Abstract
Klinisk embryo forglassing utviklet seg med utvikling av unike forglassing enheter i det 21. århundre, og med den misforståelse at ultra-rask avkjøling i et "åpent" system (dvs. direkte LN 2 kontakt) var en nødvendighet for å optimalisere vitrification suksess. Dogmet rundt viktigheten av kjølepriser førte til risikable handlinger underlagt teknisk variasjon og til etableringen av forglassing enheter som oversett viktige kvalitetskontroll faktorer (for eksempel brukervennlighet, repeterbarhet, pålitelighet, merking sikkerhet og lagring sikkerhet). Forstå kvalitetskontroll feil av andre enheter som er tillatt for utviklingen av en trygg, sikker, repeterbare og pålitelig iS-VTF metode forsøkte å minimere intra- og inter-tekniker variasjon. Like viktig er det kombinert tilgjengeligheten av to eksisterende FDA-kompatible enheter: 1) en 0,3-ml ionomer harpiks embryo halm med internalisert, dual-farget, tamper-pTaket merking med repeat sveis segl potensial; og 2) forkortet, vanlig brukte, sterile 300 mikrometer ID flexipettes å direkte laste embryo (er) for å skape en svært effektiv global vitrification enhet. Som andre aseptisk, lukket forglassing systemer (f.eks, High Security Forglassing (HSV), Rapid-i, og VitriSafe) effektivt brukes i reproduktiv medisin, microSecure Forglassing (uS-VTF) har vist at det kan oppnå høy post-oppvarming overlevelse og graviditet utfall med sin oppmerksomhet til enkelhet, og redusert teknisk variasjon. Selv om 0,3-mL embryo halminneholdende en hydrofob indre pluggen var kommersielt erstattet med en standard sæd strå besitter bomull-polyvinylpyrrolidon (PVP) plugger, den opprettholdt sin ionomere harpiksblandingen for å sikre tetning sveis. Imidlertid kan de bomullsplugger veken ut fluid-embryo innholdet i flexipettes ved kontakt. En modifisert uS-VTF metoden ble tilpasset for å omfatte en ekstra innvendig sveisforsegle før pluggen på enheten lasting side. Den ekstra teknisk skritt til uS-VTF prosedyren har ikke påvirket den vellykkede anvendelse, så høy overlevelse (> 95%) og graviditet priser fortsetter i dag.
Introduction
Vitrifisering er den mest virkningsfulle assistert befruktning i in vitro fertilisering (IVF) bransjen siden utviklingen av intracytoplasmatisk spermieinjeksjon. I dag, blastocyster er oppbevart uten tap i embryo levedyktighet tidligere forbundet med konvensjonelle langsom frysing metoder 1. Med pålitelig post-oppvarming embryo overlevelse, er infertilitet bransjen transformerer til den foretrukne bruk av cryopreserved embryo transfer sykluser, som gir tilsvarende eller høyere svangerskapsutfall enn tradisjonelle ferske embryo. I samarbeid med blastocyst biopsi og preimplantation genetisk screening (PGS) har Vitrifisering blitt et viktig klinisk verktøy for å optimalisere sunn levende fødsels utfall via euploid enkelt embryo to, tre.
Murine embryo forglassing ble utviklet på midten av 1980-tallet 4, 5 og tilpasset husdyrhold av 1990 seks. Basert på forutsetningen at forglassing løsninger danner en metastabil glasseous tilstand, uten å skade is krystalldannelse, har det vist seg å mer effektivt bevare komplett mobil integritet embryoer. Interessant, gjorde lovende aksept av Vitrifisering i human embryologi ikke begynne å bli realisert før det 21. århundre. Tidlig publikasjoner som fremmer bruken av forglassing falt sammen med utvikling av unike "åpne" system enheter 7, 8, 9. Men innføringen av forglassing i klinisk praksis var treg, så det kom på et tidspunkt da forbedringer i sakte blastocyst frysing ble også forekommer. Vellykket konvensjonell langsom hastighet frysing, i tillegg til forglassing, ble justert med forbedringer i embryo kultursystemer, så vel som med innarbeidelseion av blastocoele-kollapse tilnærminger, som forbedret både total overlevelse av trophectoderm og senere implantasjon 10.
I det siste tiåret har Vitrifisering teknologi raskt fortrengt konvensjonell frysing praksis. I stor grad, dette var på grunn av utviklingen av spesialiserte forglassing enheter. Noen av disse enhetene har handikappet den generelle sikkerheten, effektiviteten og effektiviteten av klinisk Vitrifisering ved å innføre iboende designfeil til enheter som brukes i IVF industrien 11. Faktisk nyansene av ulike enheter innføre betydelig teknisk variasjon mellom programmer, ofte referert til som "tekniske signaturer" 12. Dermed vitenskapelige tidsskrifter, som Journal of visualisert Experiments (Jove), kan tjene som en verdifull ressurs for å demonstrere tekniske detaljer, som vil bidra til å redusere resultatet variasjon. Et annet pågående problem er at some embryologists fortsette å bli feilinformert, selv i dag, basert på påstander om at "ultra-rask nedkjøling av embryoer eller ubefruktede egg i en" åpen Vitrifisering system "(dvs. direkte embryo kontakt med flytende nitrogen (LN 2)) er en forutsetning for å optimalisere suksessrate. " Åpenbart er denne troen unøyaktig, basert på den velprøvde suksessen aseptisk lukkede systemer 13, 14, 15.
