विरोध सतहों, तो यह 180 डिग्री फ्लिप और जरूरत के रूप में विपरीत सतह 19 reseal।
    4. एक cryomarker का उपयोग करना, प्रत्येक पुआल / डिवाइस लेबल और रोगी का नाम, एक अद्वितीय पहचान संख्या (जैसे, एसएसएन, जन्म तिथि, या रोगी आईडी नंबर), और ठंड की तारीख के साथ cryogoblet। इसके अलावा प्रत्येक पुआल / डिवाइस (जैसे, 1, 2, 3, आदि) पर एक अद्वितीय संख्या में शामिल हैं।
      1. एक रंग भारित आईडी रॉड पर लेबल (अधिमानतः रंग) को सुरक्षित डाला जाता है और एक 0.3 एमएल भ्रूण भूसे में सील किया जाना है। उपयोग करें जब तक अपने व्यक्तिगत बाँझ पैकेज के लिए पुआल लौटें।
        नोट: यदि केवल 30 मिमी रंग भारित आईडी छड़, उपलब्ध तो दो बॉल बेयरिंग की अतिरिक्त प्रविष्टि की जरूरत है, आईडी रॉड के प्रत्येक पक्ष से सटे हैं।
    5. एक अनूठा उत्कीर्ण आईडी नंबर के साथ प्रत्येक गन्ना पहचानें। एक एल.एन. 2 भंडारण टैंक संख्या और एक कनस्तर संख्या जहां प्रत्येक रोगी के नमूना (एस) सेंट हो सकता पहचानेंored लंबी अवधि।
    6. ताजा क्रायो व्यंजन (100 मिमी) रोगी का नाम, समाधान आईडी, और भ्रूण के साथ नीचे की सतह लेबलिंग / जोत छोटी बूंद आईडी (चित्रा 1 ए) द्वारा तैयार करें। विशेष रूप से, बूंदों की 4 पंक्तियों की स्थापना: isotonic HEPES बफर मध्यम (ऊपर), V1 (संतुलन समाधान (ते)), V2 (मध्यवर्ती समाधान (है)), वी 3 (कांच में रूपांतर समाधान (वी एस); नीचे)। लेबल कॉलम के साथ ऊपरी दाहिने तरफ भ्रूण आईडी लिखें।
      नोट: 25 की एक श्रृंखला 50 μL धोने बूंदों (एन = 3) सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक व्यक्ति के अंतिम 10 15 μL को पकड़े हुए छोटी बूंद / समाधान प्रकार प्रयोग किया जाता है (यानी, V1, V2, या वी 3) शुद्ध है और undiluted। पांच व्यक्ति भ्रूण अप करने के लिए, इस दृष्टिकोण का उपयोग एक ही पकवान का उपयोग कर vitrified कर सकते हैं। कवर जब उपयोग में नहीं है किसी भी कमरे के तापमान वाष्पीकरण / बूंदों के निर्जलीकरण से बचने के लिए प्रत्येक पकवान रखें।
    7. उनके आधार अंत बंद 3 सेमी काटने से बाँझ flexipettes तैयार ( "के रूप में VTF युक्तियाँ" कहा जाता है)। उन्हें व्यक्तिगत पर डालेंpipettes (3 μL पर सेट) और एक स्टायरोफोम ट्यूब रैक (चित्रा 1 बी) में ईमानदार पिपेट-VTF सुझावों का निर्धारित किया है।
  2. भ्रूण चयन
    1. रोगी / नमूना पहचान की पुष्टि करें।
    2. (- 400X बढ़ाई 200) ग्रेड गार्डनर ग्रेडिंग प्रणाली 20 के अनुसार, और वर्गीकृत ब्लास्टोसिस्ट्स, जल्दी रची ब्लास्टोसिस्ट्स क्रमश के लिए 6 से 1 के एक अंकीय वर्गीकरण का उपयोग कर, और एक ए, बी, या सी ग्रेड सौंपा एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करना आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) और ट्रोफेक्टोडर्म (ते) के लिए।
      नोट: ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी और euploidy विश्लेषण के लिए तैयार करने में, Zona pellucida दिन 3 पर लेजर पृथक से पूर्व रची ते के शुरुआती हर्नियेशन को बढ़ावा देना है और इस तरह एक संशोधित ग्रेडिंग वर्गीकरण 2 की आवश्यकता है। संक्षेप में, 10% ते हर्नियेशन अप करने के लिए 3 ग्रेड पूर्ण ब्लास्टोसिस्ट्स प्रदर्शन, ग्रेड 4 का विस्तार ब्लास्टोसिस्ट 10 हैं - 50% रची, और ग्रेड 5 अंडे सेने ब्लास्टोसिस्ट्स> 50% ते extrusio हैn (चित्रा 2A सी)।
      नोट: हमारी पसंद (ग्रेड 1 या 2 ब्लास्टोसिस्ट के लिए देर morula सहित ग्रेड 3 या 5 दिन या 6 पर ≥BB गुणवत्ता के उच्च ब्लास्टोसिस्ट्स हालांकि, कम गुणवत्ता (सी) और पहले चरण में पोस्ट-संघनन भ्रूण के vitrified ब्लास्टोसिस्ट्स cryopreserve करने के लिए है ) निश्चित रूप से पूरी तरह से बरकरार वार्मिंग जीवित है और व्यवहार्य जीवित जन्मों प्राप्त करने में सक्षम भ्रूण उपज कर सकते हैं।
    3. एक ट्रोफेक्टोडर्म जंक्शन micropuncturing द्वारा cryodilution प्रक्रिया के शुरू होने से पहले या एक trophectodermal सेल 21 के एक लेजर पल्स पृथक प्रदर्शन से प्रत्येक ब्लास्टोसिस्ट की blastocoele को संकुचित करता है, तो कम-molarity कांच में रूपांतर समाधान का उपयोग (<6.5 मीटर या 40% वी / वी)।