Basert på cryobiological prinsippene for forglassing, virkningen av forglassing er mer sterkt avhengig av oppvarmingsfrekvens enn ved avkjøling priser 16, 17, 18. Generelt er uavhengig av forglassing anordningen brukes, må oppvarmingshastigheten overstiger den avkjølingshastighet for å sikre høy overlevelse. Høye oppvarming priser minimere muligheten for eventuell is vekst (dvs. Recrystallization av kjerneurenheter i kryo-løsninger) under avglassing fasen av oppvarmingen. Riktignok kan stabiliteten av forglassing løsningen (dvs. den typen og konsentrasjonen av cryobeskyttelsesmidler anvendes) har en forvirrende virkning, men dette er omtalt i en egen publikasjon 11. Med tanke på kjøling-oppvarming rente problemer, ble MicroSecure Vitrifisering (uS-VTF) utviklet i 2008 som en billig, ikke-kommersiell, FDA-godkjent metode som optimalisert kvalitetskontroll aspekter av vitrification. Det var unik ved at det tilbys tamper-proof, internalisert, dual-farget merking. Videre, ved lasting og lagring av embryoer direkte i sterile flexipette brukes til pipettering (dvs. uten pipettering til en sekundær enhet overflate) og ved å bruke ionomer-harpiks sugerør som fullstendig sveis segl hjelp av en automatisert fangstskuta, teknisk variasjon har vært effektivt eliminert.
Ved vurdering av completeness av forglassing enheter for potensiell bruk, er det flere kvalitetskontroll faktorer som bør tas i betraktning, herunder: 1) merking potensielle -Kan etiketter være forsvarlig fulgt? Er de fikle? Har de tilbyr dual-color identifikasjon potensial? Krever det en sekundær etikett, og kan etiketten enkelt fjernes for journalføring formål (dvs. pasienten verifisering) etter oppvarming? 2) Teknisk lette -Kan embryoer lett bli lastet inn / på enheten på en riktig måte, og bare identifisert og sporet etter oppvarming? 3) Prosedyre enkelhet / Repeterbarhet -Har forglassingsprosessen metoden tilbudet enkelhet og pålitelighet som enkelt lar for repeterbarhet, noe som minimerer variasjonen mellom teknikere (intern) og programmer (ekstern)? 4) LN 2 lagringskapasitet -Kan enhetene er enkelt og trygt håndtert og identifisert? Er de storaseri potensiell plass effektiv? Har enheten tilbudet sikkerhet og trygghet mot fysiske skader eller mulige forurensninger som en aseptisk lukket system? 5) Recovery potensialet / overlevelsesevne -Er enheten utformingen utsatt for potensielle problemer i den garanterte utvinning av embryoer, og de vil sikkert vitrifisere og opprettholde full cellulær integritet post-oppvarming? Sistnevnte spesifikk kvalitet bekymring, utvinningsgraden, har faktisk overraskende blitt minimert i publiserte rapporter; Dette gjøres ved generelt å skjule ugunstig utfall (dvs. tapt embryo eller egg) i typisk-god overlevelse. Alle enheter utsatt for inkonsekvent recovery (<99%) er alvorlig feil og utgjør en saksbehandlingsansvar.
Vår aseptisk, lukket iS-VTF metoden er strategisk utviklet for å ta hensyn til hver kvalitetskontroll tiltak. Men etter 5 år med overlegen klinisk suksess og validering 14, prosedyren hadde to være endret. De opprinnelige 0,3 ml embryo sugerør (som har et hydrofobt plugg) ble fjernet fra IVF industri og erstattet med en 0,3-ml sæd halm som innehar en standard bomull / PVP plugg (dvs. relabeled som et sæd / embryo halm). Denne prosessuelle papir skisserer konkrete tiltak og strategier for å implementere uS-VTF trygt, enkelt og effektivt. Videre, merker vi modifiseringen (e) som er nødvendig for pålitelig å gjøre rede for forsyning begrensninger, inntil slik tid som et alternativ ideell halm beholderen gjeninnføres tilbake inn i det kliniske laboratorium.
Protocol
Utviklingen av uS-VTF prosedyren ble gjennomført som del av et godkjent Institutional Review Board (IRB) studie i 2008-2009 (Aspire IRB, Santee, CA) på menneskelig eggcelle og embryo nedfrysing. Prosedyren har siden blitt rutinemessig brukt til klinisk behandling av infertilitet pasienter som har signert informert samtykke former.
1. Kvalitetskontrollhensyn
- Bruk forskjellige farger (f.eks, penner, etiketter, eller identifikasjons (ID) stenger eller plugger) til å skille pasienter hvis cryopreservering mer enn en gruppe av embryo i en dag.
- Bruk forskjellige retter og pipetter for hver pasient. Minimalisere volumet av mediet overført ved å bevege blastocyster fra en oppløsning til en annen.
- Fryse ned en blastocyst per halm eller enhet. Opprettholde aseptisk / steril teknikk og følge alle sikkerhetsregler.
- Bekreft Physicians 'henvisning Form og signert pasienten samtykke før initiating prosedyrene. Sjekk disponering av pasientenes embryo (er) på inventar.
- Bruk en "Offentliggjøring av Ansvar og Samtykke for Transport" hvis blastocysts skal overføres til et annet anlegg. Sørg for at alle underskrifter er vitne på stedet eller attestert.
- Bekreft riktige kvalitetskontroll tiltak for medium og proteintilskudd, når det er hensiktsmessig, inkludert bioassay, endotoksin bestemmelser og utløps / lotnummer verifisering og sporing.
- Etablere kritiske grenser (dvs. lave nivåer av bekymring) for klinisk cryopreservation utfallet overvåking og evaluering, for eksempel utvinning: <95%, overlevelse: <80%, og kliniske graviditet priser ved hjelp av enkle-euploid blastocysts: <50%.
2. Nedfrysing Prosedyre
- Forberedelse
- Fullfør den aktuelle papirarbeid, herunder legge data inn i regneark og nedfrysing database og inventar log(E).
- Klargjør ferske nedfrysing løsninger eller bruke en kommersiell kilde (holde produsentens anbefalte lagrings og holdbarhet forhold).
- Straw forberedelse.
- Åpne merking siden av individualiserte sterile pakker. Løsne påfyllingsmunnstykket funnet på den tradisjonelle 0,3-ml embryo halm ved å gripe den mot emballasje og delvis løfte og trekke strå ut; Dette vil utsette etiketten slutt på miljøforhold mens halmen hviler aseptisk inne i plastpakke.
- (Modifikasjon) for 0,3-ml sæd / embryo sugerør, skyv pluggen ned 0,5 cm. Anvende en innvendig tetning i front av bomull-PVP plugg ved bruk av en enkel bordimpulsforsegler.
- Angi at halm bort på Teflon overflaten av elektroden, like foran pluggen. Trykk ned håndtaket for å aktivere varmen. Slipp håndtaket når det røde lyset vises. For å sikre en fullstendig sveis tetning, varme ved en temperatur som er tilstrekkelig flattens de motstående flater, deretter snu det 180 ° og forsegle den motsatte overflaten 19 etter behov.
- Åpne merking siden av individualiserte sterile pakker. Løsne påfyllingsmunnstykket funnet på den tradisjonelle 0,3-ml embryo halm ved å gripe den mot emballasje og delvis løfte og trekke strå ut; Dette vil utsette etiketten slutt på miljøforhold mens halmen hviler aseptisk inne i plastpakke.
- Ved hjelp av en cryomarker, merke hver halm / enhet og cryogoblet med pasientens navn, et unikt ID-nummer (for eksempel personnummer, DOB, eller pasient-ID-nummer), og dato for frysing. Inkluderer også et unikt nummer på hver strå / enhet (f.eks, 1, 2, 3 osv).
- Fest etiketten (helst farget) på en farge-vektet ID stang settes inn og forseglet i en 0,3-ml embryo halm. Returner halm til sin individuelle sterile emballasjen før bruk.
Merk: Hvis bare 30 mm fargevektede ID stenger som er tilgjengelige, da de ekstra innsetting av to kulelagre er nødvendig, nær hver side av stangen ID.
- Fest etiketten (helst farget) på en farge-vektet ID stang settes inn og forseglet i en 0,3-ml embryo halm. Returner halm til sin individuelle sterile emballasjen før bruk.
- Identifiser hver stokk med en unik innskrevet ID-nummer. Identifisere en LN 2 lagring tank nummer og en boks nummer hvor hver pasient prøven (e) kan være stELLER-behandlet langsiktig.
- Forbered ferske kryo retter (100 mm) ved merking av bunnoverflaten med pasientens navn, løsning ID, og embryo / holder dråpe ID (figur 1A). Nærmere bestemt, sette opp 4 p dråper: isoton HEPES-bufret medium (øverst), V1 (ekvilibrering oppløsning (ES)), V2 (intermediat-løsning (IS)), V3 (forglassing oppløsning (VS), nederst). Skriv embryoet ID på øvre høyre side med merkede kolonner.
Merk: En serie av 25- til 50-mL vaske dråper (n = 3) brukes for å sikre at hver enkelt endelig 10- til 15-pl holder dråpe / løsningstypen (dvs. V1, V2, V3 eller) er ren og ufortynnet. Ved hjelp av denne tilnærmingen, opp til fem individuelle embryo kan ved vitrified hjelp av en enkelt parabolen. Hold hver tallerken dekket når den ikke er i bruk for å unngå eventuelle romtemperatur fordampning / dehydrering av dråpene. - Forbered sterile flexipettes ved å kutte 3 cm utenfor basen sin ende (referert til som "VTF tips"). Sett dem på individuellpipetter (sett på 3 mL) og angi pipettes-VTF tips oppreist i en styrofoam tube stativ (figur 1B).
- embryo Selection
- Bekreft pasient / prøveidentifikasjon.
- Ved hjelp av et invertert mikroskop (200 - 400 x forstørret), klasse og klassifisere blastocyster i henhold til Gardner graderingssystem 20, ved hjelp av en numerisk klassifisering av 1 til 6 for tidlig å skraverte blastocyster, henholdsvis, og en A, B, eller C-klasse er tilordnet til den indre cellemassen (ICM) og trophectoderm (TE).
Merk: I forberedelsene til blastocyst biopsi og euploidy analyse, er zona pellucida pre-klekket ut av laser ablasjon på dag tre for å fremme tidlig herniering av TE og dermed krever en modifisert gradering klassifisering 2. I korte trekk, Grade 3 full blastocysts utstillings opptil 10% TE prolaps, grad 4 utvidet blastocysts er 10 - 50% klekket, og Grade 5 klekke blastocysts har> 50% TE extrusion (figur 2A-C).
Merk: Vi foretrekker å fryse ned Grad 3 eller høyere blastocysts av ≥BB kvalitet på dag 5 eller 6. Men, vitrified blastocysts av lavere kvalitet (C) og post-komprimering embryoer på tidligere stadier (inkludert sent morula til grad 1 eller 2 blastocyster ) kan sikkert overleve varmer helt intakt og gi levedyktige embryoer som er i stand til å oppnå levendefødte. - Skjule blastocoele av hver blastocyst før utbruddet av cryodilution prosessen ved micropuncturing en trophectoderm kryss eller ved å utføre en laserpuls ablasjon av en trophectodermal celle 21 hvis du bruker lav-molaritet forglassing løsninger (<6,5 M eller 40% v / v).
Merk: Du trenger ikke å skjule blastocysts er ikke enhetsavhengig. I vår egen tidlige utviklingen av uS-VTF (2008), vi opprinnelig brukt etylenglykol (EG) / DMSO løsninger hell med eggceller (1 av 1 full sikt graviditet), men en sub-optimal (<80%)overlevelse / utvikling av mus blastocysts 16 ble opplevd av andre 21. Siden høye molare glyserol-baserte løsninger (over 7,9 M) brukes i vår nåværende VTF system (siden 2009), er unødvendig fysisk blastocoele kollaps. Imidlertid er den selektive klekking av klekket blastocyster tilrådelig generelt.