      नोट: ब्लास्टोसिस्ट्स पतन के लिए की जरूरत डिवाइस निर्भर नहीं है। μS-VTF (2008) के अपने खुद के प्रारंभिक विकास में, हम शुरू में एथिलीन ग्लाइकोल (ईजी) / oocytes साथ DMSO समाधान सफलतापूर्वक (1 पूर्ण अवधि के गर्भावस्था के बाहर 1) का इस्तेमाल किया है, लेकिन एक उप इष्टतम (<80%)माउस blastocysts 16 के अस्तित्व / विकास अन्य को 21 से अनुभव किया गया था। चूंकि उच्च दाढ़ ग्लिसरॉल आधारित समाधान (से अधिक 7.9 एम) (2009) के बाद से हमारे वर्तमान VTF प्रणाली में इस्तेमाल कर रहे हैं, शारीरिक blastocoele पतन अनावश्यक है। हालांकि, रची ब्लास्टोसिस्ट के चुनिंदा सेने सामान्य रूप से सलाह दी जाती है।
  3. Cryodilution और ब्लास्टोसिस्ट लोड हो रहा है
    1. इनक्यूबेटर से रोगी संस्कृति डिश निकालें और भ्रूण (s) vitrified जा करने के लिए निकालने से पहले एक और व्यक्ति (यानी, एक माध्यमिक स्रोत ने भी देखा) के साथ रोगी / नमूना पहचान की पुष्टि करें।
    2. stereomicroscopy के तहत, कदम 2.2.2 प्रति ब्लास्टोसिस्ट विकास पुष्टि क्रायो डाटा शीट अद्यतन करते हैं, और, क्रायो पकवान की एक isotonic जोत छोटी बूंद में संस्कृति पकवान से पिपेट ब्लास्टोसिस्ट (एस)।
    3. कांच में रूपांतर flexipette (यानी, VTF टिप) का उपयोग कर व्यक्ति पकड़े बूंदों में प्रत्येक ब्लास्टोसिस्ट ले जाएँ।
    4. ले जाएँ प्रत्येकV1 (ते) समाधान में ब्लास्टोसिस्ट।
      1. V1 समाधान (3 μL) के साथ flexipette prefill और भ्रूण पर आधा सामग्री जगह है।
      2. भ्रूण Aspirate और तीन V1 धोने बूंदों (कदम 2.1.6 में कहा जाता है) की पहली करने के लिए ले जाते हैं, भ्रूण पिपेट 2 - परिधि लगभग 3 बार, और पर छोटी बूंद में पिपेट सामग्री से साफ (बुलबुला गठन से बचने) या बाहर डिश सतह।
    5. अगले V1 धोने की गिरावट के साथ VTF टिप भरें और भ्रूण (एस) की आकांक्षा को दोहराएँ। तीसरी बार दोहराएँ और एक व्यक्ति V1 पकड़े ड्रॉप करने के लिए ब्लास्टोसिस्ट (ओं) को स्थानांतरित। कमजोर पड़ने / वाशिंग चरणों में 30 से 45 रों लेना चाहिए। प्री-लोड अगले समाधान के साथ प्रत्येक VTF टिप (जैसे, V2), एक रैक में पिपेट डालें, और अगले पिपेट (कदम 2.1.7 में सेटअप के अनुसार) (चित्रा 1 बी) का उपयोग करें।
      नोट: गैर-डाइमिथाइल sulfoxide में कुल जोखिम समय (DMSO) युक्त V1 और V2 के समाधान के बाद से 5 मिनट प्रत्येक, व्यक्तिगत की pipetting हैदोहरी ब्लास्टोसिस्ट्स समान रूप से है कि अंतराल के भीतर कंपित किया जाना चाहिए, विचार है कि अंतिम वी 3 कदम प्रदर्शन करने के लिए ब्लास्टोसिस्ट के अनुसार कम से कम 1 मिनट की आवश्यकता होगी। उदाहरण के लिए, अगर वहाँ एक कांच में रूपांतर समूह में 4 ब्लास्टोसिस्ट्स, पिपेट ब्लास्टोसिस्ट्स # 1-2-3-4 75-एस के अंतराल पर कर रहे हैं।
      नोट: अभिनव क्रायो उद्यम (आईसीई) के कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित अधिकांश अन्य वाणिज्यिक कांच में रूपांतर प्रक्रिया है, जो आम तौर पर DMSO युक्त समाधान शामिल की तुलना में अलग है। उन प्रोटोकॉल एक क्रमिक के माध्यम से ही चरणबद्ध dilutions को प्राप्त है, लेकिन कम से नियंत्रित, धोने समाधान (यानी, isotonic मध्यम) का विलय, ते, और वी.एस.
    6. दोहराएँ 2.3.4 और 2.3.5 कदम V2 (है) समाधान का उपयोग।
    7. दोहराएँ कदम 2.3.4 और 2.3.5 वी 3 का उपयोग कर (वी एस) समाधान।
    8. वी 3 पकड़े छोटी बूंद में प्रत्येक ब्लास्टोसिस्ट रखने पर, (छोटी बूंद के बाहर) VTF सिरे से अवशिष्ट समाधान और बुलबुले स्पष्ट है, और फिर भ्रूण के आसपास साफ V3 के साथ पूरी तरह से टिप भरें। ऍक्स्पएल लगभग मात्रा (1 μL) का एक तिहाई है और पूरी तरह VTF टिप में ब्लास्टोसिस्ट (एस) और शेष वी 3 पिपेट।
    9. पिपेट से VTF टिप निकालें, एक बाँझ धुंध पैड का उपयोग करके बाहरी सतह पर अवशिष्ट V3 की नोक सूखी पोंछे, और पूर्व लेबल भूसे के खुले अंत में नोक सम्मिलित अंत पहले। एक "सूखी टिप" संभव भीतरी भूसे पालन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
    10. भूसे उलटें (लेबल नीचे अंत), भीतरी प्लग या सील पर टिप का निरीक्षण, और सुरक्षित रूप से हवा अंतरिक्ष के 1 सेमी के साथ खुले अंत सील। अधिमानतः, एक स्वचालित सील डिवाइस का उपयोग (जैसे, Syms मैं) तकनीकी भिन्नता को खत्म करने।
      नोट: यह एक ionomeric राल प्लास्टिक से बना रहे हैं तिनके का उपयोग कर के लाभ (जैसे, एचएसवी या μS-VTF) है कि किसी भी ठीक से संचालित गर्मी सील डिवाइस का उपयोग कर एक विश्वसनीय "वेल्ड" मुहर बनाता है, के रूप में कदम 2.1.3.1 में उल्लेख किया है।