- Cryodilution og Blastocyst Loading
- Fjern pasienten kultur tallerken fra inkubatoren og bekrefte pasienten / prøven identifikasjon med en annen person (dvs. bevitnet av en sekundær kilde) før du tar fosteret (e) som skal vitrified.
- Bekreft blastocyst utvikling per trinn 2.2.2, oppdatere cryo datablad, og under stereomikroskopi, pipette blastocyst (e) fra kulturen fatet i en isotonisk beholdning dråpe av cryo fatet.
- Flytt hver blastocyst i individuelle holdingdråper ved hjelp forglassingsprosessen flexipette (dvs. VTF tips).
- Flytt hverblastocyst inn i V1 (ES) løsning.
- Forhåndsutfyll den flexipette med V1 løsning (3 mL) og legg halvparten av innholdet på embryo.
- Aspirer embryo og flytte til den første av tre V1 vaskedråper (nevnt i punkt 2.1.6), pipette embryoet 2 - 3 ganger rundt omkretsen, og fjerne pipette innholdet i dråpe (unngå bobledannelse) eller ute på tallerken overflate.
- Fyll VTF spissen med neste V1 vask slipp og gjenta aspirasjon av embryo (er). Gjenta en tredje gang og flytte blastocyst (e) til en enkeltperson V1 holding dråpe. De fortynning / vasketrinn bør ta 30 til 45 s. Pre-load hver VTF spissen med neste løsning (f.eks V2), sett pipetten i et rack, og bruke den neste pipette (i henhold til oppsett i trinn 2.1.7) (figur 1B).
Merk: Siden den totale eksponeringstiden i ikke-dimetylsulfoksid (DMSO) som inneholder V1 og V2 løsninger er 5 min hver, pipettering av indito blastocyster skal være jevnt forskjøvet innenfor dette intervallet, med tanke på at den endelige V3 trinnet vil kreve minst 1 min per blastocyst å utføre. For eksempel, hvis det er 4 blastocyster i en forglassing gruppe, pipettes blastocysts # 1-2-3-4 75-s intervaller.
Merk: Innovative Kryotermostater Enterprises (ICE) fortynning protokollen beskrevet ovenfor er tydelig annerledes enn de fleste andre kommersielle forglassing prosedyrer, som vanligvis innebærer DMSO-holdige løsninger. Disse protokollene oppnå de samme trinnvise fortynninger gjennom en gradvis, men mindre kontrollert, sammenslåing av vaskeoppløsning (dvs. isotonisk medium), ES, og VS. - Gjenta trinn 2.3.4 og 2.3.5 ved hjelp av V2 (IS) løsninger.
- Gjenta trinn 2.3.4 og 2.3.5 ved hjelp V3 (VS) løsninger.
- Ved å plassere hver blastocyst i V3 holder dråpe, fjerner rest løsning og bobler fra VTF spissen (utenfor dråpe), og deretter fylle tuppen helt med rent V3 rundt embryo. Expel ca en tredjedel av volumet (1 ul) og pipetter blastocysten (e) og gjenværende V3 helt inn i VTF spiss.
- Fjern VTF tips fra pipetten, tørke tuppen tørre rest V3 på den ytre overflaten ved hjelp av en steril kompress, og sett spissen slutt først inn i den åpne enden av pre-merket halm. En "tørr tip" er avgjørende for å forebygge mulige indre halm tilslutning.
- Snu halm (etikett ende ned), observere tips på indre plugg eller segl, og trygt forsegle den åpne enden med 1 cm luftrom. Bruk fortrinnsvis en automatisk selfangst enhet (f.eks Syms jeg) for å eliminere tekniske variasjon.
Merk: Fordelen ved å bruke sugerør som er sammensatt av en ionomer harpiks plast (f.eks, HSV eller uS-VTF) er det ved hjelp av noen ordentlig-opererte varmeforsegling av enheten oppretter en pålitelig "sveis" forsegling, som nevnt i trinn 2.1.3.1. - Når forseglet, styrter den lukkede halm direkte i LN 2 i en av rustess stål Dewar kolbe og plasser halm (e) til åpen pokal festet til pasientens stokk for lagring.
Merk: Fordi uS-VTF sugerør bruke 40 mm vektede ID stenger for å kompensere for oppdriften av luftfylte halm, til bruk av omvendte kopper eller tomme cryovials dekke prøven (e) er ikke nødvendig med mindre transport er involvert.
- Oppvarming og Cryo-løsning Elution / fortynning
- Bekreft Physicians 'Referral Form om vitrified embryo dato, planlagt tid, og embryo detaljer (nummer å tine / overføring, spesifikk embryo nummeret hvis PGS testet, etc.).
- Klargjør ferske oppvarming løsninger (1,0 M sukrose stamløsning) og / eller bruke en kommersiell kilde (anbefales en uke 1 måned holdbarhet gang i bruk, 4 ° C lagring).
- Delmengde 17,1 g sukrose i 50-ml sterile kolber ved første gangs åpning (f.eks ukentlig tilførsel kilde) på grunn av risikoen for endotoksin opphopning i sukrose granules ved gjentatt ambient eksponering.
- Blande på forhånd veiede granulær sukrose i oppløsning (1,0 M stam = 3,42 g / 10 ml HEPES-bufret human egglederfluid [H-HTF]) og varme opp løsningen til 37 ° C for å øke løseligheten av granulene. Gjentatte ganger snu beholderen for å hjelpe fart opp og fullføre den endelige blanding.
Merk: Filtrering (0,22-mikrometer filter) utføres ved hjelp av positive trykk filtrering enheter er anbefalt for viskøse løsninger (> 0,5 M sukrose) eller høye volumer. Hånd pumper er tilstrekkelig og billig, mens en elektrisk pumpe er støyende, forårsaker vibrasjoner, og er rett og slett ikke nødvendig.
- Varm (37 ° C) en 10-mL rør hver av 1,0 M sukrose-løsning og H-HTF medium pr pasient for uS-VTF oppvarming bad bruk.
- Klargjør ferske tining retter (6-brønns plate) ved merking dekselet overflaten med pasientens navn og løsningen IDer.
Merk: I dette tilfellet har vi brukt: (1) vask T1 (200 μ; L uten olje overlegg, (2) T1 (100 ul) med 1 ml av olje, (3) T2 (100 ul) med olje, (4) T3 (100 ul) med olje, (5) T4 (100 ul) med olje, og (6) T5 / 200 ul isotoniske HEPES-bufret medium med 10% humant serumalbumin (HSA) eller 20% serum erstatning uten olje overlegg. Anvende en universell sukroseløsning nedtrappingsprotokollen-T1 = 1,0 M, T2 = 0,5 M, T3 = 0,25 M, og T4 = 0,125 M-hvis ICE eller en annen kommersiell kilde ikke er tilgjengelig, som foreslått for langsom frosne embryoene 22 . Videre er oppmerksom på at den første T1 vask og de endelige T5 balansene kan utføres i 30-mm petriskåler og den fire-brønners skål som brukes for trinnene 2-5 ovenfor, som omfatter en olje overlegg. - Tine bare en pasients embryo (s) med en gang.
- Sjekk Physicians 'henvisning Form og bekreft syklusen før oppvarming angitt antall (dvs. 1 eller 2 blastocyster); vurdere overlevelse / sannsynlig levedyktighet ved å observere osmotiske endringer (dvs. shrinkage og rehydrering) og intakte membraner, og hvis tvilsom, ta kontakt med lege og / eller pasienten før oppvarming annen blastocyst.
- Bekreft pasient / prøven identifikasjon med en medarbeider (dvs. bevitnet av en sekundær kilde).
- Plasser pasienten stokk i en Dewar kolbe fylt med LN 2 og isolere identifisere halm å bli varmet.
- Ta med 6-brønnen fortynning rett til sentrum av stereo scenen. Å plassere en 60-mm petriskål av på den ene siden (dvs. avhengig av venstre eller høyre preferanse av tekniker), tilsett oppvarmet sukrose (1,0 M) og H-HTF løsninger for å skape en 0,5 M sukrose oppvarming bad (udekket).
Merk: VTF tips er bare varmet i 0,5 M sukrose løsninger som QC sikkerhet, for å sikre oppbevaring av embryo levedyktighet i sjeldne tilfelle at et foster er utvist på rask oppvarming 22. - Hold den øvre halm segl over væskenivåfor å bekrefte identiteten, og deretter ta tak og sikre halmen under den interne pluggen med Mayo saks (den VTF spissen bør fortsatt være neddykket i LN 2).
- Fast trykk saksen på Dewar kolbe (et par ganger) for å fjerne VTF tips fra indre halm veggen som en QC forholdsregel; hvis VTF spissen er adherent, sikrer tappe at spissen basen faller til den forseglede ende motsatt den merkede enden, og dermed gi et luftrom nær pluggenden.
- Løft halm med saksen i luften i en horisontal posisjon (ved siden av eller under stereoskop overflate) og ta tak i ikke-merkede enden (etikett til høyre side). Skjær halm i indre plugg eller forsegle og løft den over oppvarmingen bad parabolen. Hell VTF spissen inn i den varme sukrose bad på en 60 ° vinkel til den er helt ekstrudert og har vært raskt varmet (> 6000 ° C / min); bunnen av flexipette vil hvile over fatet sideveggen.
- La VTF tip til fritt fall i badekaret. Forsiktig på øvre halm overflaten hvis spissen ikke umiddelbart dukke opp. Hvis det bare vises delvis, bistå ved ekstrudering ved å gripe skaftet av flexipette med saks eller fin pinsett.
- Etter 5 - 10 s, forstå pipette base og sette inn et engangs pipettering enhet; et hull i pæren virker til å frigjøre trykket ved innsetting. Dekk pære hullet med en pekefinger og forsiktig klem pære å slippe vitrified blastocyst inn i T1 vask (# 1) mens du ser av stereomikroskopi. Når bekreftet, fjerne rest V3 (VS) løsning og bobler av positivt trykk, evakuere innholdet inn i sentrum, ubrukt kast godt. Start en 5-minutters timer.
Merk: Alle sukrose fortynningstrinn utføres ved romtemperatur (21 ± 2 ° C). - Fjern VTF tips og legg den på en pipette. Fortsett ved å flytte embryoet inn i T1 # 2 under olje for den gjenværende tid (ca. 3-4 min). <ol>
- Hvis en andre blastocyst er nødvendig for overføring, umiddelbart varme opp en andre halm og VTF tips (gjenta trinn 2.4.9 - 2.4.11) fra pasienten før du starter trinn 2.4.12. Bevege begge blastocyster sammen til et minimum eluering i T1 (1,0 M sukrose) på minst 3 min.
- Forhånds fylle flexipette med neste løsning, og deretter flytte og fortynne blastocyst (e) i T2, T3 og T4 på 3-minutters intervaller. Hvis zona pellucida har ikke tidligere blitt laser ablated (dvs. skravert), gjør det i T4. Sett fatet på scenen av en omvendt mikroskop og bilde embryoet på en dataskjerm. Juster zona innenfor et angitt rød sirkel og aktivere 2 eller 3 impulser av en diode laser (begynner på kanten av perivitelline plass og beveger seg utover) for å lage en åpning 2, 19.