    11. एक बार सील, एक stainl में एल.एन. 2 में सीधे बंद भूसे डुबकीईएसएस स्टील देवर कुप्पी और खुले भंडारण के लिए मरीज की बेंत से जुड़ी जाम में पुआल (s) जगह है।
      नोट: क्योंकि μS-VTF तिनके 40 मिमी भारित आईडी छड़ का उपयोग हवा से भरे भूसे की उछाल ऑफसेट करने के लिए, उल्टे goblets या खाली cryovials का उपयोग नमूना (एस) जब तक परिवहन शामिल है की आवश्यकता नहीं है कवर करने के लिए।
  4. वार्मिंग और क्रायो समाधान क्षालन / कमजोर पड़ने
    1. 'फिजिशियंस रेफरल vitrified भ्रूण हस्तांतरण की तारीख के बारे में पर्चा, अनुसूचित समय है, और भ्रूण विवरण (यदि पीजीएस का परीक्षण नंबर पिघलना करने के लिए / स्थानांतरण, विशिष्ट भ्रूण संख्या, आदि) की पुष्टि करें।
    2. ताजा वार्मिंग समाधान (1.0 एम सुक्रोज शेयर समाधान) और / या तैयार एक वाणिज्यिक स्रोत का उपयोग करें (अनुशंसित शेल्फ जीवन की 1 सप्ताह 1 महीने में एक बार उपयोग में, 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण)।
      1. अशेष 17.1 50 एमएल बाँझ सुक्रोज gra में endotoxin संचय के जोखिम के कारण प्रारंभिक खोलने (जैसे, साप्ताहिक आपूर्ति के स्रोत) पर बोतल में सुक्रोज की छदोहराया परिवेश के जोखिम पर Nules।
      2. समाधान में पूर्व तौला बारीक सुक्रोज मिक्स (1.0 एम स्टॉक = 3.42 g / 10 एमएल की HEPES बफर मानव ट्यूबल द्रव [एच HTF]) और 37 डिग्री सेल्सियस का हल को गर्म कणिकाओं की घुलनशीलता बढ़ाने के लिए। बार बार कंटेनर गति को मदद मिलेगी और अंतिम मिश्रण को पूरा करने के पलटना।
        नोट: निस्पंदन (0.22 माइक्रोन फिल्टर) सकारात्मक दबाव निस्पंदन इकाइयों का उपयोग किया चिपचिपा समाधान (> 0.5 एम सुक्रोज) या उच्च मात्रा के लिए सिफारिश की है। हाथ दबाव पंप पर्याप्त और सस्ती कर रहे हैं, जबकि एक बिजली के पंप शोर है, कंपन का कारण बनता है, और बस की आवश्यकता नहीं है।
    3. गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) एक 10 मिलीलीटर ट्यूब μS-VTF वार्मिंग स्नान उपयोग के लिए 1.0 एम sucrose के समाधान और रोगी के प्रति एच HTF मध्यम से प्रत्येक।
    4. रोगी का नाम और समाधान आईडी के साथ कवर सतह लेबलिंग की ताजा विगलन व्यंजन (6 अच्छी तरह से थाली) तैयार करें।
      नोट: इस मामले में, हम इस्तेमाल: (1) T1 धोने (200 μतेल ओवरले बिना एल, (2) टी 1 (100 μL) के तेल की 1 एमएल के साथ, (3) टी 2 (100 μL) के तेल के साथ, (4) T3 (100 μL) के तेल के साथ, (5) टी -4 (100 μL) तेल, और एक तेल ओवरले के बिना (6) 10% मानव सीरम albumin (एचएसए) या 20% सीरम स्थानापन्न के साथ T5 / 200 μL isotonic HEPES बफर माध्यम के साथ। एक सार्वभौमिक सूक्रोज समाधान कदम नीचे प्रोटोकॉल-T1 = 1.0 एम, टी 2 = 0.5 एम, टी 3 = 0.25 एम, और लागू टी -4 = 0.125 एम अगर बर्फ से या किसी अन्य वाणिज्यिक स्रोत के रूप में धीमी गति से जमी भ्रूण 22 के लिए प्रस्तावित उपलब्ध नहीं है, । इसके अलावा, ध्यान दें कि प्रारंभिक T1 धोने और अंतिम T5 equilibrations 30 मिमी पेट्री डिश में प्रदर्शन किया जा सकता है और 4 अच्छी तरह से पकवान उपरोक्त कदम 2-5 के लिए इस्तेमाल किया, एक तेल ओवरले शामिल हैं।
    5. एक समय में केवल एक मरीज की भ्रूण (s) पिघलना।
      1. 'फिजिशियंस रेफरल फार्म चेक करें और संकेत दिया संख्या (यानी, 1 या 2 blastocysts) वार्मिंग से पहले चक्र की पुष्टि; , आसमाटिक परिवर्तन देख (यानी द्वारा अस्तित्व / संभावित व्यवहार्यता का आकलन SHRinkage और पुनर्जलीकरण) और बरकरार झिल्ली, और, अगर संदिग्ध, एक और ब्लास्टोसिस्ट वार्मिंग से पहले चिकित्सक और / या रोगी से संपर्क करें।
    6. एक सह कार्यकर्ता के साथ रोगी / नमूना पहचान की पुष्टि (यानी, एक माध्यमिक स्रोत ने भी देखा)।
    7. एल.एन. 2 से भरा एक देवर कुप्पी में रोगी गन्ने की जगह और पुआल गरम होने के लिए की पहचान अलग।
    8. stereomicroscope मंच के केंद्र के लिए 6 अच्छी तरह से कमजोर पड़ने पकवान ले आओ। एक तरफ एक 60 मिमी पेट्री डिश बंद रखकर (यानी, बाएं हाथ या तकनीशियन के दाएँ हाथ की पसंद पर निर्भर करता है), गरम सुक्रोज (1.0 एम) जोड़ सकते हैं और एच-HTF समाधान के लिए एक 0.5 एम सुक्रोज वार्मिंग बनाने के लिए स्नान (खुला)।
      नोट: VTF सुझावों का केवल 0.5 एम एक QC रक्षा के रूप में सुक्रोज समाधान में गरम कर रहे हैं, दुर्लभ घटना है कि एक भ्रूण तेजी से वार्मिंग 22 पर निष्कासित कर दिया है में भ्रूण व्यवहार्यता की अवधारण के लिए बीमा है।