- Stabilisere de blastocyster i T5 (dvs. isotonisk medium) i 5 minutter på en varm flate (37 ° C).
- Vurdere første embryo overlevelse basert på den dominerende tilstedeværelse av intakte cellemembraner med enda, gjennomskinnelig cytoplasms blottet for pyknotic mørkere. Plasser embryo (e) i kultur for 2 - 6 timer før embryo, på hvilket tidspunkt, embryo utvikling / overlevelse bør revurderes og dokumentert.
Merk: Hvis det finnes mer enn en levedyktig blastocyst på tidspunktet for overføringen, og pasienten velger å fortsette med bare en blastocyst, supplerende blastocyst kan så vellykket re-vitrified (rVTF) ved å gjenta trinn 2.3.3 - 2.3.11. Vi har flere bekreftede levendefødte etter enkle rVTF hendelser.
Merk: rVTF har blitt eksperimentelt utført opptil 5 ganger uten en betydelig effekt på overlevelse / levedyktighet fremkalle aneuploidi menneskelige blastocysts vitrified i en metastabil glyserol-basert løsning.
Representative Results
1,341 vitrified blastocyster ble varmet mellom 2012 til juni 2014 og 1,341 embryoer gjenvunnet (100%), mens 1316 overlevde (98,1%). Vevsprøve blastocysts opplevd i løpet av 99,5% overlevelse. Ved overføring overveiende single, genetisk testet, euploid, vitrified embryo, var vi i stand til å oppnå noen av de høyeste implantasjon priser og live fødselstall i USA, uavhengig av alder (figur 3) 20, ifølge nyere nasjonal statistikk rapportert av Senter for Disease Control og Society for Assisted Reproductive Technologies (tabell 1 og 2). Vurderer en god prognose pasientpopulasjon (mindre enn 35 år gammel) for cryopreserved sykluser alene (tabell 1), vårt laboratorium gjorde det bedre enn landsgjennomsnittet for begge implantasjon priser (dvs. til effektiviteten av et embryo etablere en graviditet) og til slutt leve fødselsrater med over 30%. I tillegg den første validering / verifisering av våre endrede lagrings sugerør i midten av 2014 ved hjelp av 70 forsknings samtykket, re-vitrified aneuploide blastocysts resulterte i 100% gjenvinning og 100% overlevelse.
Figur 1. MicroSecure VTF Setup. Den VTF fatet (A) er montert med 3 forskjellige rader med forglassing løsninger, som utnytter 3 vaskedråper før plassering i atskilte, nummererte holding dråper. I tillegg er enkelte pipetter med forkortede VTF tips (dvs. 300 mikrometer ID flexipettes) sikret og organisert i en styrofoam tube stativ (B), som kan roteres for velordnet bruk. Merk at en representant disponibel mikropipette pære pipettering montering hviler på styrofoam rack. Arget = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Modifisert Blastocyst Grading System. Vår modifisert Gardner blastocyst karaktersystemet står for den induserte prolaps av TE celler for å lette blastocyst biopsi. Modifikasjonen anser for tidlig klekking av full blastocyster (A: Grad 3 = mindre enn 10% prolaps) og utvidede blastocyster (B: Grad 4 = opp til 50% prolaps), mens en klekking blastocyst (C) har mer enn 50% prolaps 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
54871fig3.jpg "/>
Figur 3. Sammensvangerskapsutfall. Over en kumulativ 1,5-års intervall, ble graviditet data i forhold til å vurdere effekten av overføring av vitrified-varmet euploid blastocyster (n = 172 sykluser / 144 overføringer) sammenlignet med ikke-PGS sykluser (n = 160 sykluser / 153 overføringer) involverer hovedsakelig frisk overfører 18. For våre eksperimentelle formål, disse dataene viser tydelig at biopsied blastocysts vitrified av iS-VTF prosedyre opprettholde sin levedyktighet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Datakilde | # Cycles | Mean # overførte embryoer | Implantasjon Priser (%) | Levende fødselstall (%) |
| NB Lab * | 144 | 1.2 | 74.00% | 74.50% |
| landsgjennomsnittet | 20423 | 1.7 | 39.60% | 44.10% |
| * Data ble i gjennomsnitt basert på 2014 resultatene av Orange County Fertilitet, Southern California Fertility Center og Southern California Senter for Reproductive Medicine klinikker som bruker den aktuelle Ovation Fertility laboratorium (NB Lab), som grunnla microSecure forglassing prosedyren i 2008. | ||||
Tabell 1. 2014 CDC assisterte fertilitets statistikk. Frosne embryo graviditet data for kvinner under 35 år fra tre rapportering lege klinikker som bruker vår NB Lab sammenlignet med USA 2013 landsgjennomsnittet på over 450 rapporterings klinikker.
| SART nasjonale gjennomsnitt | ||||
| Clinic - State | kvinner | kvinner | kvinner | kvinner |
| <35 år | 35-37 år | 38-40 år | 41-42 år | |
| SCCRM-CA * | 63,1% | 58,3% | 40,6% | 32,3% |
| CCRM-CO * | 64,7% | 61,5% | 40,4% | 32,2% |
| RMA-NJ * | 63,2% | 59,7% | 34,6% | 18,7% |
| landsgjennomsnittet | 48,6% | 38,3% | 24,3% | 12,3% |
| SCCRM-Southern California senter for Reproductive Medicine; CCRM-Colorado senter for for Reproductive Medicine; og RMA-Reproductive Medisin Associates | ||||
| * Disse ledende klinikker har alt overveiende implementert vitrified embryo transfer sykluser, i samarbeid med preimplantation genetisk testing, inn i deres standard praksis i pasientbehandlingen for å optimalisere levende fødsel suksess per embryo transplantert. | ||||
Tabell 2. 2014 Akkumulert levende fødselsrater, som rapportert av Society for Assisted Reproductive Technologies (SART), for SCCRM Clinic bruke vår Ovation Fruktbarhet Lab i Newport Beach, CA, i motsetning til flere andre respekterte programmer, så vel som med SART nasjonale gjennomsnitt.