    9. तरल स्तर से ऊपर ऊपरी भूसे मुहर पकड़ोपहचान की पुष्टि करने के लिए है, और फिर समझ और मेयो कैंची का उपयोग आंतरिक प्लग नीचे पुआल सुरक्षित (VTF टिप अभी भी एल.एन. 2 में डूबे हुए किया जाना चाहिए)।
      1. मजबूती से एक QC एहतियात के रूप में आंतरिक भूसे sidewall से VTF टिप को दूर करने के देवर कुप्पी पर कैंची (एक दो बार) का दोहन; यदि VTF टिप पक्षपाती है, दोहन कि टिप आधार इस प्रकार प्लग अंत के पास एक हवाई स्थान उपलब्ध कराने, लेबल अंत विपरीत सील अंत के लिए चला जाता है।
    10. एक क्षैतिज स्थिति (अगले करने के लिए या नीचे त्रिविमदर्शी सतह) में परिवेशी वायु में कैंची के साथ पुआल लिफ्ट और गैर लेबल अंत (दाईं ओर लेबल) समझ। भीतरी प्लग में पुआल कट या सील और वार्मिंग स्नान पकवान ऊपर उठा। एक 60 डिग्री के कोण पर गर्म सुक्रोज स्नान में VTF टिप डालो जब तक यह पूरी तरह से निकाली जाती है और तेजी से किया गया है गरम (> 6,000 डिग्री सेल्सियस / मिनट); flexipette के आधार पकवान sidewall ऊपर आराम करेंगे।
      1. VTF तिवारी की अनुमति देंपी मुक्त गिरावट स्नान में करने के लिए। यदि टिप तुरंत उभरने नहीं करता धीरे ऊपरी भूसे सतह पर टैप करें। यह सिर्फ एक हिस्सा है जिस तरह से प्रकट होता है, कैंची या ठीक संदंश के साथ flexipette की शाफ्ट लोभी से बाहर निकालना में सहायता करते हैं।
    11. बाद 5 - 10 एस, पिपेट आधार समझ और एक डिस्पोजेबल pipetting डिवाइस में सम्मिलित; बल्ब में एक छेद प्रविष्टि पर दबाव जारी करने के लिए कार्य करता है। कवर एक तर्जनी के साथ बल्ब छेद और धीरे T1 धोने में vitrified ब्लास्टोसिस्ट जारी करने के लिए बल्ब निचोड़ (# 1) जबकि stereomicroscopy से देखने। एक बार पुष्टि की है, अवशिष्ट वी 3 (वी एस) समाधान और बुलबुले सकारात्मक दबाव से, अप्रयुक्त त्यागने अच्छी तरह से स्पष्ट केंद्र में सामग्री को निकालने। एक 5 मिनट टाइमर शुरू।
      नोट: सभी सुक्रोज कमजोर पड़ने कदम कमरे के तापमान (21 ± 2 डिग्री सेल्सियस) पर प्रदर्शन कर रहे हैं।
    12. VTF टिप निकालें और एक पिपेट पर जगह है। (- 4 मिनट लगभग 3) शेष समय के लिए तेल के तहत टी 1 # 2 में भ्रूण को ले जाकर आगे बढ़ें। <राजभाषा>
    13. कदम 2.4.12 शुरू करने से पहले मरीज से - एक दूसरे ब्लास्टोसिस्ट हस्तांतरण के लिए आवश्यक है, तुरंत एक दूसरे पुआल और VTF टिप (2.4.11 कदम 2.4.9 दोहरा) गर्म है। दोनों ब्लास्टोसिस्ट्स कम से कम से कम 3 मिनट की T1 में क्षालन (1.0 एम sucrose) के लिए एक साथ ले जाएँ।
  5. अगले समाधान के साथ flexipette पहले से भरना, और उसके बाद के लिए कदम और 3 मिनट के अंतराल पर में टी 2, T3, T4 और ब्लास्टोसिस्ट (s) पतला। Zona pellucida पहले लेजर ablated नहीं किया गया है (यानी, रची), तो टी -4 में करते हैं। एक औंधा माइक्रोस्कोप और छवि एक कंप्यूटर मॉनीटर पर भ्रूण के मंच पर पकवान रखें। एक नामित लाल सर्कल के भीतर Zona संरेखित करें और एक डायोड लेजर (perivitelline अंतरिक्ष के किनारे पर शुरुआत और जावक चलती) एक खोलने 2, 19 बनाने के लिए 2 या 3 आवेगों को सक्रिय करें।
  6. एक गर्म सतह (37 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए T5 (यानी, isotonic मध्यम) में blastocysts संतुलित करना।
  7. pyknotic darkening से रहित भी, पारदर्शी cytoplasms के साथ बरकरार कोशिका झिल्ली की प्रमुख उपस्थिति के आधार पर प्रारंभिक भ्रूण अस्तित्व का आकलन करें। भ्रूण हस्तांतरण से पहले 6 घंटे, जो समय पर, भ्रूण के विकास / अस्तित्व को फिर से मूल्यांकन किया है और प्रलेखित किया जाना चाहिए - भ्रूण (s) संस्कृति में 2 के लिए रखें।
    ध्यान दें: 1 से अधिक व्यवहार्य ब्लास्टोसिस्ट हस्तांतरण के समय से मौजूद है और रोगी कदम 2.3.3 दोहरा द्वारा केवल 1 ब्लास्टोसिस्ट, पूरक ब्लास्टोसिस्ट फिर सफलतापूर्वक फिर से vitrified जा सकता है (rVTF) के साथ आगे बढ़ने के लिए चुनता है - 2.3.11। हम एकल rVTF घटनाओं के बाद कई की पुष्टि की जीवित जन्मों की है।
    नोट: rVTF प्रयोगात्मक aneuploidy मानव एक metastable ग्लिसरॉल आधारित समाधान में vitrified ब्लास्टोसिस्ट के अस्तित्व / व्यवहार्यता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव के बिना 5 गुना तक प्रदर्शन किया गया है।