Discussion
I dag er det en stor forventning om å oppnå fullstendig blastocyst overlevelse (> 95%) og å oppnå implantering suksess lik den til friske embryoer. Noen grupper har antydet at de levende fødselsratene vitrified embryo transfer sykluser er kanskje enda høyere enn fersk blastocysts når intakt cryokonservert embryoet er transplantert inn i en sunn, ikke-hormonelt-stimulert livmor. Våre data viser tydelig at forglassing effektivt og pålitelig opprettholder levedyktigheten av den friske embryo. Videre har vi bevist at vår aseptisk, lukket metode, kalt MicroSecure Forglassing (uS-VTF), kan oppnå en optimal resultat sammenlignes med eller større enn de kommersielle standarder (dvs. åpne enhets systemer) som brukes i IVF bransjen.
Variasjon er forbundet med teknisk repeterbarhet og pålitelighet mellom personer som bruker et mangfold av forglassing enheter / metoder. I sin tur, har dette resultert i inconsistencies mellom programmer søker vitrification. Derfor er det ikke overraskende at enheten fortrolighet er en viktig faktor med hensyn laboratorium ferdigheter og vellykkede resultater. Det er dette begrepet "teknisk signatur" 11 som forklarer hvorfor repeterbarhet mellom programmer kan være problematisk. Ikke bare har utviklingen av mer enn et dusin kommersielle enheter komplisert dette fenomenet, er det skapt kvalitetskontroll bekymringer. Heldigvis lukket forglassing systemer, som iS-VTF, Rapid-I, og VitriSafe, blir nå vist seg å være like effektive for å åpne enhetssystemer 12, 13, 14.
MicroSecure VTF er en roman, aseptisk Vitrifisering teknikk utviklet med tekniske problemer, pålitelighet og cryo-sikkerhet i tankene. Ved å kombinere bruken av to tidligere godkjent, FDA-kompatible enheter, er det en ikke-kommersiell vitrification system wed den klare fordelen av å ha en etablert lav pris, i motsetning til spesialiserte enheter. I tillegg har den unike fikle og internalisert tofarget merkeordningen, samt mange andre kvalitetskontroll fordeler, laget iS-VTF en attraktiv global alternativ 11. Som en ikke-kommersiell VTF-enhet, men er utbredt industrien søknad utvikling sakte. Bare gjennom den fortsatte utgivelsen av sin sikkerhet, sikkerhet og klinisk effektivitet vil iS-VTF gevinst økende utnyttelse.
I august 2014, da møtt med manglende evne til å tilegne seg den opprinnelige 0,3-ml embryo halm produsert med en indre, ikke-fukttransporterende hydrofob plugg, kunne vi sikkert endre iS-VTF-metoden. Kort sagt, ble den nye 0,3-ml sæd / embryo sugerør med sine bomull-PVP plugger effektivt tilpasset. Dette ble bare oppnås ved å skape en indre forsegling før bomull pluggen, og dermed hindrer kontakt og væskefukttransporterende medopen-ended VTF tips (dvs. flexipette inneholder embryo eller egg). Videre, hvis 40 mm ID-stenger er ikke tilgjengelig, oppdriften problemet forbundet med de lettere 30 mm stenger kan motvekt ved hjelp av to kulelagre.
Disse ytterligere trinn er gjort teknikken litt mindre enkel, men likevel meget effektiv. I dag, økonomi og effektivitet blir stadig viktige spørsmål, som biopsied blastocysts vanligvis vitrified individuelt inntil deres euploidy status er bekreftet på en genetikk rapport. Blastocyster med en bekreftet ikke-levedyktig Aneuploidy status typisk bli forkastet, med pasientens samtykke, i løpet av uker. Dermed er et flertall (> 50%) av VTF enheter kasseres etter kort tids lagring, forårsaker en eskalerende årlige kostnaden ved bruk av kommersielle enheter. Totalt sett er iS-VTF en svært effektiv, pålitelig og repeterbar prosedyre for nedfrysing av menneskelige blastocyster. Den overlegne kvaliteten-kontroll design securely etiketter og trygt lagrer embryo / ubefruktede egg mens de eliminerer utvinning svikt og optimalisering av post-oppvarming overlevelse og levedyktighet, som rettferdiggjør systemets bruk som en universell tilnærming til embryo forglassing.
Disclosures
MC Schiewe fungerer som et medlem av Scientific Advisory Board for Innovative Kryotermostater Bedrifter og som teknisk direktør i California Cryobank. Produksjon av denne video-artikkelen har blitt betalt av Ovation fruktbarhet. Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske avtaler eller interessekonflikter å avsløre om forglassing av kjønnsceller og embryo.