Representative Results

1,341 vitrified ब्लास्टोसिस्ट्स जून 2014 के बीच 2012 के बीच गरम कर रहे थे, और 1,341 भ्रूण बरामद (100%), जबकि 1,316 से बच (98.1%)। Biopsied ब्लास्टोसिस्ट्स 99.5% अस्तित्व से अधिक का अनुभव। मुख्य रूप से एकल, आनुवंशिक रूप से परीक्षण किया है, euploid, vitrified भ्रूण स्थानांतरित करने पर, हम (चित्रा 3) 20 उच्चतम आरोपण दरों में और संयुक्त राज्य अमेरिका में जीवित जन्म दर, उम्र के स्वतंत्र के कुछ प्राप्त करने में सक्षम थे, केंद्र द्वारा रिपोर्ट हाल ही में राष्ट्रीय आंकड़ों के अनुसार रोग नियंत्रण और असिस्टेड रिप्रोडक्टिव टेक्नोलॉजी के लिए सोसायटी (टेबल्स 1 और 2) के लिए। (कम से कम 35 वर्ष) अकेले cryopreserved चक्र (1 टेबल) के लिए एक अच्छा रोग का निदान रोगी जनसंख्या का मूल्यांकन, हमारी प्रयोगशाला दोनों आरोपण दर (यानी, एक भ्रूण की दक्षता में एक गर्भावस्था की स्थापना के लिए) के लिए राष्ट्रीय औसत से बेहतर प्रदर्शन किया और अंत में जन्म दर रहते हैं में 30% की। इसके अतिरिक्त, प्रारंभिक मान्यता / हमारे संशोधित भंडारण तिनके के मध्य 2014 में 70 शोध-सहमति दे दी है, फिर से vitrified aneuploid ब्लास्टोसिस्ट का उपयोग कर सत्यापन 100% वसूली और 100% अस्तित्व में हुई।

आकृति 1
चित्रा 1. MicroSecure VTF सेटअप। VTF पकवान (ए) के कांच में रूपांतर के समाधान के 3 अलग पंक्तियों, जो अलग, गिने पकड़े बूंदों में नियुक्ति से पहले 3 धोने बूंदों का उपयोग के साथ इकट्ठा किया है। इसके अतिरिक्त, छोटा VTF टिप्स (यानी, 300 माइक्रोन आईडी flexipettes) के साथ अलग-अलग pipettes सुरक्षित और एक स्टायरोफोम ट्यूब रैक (बी) है, जो व्यवस्थित उपयोग के लिए घुमाया जा सकता है में आयोजित कर रहे हैं। ध्यान दें कि एक प्रतिनिधि डिस्पोजेबल micropipette बल्ब pipetting विधानसभा स्टायरोफोम रैक पर आराम कर रहा है। arget = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. संशोधित ब्लास्टोसिस्ट ग्रेडिंग प्रणाली। हमारे संशोधित गार्डनर ब्लास्टोसिस्ट ग्रेडिंग प्रणाली ते कोशिकाओं के प्रेरित हर्नियेशन ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी की सुविधा के लिए के लिए खातों। : (ग्रेड 4 = 50% हर्नियेशन बी), जबकि एक अंडे सेने ब्लास्टोसिस्ट (सी) 50% से अधिक हर्नियेशन है: (ग्रेड 3 = 10% से कम हर्नियेशन ए) और विस्तार ब्लास्टोसिस्ट संशोधन पूर्ण ब्लास्टोसिस्ट के समय से पहले अंडे सेने समझता 16। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

54871fig3.jpg "/>
3. तुलनात्मक गर्भावस्था के परिणामों चित्रा। एक संचयी 1.5 साल के अंतराल पर, गर्भावस्था डेटा vitrified गर्म euploid ब्लास्टोसिस्ट्स स्थानांतरित करने के प्रभाव का आकलन करने के लिए की तुलना में थे (एन = 172 साइकिल / 144 स्थानान्तरण) गैर पीजीएस चक्र की तुलना में (एन = 160 साइकिल / 153 स्थानान्तरण) मुख्य रूप से ताजा शामिल 18 हस्तांतरण। हमारे प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए, इस डेटा का स्पष्ट रूप से पता चलता है कि biopsied μS-VTF प्रक्रिया द्वारा vitrified ब्लास्टोसिस्ट्स उनकी व्यवहार्यता बनाए रखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डेटा स्रोत # साइकिल मतलब का तबादला भ्रूण की # आरोपण दरें (%) लाइव जन्म दर (%)
एनबी लैब * 144 1.2 74.00% 74.50%
राष्ट्रीय औसत 20,423 1.7 39.60% 44.10%
* डेटा ऑरेंज काउंटी प्रजनन क्षमता, दक्षिणी कैलिफोर्निया प्रजनन केंद्र और वर्तमान तालियाँ प्रजनन क्षमता प्रयोगशाला (नायब लैब) जो 2008 में microSecure कांच में रूपांतर प्रक्रिया की स्थापना का उपयोग कर प्रजनन चिकित्सा क्लीनिक के लिए दक्षिणी कैलिफोर्निया केंद्र के 2014 के प्रदर्शन के आधार पर औसतन थे।

टेबल 1. 2014 सीडीसी सहायक प्रजनन सांख्यिकी। फ्रोजन भ्रूण स्थानांतरण गर्भावस्था तीन से 35 वर्ष से कम उम्र की महिलाओं के डेटा हमारे एनबी लैब का उपयोग कर चिकित्सक क्लीनिक रिपोर्टिंग 450 से अधिक रिपोर्टिंग क्लीनिक की अमेरिका 2013 राष्ट्रीय औसत की तुलना में।

SART राष्ट्रीय औसत
क्लिनिक - राज्य महिलाओं महिलाओं महिलाओं महिलाओं
<35 साल 35-37 साल 38-40 साल 41-42 साल
SCCRM-सीए * 63.1% 58.3% 40.6% 32.3%
CCRM-सीओ * 64.7% 61.5% 40.4% 32.2%
आरएमए-न्यू जर्सी * 63.2% 59.7% 34.6% 18.7%
राष्ट्रीय औसत 48.6% 38.3% 24.3% 12.3%
प्रजनन चिकित्सा के लिए SCCRM-दक्षिणी कैलिफोर्निया केंद्र; प्रजनन चिकित्सा के लिए के लिए CCRM-कोलोराडो केंद्र; और आरएमए-Reproductive चिकित्सा एसोसिएट्स
* ये अग्रणी क्लीनिक सभी मुख्य रूप से प्रत्यारोपित भ्रूण प्रति जीवित जन्म सफलता का अनुकूलन, vitrified भ्रूण स्थानांतरण चक्र को लागू किया है, आनुवांशिक परीक्षण के सहयोग से मरीजों की देखभाल के अपने मानक व्यवहार में।

तालिका 2 2014 संचयी जीवित जन्म दर, के रूप में असिस्टेड रिप्रोडक्टिव टेक्नोलॉजी के लिए सोसायटी (SART), SCCRM क्लिनिक के लिए द्वारा रिपोर्ट न्यूपोर्ट बीच, सीए, कई अन्य सम्मानित कार्यक्रमों, साथ ही साथ SART के साथ विषम में हमारे तालियाँ प्रजनन क्षमता का उपयोग कर लैब राष्ट्रीय औसत।

Discussion

आज, वहाँ पूरा ब्लास्टोसिस्ट अस्तित्व (> 95%) प्राप्त करने और आरोपण सफलता ताजा भ्रूण के समान प्राप्त करने का एक उच्च उम्मीद है। कुछ समूह ने सुझाव दिया है कि vitrified भ्रूण स्थानांतरण चक्र का जीना जन्म दर शायद ताजा ब्लास्टोसिस्ट्स जब बरकरार cryopreserved भ्रूण एक स्वस्थ, गैर hormonally उत्तेजित गर्भाशय में प्रत्यारोपित किया जाता है की तुलना में भी अधिक है। हमारे आंकड़े स्पष्ट रूप से संकेत मिलता है कि कांच में रूपांतर प्रभावी ढंग से और मज़बूती से ताजा भ्रूण की व्यवहार्यता बनाए रखता है। इसके अलावा, हम सिद्ध कर दिया है कि हमारे मम्मियाँ, बंद विधि, MicroSecure कांच में रूपांतर (μS-VTF) कहा जाता है, एक इष्टतम परिणाम वाणिज्यिक मानकों (यानी, खुला डिवाइस सिस्टम) आईवीएफ उद्योग में इस्तेमाल की तुलना करने के लिए तुलनीय या अधिक से अधिक प्राप्त कर सकते हैं।

रूपांतर तकनीकी repeatability और कांच में रूपांतर उपकरणों / तरीकों की एक भीड़ का उपयोग कर लोगों के बीच विश्वसनीयता के साथ जुड़ा हुआ है। बारी में, यह inconsi में हुई हैकांच में रूपांतर लागू करने के कार्यक्रमों के बीच stencies। इसलिए, यह है कि इस उपकरण अपनेपन प्रयोगशाला प्रवीणता और सफल परिणाम के बारे में एक महत्वपूर्ण कारक है कि आश्चर्य की बात नहीं है। यह "तकनीकी हस्ताक्षर" 11 यही वजह है कि कार्यक्रमों के बीच repeatability समस्याग्रस्त हो सकता है की इस अवधारणा है। इतना ही नहीं एक दर्जन से अधिक के विकास के वाणिज्यिक उपकरणों इस घटना जटिल है, यह गुणवत्ता नियंत्रण चिंताओं बनाया गया है। सौभाग्य से, कांच में रूपांतर सिस्टम बंद कर दिया, जैसे μS-VTF, रैपिड-मैं, और VitriSafe, अब भी उतना ही डिवाइस सिस्टम 12, 13, 14 को खोलने के लिए प्रभावी साबित हो रहे हैं।

MicroSecure VTF तकनीकी आसानी, विश्वसनीयता, और मन में क्रायो सुरक्षा के साथ विकसित एक उपन्यास, मम्मियाँ कांच में रूपांतर तकनीक है। दो पहले से मंजूरी दे दी है, एफडीए अनुरूप उपकरणों के उपयोग के संयोजन से, यह एक गैर-वाणिज्यिक कांच में रूपांतर प्रणाली w हैएक की स्थापना की कम लागत के विशेष उपकरणों के विपरीत होने के विशिष्ट लाभ ith। इसके अलावा, अपनी अनूठी tamperproof और भली भाँति दोहरे रंग लेबलिंग प्रणाली है, साथ ही कई अन्य गुणवत्ता नियंत्रण फायदे, बना दिया है μS-VTF एक आकर्षक वैश्विक विकल्प 11। एक गैर वाणिज्यिक VTF डिवाइस के रूप में, हालांकि, इसकी बड़े पैमाने पर उद्योग आवेदन धीरे-धीरे विकसित हो रहा है। केवल अपनी सुरक्षा, सुरक्षा, और नैदानिक ​​प्रभावशीलता का निरंतर प्रकाशन के माध्यम से μS-VTF लाभ के उपयोग से बढ़ जाएगा।