Acknowledgments
MC Schiewe vil takke Mr. Forest Garner ved Fertility Center of Las Vegas for sin statistisk kompetanse i å analysere og vurdere årlige CDC og SART data. Også forfatterne ønsker å takke sine Medisinsk direktør, Dr. Robert E. Anderson, for hans dedikert støtte og tro på våre tekniske ferdigheter og kompetanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Cane | IVM | XC055 | |
| Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel |
| CBS semen/embryo straw, 0.3 mL | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile |
| Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted |
| Culture tubes, 15 mL | Falcon | 352099 | Conical |
| Culture tubes, 10 mL | Falcon | 352057 | Snap-cap |
| Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | |
| Filter, 250 mL | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm |
| Flasks, Tissue Culture 50 mL | Falcon | 353014 | |
| Flexipettes, 300 μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack |
| Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | |
| Forcep, Splinter - fine | Miltex | 17-305 | |
| Goblet | IVM | PA003 | |
| Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110 V or 220 V with adapter |
| Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100 mL, or | stored at 2 - 8 ºC |
| Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100 mL | with non-essential AA's | |
| Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors |
| Liquid Nitrogen Tank, 40 L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage |
| LN2; Dewar flask, 0.5 L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel |
| 6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case |
| Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex |
| Petri Dishes, 35 mm | Falcon | 351006 | |
| Petri Dishes, 58 mm | Nunc | 150288 | |
| Petri Dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10 - 100 μL |
| Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable |
| Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| Pipettes, Serological 1 mL | Falcon | 357521 | |
| Pipettes, Serological 2 mL | Falcon | 357507 | |
| Pipettes, Serological 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Pipettes, Serological 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | |
| Sterile Gauze pads, 4" x 4" | Kendall Healthcare | 6939 | |
| Synthetic serum | Life Global, or | LGPS-20; 20 mL, or | stored at 2 - 8 ºC |
| Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10 mL | purchase low endotoxin lot | |
| Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50 mL flasks, 1 year; 17.1 g/flask + Medium to 50 mL; makes a 1 M solution; Filter with 0.22 µm unit |
| Timer | Nalgene | 5016-001 | |
| Thawing Solution | Innovative Cryo Enterprises | BL-TS (≤1.0 M Sucrose) | T1, T2, T3, T4; tored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening |
| Vitrification Solution*,** | Innovative Cryo Enterprises | BL-VS (≥7.9 M [Glycerol/EG]) | V1, V2, V3; stored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening |
| * Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | |||
| ** Other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8 M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2 M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. | |||
References
- Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Hum. Reprod. Update. 16, 536-554 (2012).
- Schiewe, M. C., Whitney, J. B., Anderson, R. E. Potential risk of monochorionic dizygotic twin blastocyst formation associated with early laser zona dissection of group cultured embryos. Fertil. Steril. 103, 417-421 (2015).
- Schiewe, M. C. The historic development and incorporation of four assisted reproductive technologies shaping today's IVF industry. J. Fertil. In Vitro Reprod. Med. Genet. 4, 2-9 (2016).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Rall, W. F., Wood, M. J., Kirby, C., Whittingham, D. G. Development of mouse embryos cryopreserved by vitrification. J. Reprod. Fertil. 80, 499-504 (1987).
- Schiewe, M. C., Rall, W. F., Stuart, L. D., Wildt, D. E. Analysis of cryoprotectant, cooling rate and in situ straw dilution using conventional freezing or vitrification for cryopreserving sheep embryos. Theriogenology. 36, 279-293 (1991).
- Lane, M., Schoolcraft, W. B., Gardner, D. Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique. Fertil. Steril. 72, 1073-1078 (1999).
- Mukaida, T., Oka, C., Goto, T., Takahashi, K. Artificial shrinkage of blastocoeles using either a micro-needle or a laser pulse prior to the cooling steps of vitrification improves survival rate and pregnancy outcome of vitrified human blastocysts. Hum. Reprod. 21, 3246-3252 (2006).
- Kuwayama, M., Vatja, G., Ieda, S., Kato, O. Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and elimination of potential contamination. Reprod. Biomed. Online. 11, 608-614 (2005).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Hum. Reprod. 17, 744-751 (2002).
- Schiewe, M. C. Quality control factors influencing the successful and reliable implementation of oocyte and embryo vitrification. Cryopreservation. Marco-Jiménez, F., AkdemirKoç, H. , 1st Ed, InTech. Rijeka, Croatia. (2016).
- Stachecki, J. J., Garrisi, J., Sabino, S., Caetano, J. P. J., Wiemer, K., Cohen, J. A new safe, simple, and successful vitrification method for bovine and human blastocysts. Reprod. Biomed. Online. 17, 360-367 (2008).
- Panagiotidis, Y., et al. Open versus closed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme: a prospective randomized study. Reprod. Biomed. Online. 26, 470-476 (2013).
- Papatheodorou, P., et al. Open versus closed oocyte vitrification system: a prospective randomized study. Reprod. Biomed. Online. 26, 595-602 (2013).
- Schiewe, M. C., Zozula, S., Anderson, R. E., Fahy, G. M. Validation of microSecure vitrification (µS-VTF) for the effective cryopreservation of human embryos and oocytes. Cryobiology. 71, 264-272 (2015).
- Schiewe, M. C. MicroSecure vitrification for oocytes and embryos: optimum simplicity, security and cost and effectiveness combining FDA-approved products. J. Clin. Embryol. 13, 33-51 (2010).
- Rall, W. F. Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification. Cryobiology. 24, 387-402 (1987).
- Seki, S., Mazur, P. Effect of warming rate on the survival of vitrified mouse oocytes and on the recrystallization of intracellular ice. Biol. Reprod. 79, 727-737 (2008).
- Schiewe, M. C. General hygiene and quality control practices in an embryo-production laboratory. Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the Use of Embryo Transfer Technology, Emphasizing Sanitary Precautions. Stringfellow, D. A., Givens, D. , 3rd Ed, International Embryo Transfer Society. Champaign, IL. (2008).
- Whitney, J. B., Nugent, N. L., Anderson, R. E., Schiewe, M. C. Single center validation of routine blastocyst biopsy implementation. J. Asst. Reprod. Genet. , (2016).
- Liebermann, L., Conaghan, J. Artificial collapse prior blastocyst vitrification: improvement of clinical outcomes. J. Clin. Embryol. 16, 107-118 (2014).
- Parmegiani, L., Tatone, C., Cognigni, G. E., Bernardi, S., Troilo, E., Arnone, A., Maccarini, A. M., Di Emidio, G., Vitti, M., Filicori, M. Rapid warming increases survival of slow-frozen sibling oocytes: a step towards a single warming procedure irrespective of the freezing protocol. Reprod Biomed Online. , (2014).