अगस्त 2014 में, जब मूल 0.3 एमएल भ्रूण भूसे एक आंतरिक, गैर बाती हाइड्रोफोबिक प्लग के साथ निर्मित हासिल करने में असमर्थता के साथ सामना किया है, हम मज़बूती से μS-VTF विधि को संशोधित करने में सक्षम थे। संक्षेप में, उनकी कपास पीवीपी प्लग के साथ नया 0.3 एमएल वीर्य / भ्रूण तिनके को प्रभावी ढंग से अनुकूलित किया गया। यह बस कपास प्लग से पहले एक आंतरिक मुहर बनाने, इस प्रकार संपर्क को रोकने और तरल पदार्थ के साथ बाती द्वारा प्राप्त किया गया थाओपन एंडेड VTF टिप (यानी, flexipette भ्रूण या अंडे युक्त)। इसके अलावा, अगर 40 मिमी आईडी छड़ सुलभ नहीं हैं, लाइटर 30 एमएम की छड़ के साथ जुड़े मुद्दे उछाल दो बॉल बेयरिंग का उपयोग कर counterweighted जा सकता है।

इन अतिरिक्त कदम तकनीक में थोड़ा कम सरल अत्यधिक प्रभावी बना दिया है, लेकिन अभी भी। आज, अर्थशास्त्र और प्रभावकारिता, तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं चिंताओं के रूप में biopsied ब्लास्टोसिस्ट्स आम तौर पर व्यक्तिगत रूप से vitrified कर रहे हैं जब तक उनके euploidy स्थिति एक आनुवंशिकी रिपोर्ट पर पुष्टि की है। एक पुष्टि की अलाभकारी aneuploidy स्थिति के साथ blastocysts आम तौर पर रोगी सहमति से खारिज कर दिया हो, सप्ताह के भीतर। इस प्रकार, VTF उपकरणों की एक बहुमत (> 50%) लघु अवधि के भंडारण के बाद खारिज कर रहे हैं, जब यह वाणिज्यिक उपकरणों का उपयोग कर एक तना वार्षिक लागत के कारण। कुल मिलाकर, μS-VTF मानव ब्लास्टोसिस्ट की cryopreservation के लिए एक, अत्यधिक प्रभावी, विश्वसनीय, और repeatable प्रक्रिया है। बेहतर गुणवत्ता नियंत्रण डिजाइन SECURELY लेबल और सुरक्षित रूप से भंडार भ्रूण / oocytes जबकि वसूली विफलता को नष्ट करने और बाद वार्मिंग अस्तित्व और व्यवहार्यता, जो भ्रूण कांच में रूपांतर के लिए एक सार्वभौमिक दृष्टिकोण के रूप में इस प्रणाली के उपयोग को सही ठहराते अनुकूलन।

Disclosures

एम सी Schiewe अभिनव क्रायो उद्यम के लिए वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड के एक सदस्य के रूप में और कैलिफोर्निया Cryobank के लिए एक तकनीकी निदेशक के रूप में कार्य करता है। इस वीडियो लेख के उत्पादन तालियाँ प्रजनन क्षमता के लिए भुगतान किया जा चुका है। लेखकों युग्मक और भ्रूण के कांच में रूपांतर के बारे में खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय समझौतों या हितों के टकराव की है।

Acknowledgments

एम सी Schiewe का विश्लेषण करने और वार्षिक सीडीसी और SART डेटा का मूल्यांकन में उसकी सांख्यिकीय विशेषज्ञता के लिए लास वेगास की उर्वरता सेंटर में श्री वन गार्नर को धन्यवाद देना चाहूंगा। इसके अलावा, लेखकों हमारे तकनीकी क्षमताओं और विशेषज्ञता में अपने समर्पित समर्थन और विश्वास के लिए उनकी चिकित्सा निदेशक डॉ रॉबर्ट ई एंडरसन, का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum Cane IVM XC055
Ball bearings, 3/32" VXB.com KIT15977 stainless steel
CBS semen/embryo straw, 0.3 mL CryoBioSystems 25292 individual sterile
Color, ID rods, 30 mm CryoBioSystems 019021-26 weighted
Culture tubes, 15 mL Falcon 352099 Conical
Culture tubes, 10 mL Falcon 352057 Snap-cap
Cryosleeves Nalgene 5016-001
Filter, 250 mL Fisher Sci. 09-740-2A 0.22 μm
Flasks, Tissue Culture 50 mL Falcon 353014
Flexipettes, 300 μm ID Cook Med. K-FPIP-1300-10BS-5 Sterile, 20/pack
Forcep, Large Miltex 6-30TC
Forcep, Splinter - fine Miltex 17-305
Goblet IVM PA003
Heat Sealer, SYMS 1 CryoBioSystems 16399 110 V or 220 V with adapter
Hepes-buffered media  Life Global or LGGH-100; 100 mL, or stored at 2 - 8 ºC
Irvine Scientific H-HTF; 90126; 100 mL with non-essential AA's
Labels, Cryo GA International CL-23T1 Various colors
Liquid Nitrogen Tank, 40 L MVE or Taylor Warton various liquid storage 
LN2; Dewar flask, 0.5 L Hampton Research HR4-695 Stainless steel
6-well Custer Dishes Biogenics 015/020 plasticware by case
Pipette Bulb, Micro Cap Drummond Fisher#13681451 Hole on bulb apex
Petri Dishes, 35 mm Falcon 351006
Petri Dishes, 58 mm Nunc 150288
Petri Dishes, 100 mm Falcon 351029
Pipette Tips, ART long Fisher Sci. 02-707-80 10 - 100 μL
Pipet Aid Drummond or Falcon various rechargeable
Pipetting Device, Stripper Cooper Surgical MXL3-STR
Pipettes, Serological 1 mL Falcon 357521
Pipettes, Serological 2 mL Falcon 357507
Pipettes, Serological 5 mL Falcon 357543
Pipettes, Serological 10 mL Falcon 357551
Scissors, Surgical Mayo Miltex 5-SC-16
Stereomicroscope Nikon, Olympus, Leica various
Sterile Gauze pads, 4" x 4" Kendall Healthcare 6939
Synthetic serum Life Global, or LGPS-20; 20 mL, or stored at 2 - 8 ºC
Irvine Scientific SS-99193; 12 x 10 mL purchase low endotoxin lot
Sucrose Sigma Chemical Co. #S9378 Aliquot into 50 mL flasks, 1 year;
17.1 g/flask + Medium to 50 mL;
makes a 1 M solution;
Filter with 0.22 µm unit
Timer Nalgene 5016-001
Thawing Solution Innovative Cryo Enterprises BL-TS (≤1.0 M Sucrose) T1, T2, T3, T4; tored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening
Vitrification Solution*,** Innovative Cryo Enterprises BL-VS (≥7.9 M [Glycerol/EG]) V1, V2, V3; stored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening
* Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate 
** Other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8 M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2 M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Hum. Reprod. Update. 16, 536-554 (2012).
  2. Schiewe, M. C., Whitney, J. B., Anderson, R. E. Potential risk of monochorionic dizygotic twin blastocyst formation associated with early laser zona dissection of group cultured embryos. Fertil. Steril. 103, 417-421 (2015).
  3. Schiewe, M. C. The historic development and incorporation of four assisted reproductive technologies shaping today's IVF industry. J. Fertil. In Vitro Reprod. Med. Genet. 4, 2-9 (2016).
  4. Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
  5. Rall, W. F., Wood, M. J., Kirby, C., Whittingham, D. G. Development of mouse embryos cryopreserved by vitrification. J. Reprod. Fertil. 80, 499-504 (1987).
  6. Schiewe, M. C., Rall, W. F., Stuart, L. D., Wildt, D. E. Analysis of cryoprotectant, cooling rate and in situ straw dilution using conventional freezing or vitrification for cryopreserving sheep embryos. Theriogenology. 36, 279-293 (1991).
  7. Lane, M., Schoolcraft, W. B., Gardner, D. Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique. Fertil. Steril. 72, 1073-1078 (1999).
  8. Mukaida, T., Oka, C., Goto, T., Takahashi, K. Artificial shrinkage of blastocoeles using either a micro-needle or a laser pulse prior to the cooling steps of vitrification improves survival rate and pregnancy outcome of vitrified human blastocysts. Hum. Reprod. 21, 3246-3252 (2006).
  9. Kuwayama, M., Vatja, G., Ieda, S., Kato, O. Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and elimination of potential contamination. Reprod. Biomed. Online. 11, 608-614 (2005).
  10. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Hum. Reprod. 17, 744-751 (2002).
  11. Schiewe, M. C. Quality control factors influencing the successful and reliable implementation of oocyte and embryo vitrification. Cryopreservation. Marco-Jiménez, F., AkdemirKoç, H. , 1st Ed, InTech. Rijeka, Croatia. (2016).
  12. Stachecki, J. J., Garrisi, J., Sabino, S., Caetano, J. P. J., Wiemer, K., Cohen, J. A new safe, simple, and successful vitrification method for bovine and human blastocysts. Reprod. Biomed. Online. 17, 360-367 (2008).
  13. Panagiotidis, Y., et al. Open versus closed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme: a prospective randomized study. Reprod. Biomed. Online. 26, 470-476 (2013).
  14. Papatheodorou, P., et al. Open versus closed oocyte vitrification system: a prospective randomized study. Reprod. Biomed. Online. 26, 595-602 (2013).
  15. Schiewe, M. C., Zozula, S., Anderson, R. E., Fahy, G. M. Validation of microSecure vitrification (µS-VTF) for the effective cryopreservation of human embryos and oocytes. Cryobiology. 71, 264-272 (2015).
  16. Schiewe, M. C. MicroSecure vitrification for oocytes and embryos: optimum simplicity, security and cost and effectiveness combining FDA-approved products. J. Clin. Embryol. 13, 33-51 (2010).
  17. Rall, W. F. Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification. Cryobiology. 24, 387-402 (1987).
  18. Seki, S., Mazur, P. Effect of warming rate on the survival of vitrified mouse oocytes and on the recrystallization of intracellular ice. Biol. Reprod. 79, 727-737 (2008).
  19. Schiewe, M. C. General hygiene and quality control practices in an embryo-production laboratory. Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the Use of Embryo Transfer Technology, Emphasizing Sanitary Precautions. Stringfellow, D. A., Givens, D. , 3rd Ed, International Embryo Transfer Society. Champaign, IL. (2008).
  20. Whitney, J. B., Nugent, N. L., Anderson, R. E., Schiewe, M. C. Single center validation of routine blastocyst biopsy implementation. J. Asst. Reprod. Genet. , (2016).
  21. Liebermann, L., Conaghan, J. Artificial collapse prior blastocyst vitrification: improvement of clinical outcomes. J. Clin. Embryol. 16, 107-118 (2014).
  22. Parmegiani, L., Tatone, C., Cognigni, G. E., Bernardi, S., Troilo, E., Arnone, A., Maccarini, A. M., Di Emidio, G., Vitti, M., Filicori, M. Rapid warming increases survival of slow-frozen sibling oocytes: a step towards a single warming procedure irrespective of the freezing protocol. Reprod Biomed Online. , (2014).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 121 ब्लास्टोसिस्ट cryopreservation कांच में रूपांतर बांझपन गुणवत्ता नियंत्रण मम्मियाँ भंडारण
संशोधित MicroSecure कांच में रूपांतर: एक सुरक्षित, सरल और अत्यधिक मानव ब्लास्टोसिस्ट के लिए प्रभावी Cryopreservation प्रक्रिया
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schiewe, M. C., Zozula, S., Nugent,… More

Schiewe, M. C., Zozula, S., Nugent, N., Waggoner, K., Borba, J., Gamboa, L., Whitney, J. B. Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts. J. Vis. Exp. (121), e54871, doi:10.3791/54871 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter