Abstract
Klinisk embryo förglasning utvecklats med utvecklingen av unika förglasning enheter i 21-talet och med missuppfattningen att ultra-snabb kylning i ett "öppet" system (dvs. direkt LN 2 kontakt) var en nödvändighet för att optimera vitrifiering framgång. Dogmen kring vikten av kylningshastigheter lett till osäkra metoder som är föremål för teknisk variation och till skapandet av förglasning enheter som lämnats utan avseende viktiga kvalitetskontroll faktorer (t.ex., användarvänlighet, repeterbarhet, tillförlitlighet, märkning säkerhet och lagring säkerhet). Förstå kvalitetskontroll brister i andra anordningar tillåts för utvecklingen av en säker, repeterbara och pålitliga iS-VTF metod som syftar till att minimera inom och mellan tekniker variation. Lika viktigt, kombinerat det tillgången på två befintliga FDA-kompatibla enheter: 1) en 0,3-ml jonomerharts embryo halm med internaliseras, dubbel-färgad, manipulera-ptak märkning med repeterbara svetstätning potential; och 2) förkortas vanligt förekommande, 300-um ID sterila flexipettes att direkt ladda embryot (s) för att skapa en mycket effektiv global vitrifiering enhet. Liksom andra aseptisk, stängd förglasning system (t.ex. High Security Förglasning (HSV), Rapid-I, och VitriSafe) effektivt användas i reproduktiv medicin, microSecure Förglasning (iS-VTF) har visat att det kan uppnå hög efter uppvärmningen överlevnad och graviditet utfall med sin uppmärksamhet på enkelhet och minskad teknisk variation. Även embryo halm 0,3 ml innehåller en intern hydrofoba kontakten var kommersiellt ersattes med en standard sperma halm som har bomull polyvinylpyrrolidon (PVP) pluggar, underhålls det dess jonomera hartskomposition för att säkerställa svets tätning. Emellertid kan de bomullsproppar suga ut fluid-embryo innehållet i flexipettes vid kontakt. En modifierad iS-VTF metoden anpassas för att inkludera en ytterligare intern svetstäta innan kontakten på enhetens lastsidan. Den tillsatta tekniska steg i iS-VTF förfarande har inte påverkat dess framgångsrik tillämpning, så höga överlevnad (> 95%) och graviditetsfrekvens fortsätter idag.
Introduction
Förglasning är den enskilt mest effektfulla assisterad befruktning i in vitro-fertilisering (IVF) branschen sedan utvecklingen av intracytoplasmatisk spermieinjektion. Idag, blastocyster är frysförvarade utan förlust i embryo livskraft tidigare i samband med konventionella långsam frysning metoder 1. Med tillförlitlig efter uppvärmningen embryo överlevnad, är infertilitet industrin förvandlas till den föredragna användningen av frysförvarade embryon överföringscykler, som ger liknande eller högre pregnancyutfall än traditionell färsk embryoöverföring. I samband med blastocyst biopsi och preimplantatorisk genetisk screening (PGS) har förglasning blivit en viktig klinisk verktyg för att optimera friska levande födelse resultat via euploid enda embryo 2, 3.
Murin embryo förglasning utvecklades i mitten av 1980-talet 4, 5 och anpassas till djurhållning av 1990 6. Baserat på antagandet att förglasningslösningar bildar ett metastabilt glasseous tillstånd, fritt från skada iskristallbildning, har det visat sig att mer effektivt bevara fullständig cellulär integritet av embryon. Intressant nog gjorde lovande godkännande av förglasning i human embryologi inte börja realiseras förrän 21-talet. Tidiga publikationer som främjar användningen av förglasning sammanföll med utvecklingen av unika "öppna" systemenheter 7, 8, 9. Det var antagandet av vitrifiering i klinisk praxis långsam, eftersom det kom vid en tidpunkt när förbättringar i slow blastocyst frysning också förekommer. Framgångsrik konventionell långsam takt frysning, förutom vitrifiering, var i linje med förbättringar i embryokultursystem, samt med incorporation av blastocoele-kollapsande metoder, som förbättrade både den totala överlevnaden av trophectoderm och därefter implantation 10.
Under det senaste decenniet har förglasning teknik snabbt ersatt konventionella frysningsmetoder. Till stor del berodde detta på utvecklingen av specialiserade förglasning enheter. Vissa av dessa anordningar har handikappade den totala säkerheten, effektiviteten i kliniska förglasning genom att införa inneboende konstruktionsfel till enheter som används i IVF-industrin 11. I själva verket, nyanserna av olika enheter införa betydande teknisk variation mellan programmen, vanligen kallad "tekniska signaturer" 12. Således, vetenskapliga tidskrifter, som Journal of visualiseras experiment (JUPITER), kan fungera som en värdefull resurs för att demonstrera tekniska detaljer, vilket kommer att bidra till att minska resultatet variation. Ett annat pågående problem är att sissa embryologer fortsätter att felinformerad även i dag, baserat på påståenden som "ultra-snabb kylning av embryon eller ägg i en" öppen vitrifiering system "(det vill säga direkt embryo kontakt med flytande kväve (LN 2)) är en förutsättning för att optimera framgångsrika. " Uppenbarligen är denna tro felaktig, baserat på den beprövade framgång aseptiska slutna system 13, 14, 15.
Baserat på de cryobiological principerna för vitrifiering, är effektiviteten för förglasning mer i hög grad beroende uppvärmningen hastigheter än vid kylning satser 16, 17, 18. I allmänhet, oberoende av den förglasning anordningen används, måste uppvärmningshastigheten överstiger kylningshastigheten för att tillförsäkra en hög överlevnadsgrad. Höga uppvärmningen priser minimera möjligheten för någon is tillväxt (dvs Recrystallization av kärn föroreningar i Cryo-lösningar) under glaskristallisation fasen av uppvärmningen. Visst, kan stabiliteten hos förglasningslösning (dvs typen och koncentrationen av kryoskyddsmedel som används) har en förvirrande effekt, men detta behandlas i en separat publikation 11. Med tanke på de avkylnings värmande ränta frågor, var MicroSecure Förglasning (iS-VTF) utvecklades under 2008 som ett billigt, icke-kommersiella, FDA-kompatibel metod som optimerat kvalitetskontroll aspekter av vitrifiering. Det var unikt genom att det erbjuds manipuleringssäker, internaliseras, tvåfärgad märkning. Genom lastning och lagring av embryon direkt i den sterila flexipette används för pipettering (dvs utan pipettering till en sekundär enhet yta) och genom att använda jonomera harts sugrör som helt svetstätningen med en automatiserad sealer, teknisk variation faktiskt har eliminerats.
Vid bedömningen av completeness av förglasning anordningar för potentiell användning, det finns flera kvalitetskontroll faktorer som bör beaktas, inklusive: 1) märkning potentiella -Kan etiketter säkert följas? Är de manipulerings? Har de erbjuder tvåfärgad identifierings potential? Krävs det en sekundär etikett, och kan etiketten enkelt tas bort för journalföring ändamål (dvs. patienten kontroll) efter uppvärmningen? 2) Teknisk lätthet -Kan embryon lätt laddas in / på enheten i tid och enkelt identifieras och spåras efter uppvärmningen? 3) procedur enkelhet / Repeterbarhet -Har vitrifikationsmetoden erbjuda enkelhet och pålitlighet som lätt medger repeterbarhet, vilket minimerar variationen mellan tekniker (interna) och program (extern)? 4) LN två lagringskapacitet -Kan enheterna lätt och säkert hanteras och identifieras? Är deras storasa potentiellt utrymme effektiv? Har enheten erbjuda trygghet och säkerhet från fysiska skador eller eventuella föroreningar som ett aseptiskt slutet system? 5) Återhämtning potential / överlevnads -Är enheten designen benägna att potentiella problem i den garanterade återvinning av embryon, och de kommer att på ett tillförlitligt sätt förglasas och upprätthålla fullständig cellulär integritet efter uppvärmningen? Den senare viss kvalitet oro, återvinningsgraden, har faktiskt överraskande minimeras publicerade rapporter; Detta görs genom att i allmänhet döljer det negativa resultatet (dvs förlorade embryo eller ägg) i typiskt-bra överlevnad. Varje enhet benägna att inkonsekvent återhämtning (<99%) är allvarliga brister och utgör en procedur ansvar.
Vår aseptiska slutna iS-VTF metod har strategiskt utvecklat för att redogöra för varje kvalitetskontrollåtgärd. Men efter 5 års överlägsen klinisk framgång och validering 14 förfarandet hade to ändras. De ursprungliga 0,3-ml embryo sugrör (som har en hydrofob plugg) avlägsnades från IVF industrin och ersattes med en 0,3-ml sperma halm som har en vanlig bomull / PVP plugg (dvs relabeled som sperma / embryon halm). Detta förfarande papper beskriver de specifika åtgärder och strategier som behövs för att genomföra iS-VTF säkert, enkelt och effektivt. Dessutom lyfter vi modifiering (ar) som krävs för att på ett tillförlitligt sätt redogöra för begränsningar försörjnings tills en alternativ ideal halm behållare återinförs tillbaka i det kliniska laboratoriet.
Protocol
Utvecklingen av iS-VTF förfarande genomfördes som en del av en godkänd Institutional Review Board (IRB) studie 2008-2009 (Aspire IRB, Santee, CA) på människors äggcellen och embryo frysförvaring. Förfarandet har sedan dess rutinmässigt appliceras på klinisk behandling av infertilitet patienter som har undertecknat informerat samtycke former.
1. kvalitetskontroll Överväganden
- Använd olika färger (t.ex. pennor, etiketter eller identifiering (ID) stänger eller pluggar) för att särskilja patienter om cryopreserving mer än en grupp av embryon i en dag.
- Använd olika rätter och pipetter för varje patient. Minimera volymen medium som överförs när du flyttar blastocyster från ett lösning till en annan.
- Cryopreserve en blastocysten per halm eller enhet. Bibehålla aseptisk / steril teknik och följa alla säkerhetsföreskrifter.
- Bekräfta Physicians 'Remiss form och undertecknas patientens medgivande innan initiating förfarandena. Kontrollera placeringen av patientens embryo (s) i lager.
- Använd en "Release av ansvar och samtycke för transport" om blastocyster skall överföras till en annan anläggning. Se till att alla signaturer bevittnat plats eller attesterad.
- Bekräfta korrekt kvalitetskontroll åtgärder på medellång och proteintillskott, i förekommande fall, inklusive bioanalyser, endotoxin bestämningar och utgångs / partinummer verifiering och spårning.
- Fastställa kritiska gränsvärden (dvs. låg oro) för klinisk övervakning frysförvaring resultat och utvärdering, såsom återvinningsgrad: <95%, överlevnad: <80%, och kliniska pregnancyhastigheter använder en-euploid blastocyster: <50%.
2. Frysförvaring ordningen
- Förberedelse
- Slutföra lämplig pappersarbete, inklusive mata in data i kalkylblad och frysförvaring databasen och lager log(S).
- Bered färsk frysförvaring lösningar eller använda en kommersiell källa (bestående av tillverkarens rekommenderade lagrings- och hållbarhetstiden förhållanden).
- beredning halm.
- Öppna märkning sidan av individualiserade sterila paket. Lossa fyllningsmunstycket finns på traditionella 0,3 ml embryo halm genom att greppa den mot förpackningen och delvis lyfta och dra halmen ut; detta kommer att utsätta etiketten slut på omgivningsförhållanden medan halmen vilar aseptiskt i plastförpackningen.
- (Modifikation) för 0,3 ml sperma / embryo strån, trycker pluggen ned 0,5 cm. Applicera en inre tätning framför bomulls PVP pluggen genom användning av en grundläggande bords impuls sealer.
- Ställa halmen på Teflon ytan av elektroden, precis framför pluggen. Trycka ned handtaget för att aktivera värmen. Släpp handtaget när den röda lampan visas. För att säkerställa en komplett svetstätning, värme vid en temperatur som är tillräckligt flattens de motsatta ytorna, sedan vänds det 180 ° och återförsluta den motsatta ytan 19 efter behov.
- Öppna märkning sidan av individualiserade sterila paket. Lossa fyllningsmunstycket finns på traditionella 0,3 ml embryo halm genom att greppa den mot förpackningen och delvis lyfta och dra halmen ut; detta kommer att utsätta etiketten slut på omgivningsförhållanden medan halmen vilar aseptiskt i plastförpackningen.
- Med hjälp av en cryomarker, märka varje halm / enhet och cryogoblet med patientens namn, ett unikt id-nummer (t.ex. SSN, DOB, eller patient-ID-nummer), och datum för frysning. Också innehålla ett unikt nummer på varje strå / enhet (t.ex. en, två, tre, etc.).
- Fäst etiketten (helst färgade) på en färg vägda ID stången sättas in och förseglas i en 0,3-ml embryo halm. Återgå halmen till sin individuella sterila förpackningen innan användning.
Obs: Om endast 30-mm färgvägda ID trådar finns, behövs det ytterligare insättning av två kullager, som gränsar till varje sida av ID stången.
- Fäst etiketten (helst färgade) på en färg vägda ID stången sättas in och förseglas i en 0,3-ml embryo halm. Återgå halmen till sin individuella sterila förpackningen innan användning.
- Identifiera varje käpp med ett unikt Dedikerat ID-nummer. Identifiera en LN två lagringstank nummer och en kapsel nummer där varje patients prov (er) kan vara stOR lång sikt.
- Förbered färska kryo rätter (100 mm) genom märkning av bottenytan med patientens namn, lösning ID, och embryo / hålla dropp ID (Figur 1A). Specifikt ställer upp 4 rader av droppar: isotoniska HEPES-buffrat medium (överst), V1 (jämviktslösning (ES)), V2 (tillfällig lösning (IS)), V3 (förglasningslösning (VS), botten). Skriv embryot ID på det övre högra sida med märkta kolumner.
Obs: En serie av 25- till 50-mikroliter tvätta droppar (n = 3) används för att säkerställa att varje enskild slutlig 10- till 15-mikroliter håller droppe / typ lösning (dvs. V1, V2 eller V3) är ren och outspädd. Med hjälp av denna metod, upp till fem enskilda embryon kan med förglasat hjälp av en enda maträtt. Håll varje maträtt täckt när den inte används för att undvika rumstemperatur avdunstning / uttorkning av dropparna. - Förbered sterila flexipettes genom att skära 3 cm från sin basände (kallad "VTF tips"). Sätt dem på individuellpipetter (inställda på 3 mikroliter) och ställ in pipett-VTF tips upprätt i en styrofoam provrörsställ (Figur 1B).
- embryo Selection
- Bekräfta patient / providentifiering.
- Med ett inverterat mikroskop (200 - 400X förstoring), kvalitet och klassificera blastocyster enligt Gardner betygssystemet 20, med hjälp av en numerisk klassificering av 1-6 för tidigt att kläckta blastocyster, respektive, och ett A, B, eller C klass tilldelas till den inre cellmassan (ICM) och trophectoderm (TE).
Obs: Som förberedelse för blastocyst biopsi och euploidy analys, är zona pellucida pre-kläckts genom laserablation Dag 3 för att främja den tidiga diskbråck i TE och kräver därför en modifierad gradering klassificering 2. I korthet, grad 3 fulla blastocyster uppvisar upp till 10% TE diskbråck, graderar fyra expanderade blastocyster är 10 - 50% kläckts och graderar 5 kläckning blastocyster har> 50% TE extrusion (Figur 2A-C).
Obs: Vi föredrar att cryopreserve grad 3 eller högre blastocyster av ≥BB kvalitet på dag 5 eller 6. Emellertid förglasade blastocyster av lägre kvalitet (C) och efter kompakte embryon i ett tidigare skede (inklusive sen morula till grad 1 eller 2 blastocyster ) kan säkert överleva uppvärmningen helt intakt och ger livskraftiga embryon kan uppnå en levande födda. - Kollapsa den blastocoele av varje blastocyst före debuten av cryodilution processen genom micropuncturing en trophectoderm korsning eller genom att utföra en laserpuls ablation av en trophectodermal cell 21 om man använder låg molaritet förglasningslösningar (<6,5 M eller 40% volym / volym).
Obs: Behovet av att komprimera blastocyster är inte enheten beroende. I vår egen tidiga utvecklingen av iS-VTF (2008), vi användes ursprungligen etylenglykol (EG) / DMSO-lösningar framgångsrikt med äggceller (1 av 1 fullgången graviditet), men en suboptimal (<80%)överlevnad / utveckling av mus blastocyster 16 upplevdes av andra 21. Eftersom höga molära glycerol baserade lösningar (över 7,9 M) används i vårt nuvarande VTF systemet (sedan 2009), är fysisk blastocoele kollaps onödig. Emellertid är den selektiva kläckning kläckta blastocyster tillrådligt i allmänhet.
- Cryodilution och Blastocyst Loading
- Avlägsna patienten odlingsskålen från inkubatorn och bekräfta patient / providentifiering med en annan person (dvs bevittnades av en sekundär källa) innan du tar bort embryot (s) som skall förglasas.
- Bekräfta blastocyst utveckling per steg 2.2.2, uppdatera kryo bladet, och under stereomikroskopi, pipett blastocyst (s) från odlingsskålen i en isoton håll droppe av Cryo skålen.
- Flytta varje blastocyst i enskilda innehav droppar med hjälp av vitrifiering flexipette (dvs VTF spets).
- flytta varjeblastocyst in V1 (ES) lösning.
- Prefill den flexipette med V1-lösning (3 mikroliter) och placera hälften av innehållet på embryot.
- Aspirera embryot och flytta till den första av tre V1 tvätta droppar (som avses i steg 2.1.6), pipett embryot 2 - 3 gånger runt omkretsen, och rensa pipett innehållet i droppen (undvika bubbelbildning) eller ute på diskytan.
- Fylla VTF spetsen med nästa V1 tvätt droppe och upprepa aspiration av embryot (s). Upprepa en tredje gång och flytta blastocyst (er) till en individ V1 håll droppe. Utspädnings / tvättsteg bör ta 30 till 45 s. Förbelastning varje VTF spets med nästa lösning (t.ex. V2), för in pipetten i ett rack, och använda nästa pipett (enligt inställningen i steg 2.1.7) (Figur 1B).
Observera: Eftersom den totala exponeringstiden i icke-dimetylsulfoxid (DMSO) innehållande V1 och V2-lösningar är 5 min vardera, pipetteringen av indidubbla blastocyster bör vara jämnt fördelas inom detta intervall, med tanke på att det slutliga V3 steget kommer att kräva minst en minut per blastocyst att utföra. Till exempel, om det finns 4 blastocyster i en vitrifiering grupp, pipett blastocyster # 1-2-3-4 på 75-s intervaller.
Obs! Innovative Cryo Enterprises (ICE) utspädning protokoll som beskrivits ovan är klart annorlunda än de flesta andra kommersiella förglasning förfaranden, som i allmänhet innebär DMSO-lösningar. Dessa protokoll uppnå samma stegspäd genom en gradvis, men mindre kontrollerad, sammanslagning av tvättlösning (dvs isotont medium), ES, och VS. - Upprepa steg 2.3.4 och 2.3.5 med användning av V2 (IS) lösningar.
- Upprepa steg 2.3.4 och 2.3.5 med användning av V3 (VS) lösningar.
- Vid placera varje blastocyst i V3 håller droppen, rensa kvarvarande lösningen och bubblor från VTF spets (utanför droppen), och sedan fylla spetsen helt med ren V3 runt embryot. expel cirka en tredjedel av volymen (1 mikroliter) och pipet blastocysten (s) och den återstående V3 helt i VTF spetsen.
- Avlägsna VTF spetsen från pipetten, torka spetsen torr av resterande V3 på den yttre ytan med hjälp av en steril kompress och sätt spetsen, först i den öppna änden av pre-märkta halm. En "torr tips" är avgörande för att förhindra eventuella inre halm följsamhet.
- Invertera halmen (etikettänden nedåt), observera spetsen vid den inre pluggen eller tätning, och säkert försluta den öppna änden med 1 cm av luftrummet. Företrädesvis använda en automatisk tätningsanordning (t.ex. Syms I) för att eliminera tekniska variation.
Obs: Fördelen med att använda sugrör som består av en jonomerharts plast (t.ex. HSV eller iS-VTF) är att använda någon korrekt driven värmeförseglingsanordningen skapar en pålitlig "svets" sigill, som noterades i steg 2.1.3.1. - När förseglade, störta den slutna halm direkt i LN 2 i en rostfritt sess stål Dewar-kolv och placera sugröret (er) i den öppna bägare fäst till patientens sockerrör för lagring.
Obs: Eftersom iS-VTF sugrör använder 40 mm viktade ID stavar för att kompensera flytkraft av luftfyllda halm, användning av inverterade pokaler och tomma cryovials täcka provet (s) krävs inte om transporter är involverade.
- Uppvärmningen och Cryo-lösning Eluering / Utspädning
- Bekräfta Physicians 'remissen om förglasat embryoöverföring datum, schemalagd tid, och embryo detaljer (antal tina / överföring, specifik embryonummer om PGS testas etc.).
- Bered färsk uppvärmningen lösningar (1,0 M sackaros stamlösning) och / eller använda en kommersiell källa (rekommenderas en vecka-1 månads hållbarhet när de används, 4 ° C lagring).
- Alikvotera 17,1 g sackaros i 50-ml sterila flaskor vid inledande öppning (t.ex. veckovis källa) på grund av risken för endotoxin ackumulering i sackaros graNules vid upprepad omgivnings exponering.
- Blanda förvägt granulär sackaros i lösning (1,0 M stam = 3,42 g / 10 ml HEPES-buffrad humant äggledarna fluid [H-HTF]) och värma lösningen upp till 37 ° C för att öka lösligheten av granulerna. Upprepade gånger vända behållaren för att påskynda och slutföra den sista blandningen.
Notera: Filtrering (0,22-pm filter) utfördes med användning av positiva tryckfiltreringsenheter rekommenderas för viskösa lösningar (> 0,5 M sackaros) eller stora volymer. Hand högtryckspumpar är tillräckliga och billigt, medan en elektrisk pump är bullriga, orsakar vibrationer, och är helt enkelt inte behövs.
- Varm (37 ° C) en 10-ml rör var och en av 1,0 M sackaroslösning och H-HTF-medium per patient för iS-VTF uppvärmningen bad användning.
- Förbered färska upptinings rätter (6-brunnar) genom märkning täckytan med patientens namn och lösningen ID.
Obs: I det här fallet använde vi: (1) T1 tvätt (200 μ; L utan olje overlay, (2) T1 (100 mikroliter) med 1 ml av olja, (3) T2 (100 mikroliter) med olja, (4) T3 (100 mikroliter) med olja, (5) T4 (100 | il) med olja, och (6) T5 / 200 mikroliter isotoniska HEPES-buffrat medium med 10% humant serumalbumin (HSA) eller 20% serumsubstitut utan oljeöverlagring. Applicera en universell sackaroslösning step-down protokoll T1 = 1,0 M, T2 = 0,5 M, T3 = 0,25 M, och T4 = 0,125 M-om ICE eller annan kommersiell källa är inte tillgänglig, som föreslås för långsamt frysta embryon 22 . Vidare noterar att den första T1 tvätt och slut equilibrations T5 kan utföras i 30-mm petriskålar och 4 brunnar skålen används för steg 2-5 ovan, med ett oljelagring. - Tina endast en patients embryo (n) i taget.
- Kontrollera Physicians 'Remiss form och bekräfta cykeln innan värmer det angivna antalet (dvs 1 eller 2 blastocyster); utvärdera överlevnad / troliga lönsamhet genom att observera osmotiska förändringar (dvs, SHRinkage och rehydrering) och oskadade hinnor, och, om tveksamt, kontakta läkaren och / eller patienten innan uppvärmningen annan blastocyst.
- Bekräfta patient / providentifiering med en medarbetare (dvs bevittnades av en sekundär källa).
- Placera patienten sockerrör i en Dewar-kolv fylld med LN 2 och isolera identifiera halmen värmas.
- Bringa 6-brunnars utspädnings skålen till centrum av stereomikroskop steget. Placera en 60 mm petriskål åt sidan (dvs beroende på den vänstra eller högra föredrar teknikern), tillsätt värmde sackaros (1,0 M) och H-HTF lösningar för att skapa en 0,5 M sackaros uppvärmningen bad (upptäckt).
Obs: VTF tips bara värmas i 0,5 M sackaros lösningar som QC skydd, för att säkerställa bevarandet av embryon livskraft i de sällsynta fall då ett embryo ut på snabb uppvärmning 22. - Håll den övre halm tätningen ovanför vätskenivånatt bekräfta identiteten och sedan ta tag och säkra halmen nedanför den inre kontakten med hjälp av Mayo sax (den VTF spetsen bör ändå vara nedsänkt i LN 2).
- Knacka saxen på Dewar kolven (ett par gånger) för att avlägsna VTF spets från inner halm sidovägg som en QC försiktighetsåtgärd; om VTF tips är vidhäftande, säkerställer tapp att spetsen basen sjunker till den förseglade änden motsatt den märkta änden, vilket ger ett luftutrymme nära kontakten slut.
- Lyfta halm med saxen till omgivningsluften i ett horisontellt läge (bredvid eller under stereoskop ytan) och ta tag i icke-märkta änden (etikett på höger sida). Skär halm vid den inre kontakten eller täta och lyfta den över uppvärmningen bad skålen. Häll VTF spetsen i den varma sackaros bad vid en 60 ° vinkel tills den är helt extruderade och har snabbt värms (> 6000 ° C / min); basen av flexipette kommer att vila ovanför skålen sidovägg.
- Låt VTF tip att falla fritt i badet. Knacka försiktigt på övre halm yta om spetsen inte omedelbart fram. Om det endast visas delvis, bistå vid extruderingen genom att greppa skaftet på flexipette med sax eller fin pincett.
- Efter 5 - 10 sekunder, ta tag pipetten bas och sätt in en engångspipetteringsanordning; ett hål i kolven verkar för att minska trycket vid införande. Täck lampan hålet med en pekfingret och försiktigt pressa lampan för att frigöra förglasade blastocysten i T1 tvätt (# 1) medan du tittar genom stereomikroskopi. När bekräftade, rensa rest V3 (VS) lösning och bubblor av övertryck, evakuera innehållet i centrum oanvända kasse väl. Starta en 5-minuterstimer.
Obs: Alla sackaros utspädnings steg utförs vid rumstemperatur (21 ± 2 ° C). - Ta VTF spets och placera den på en pipett. Fortsätt genom att flytta embryot till T1 # 2 under olje för återstående tid (ca 3-4 min). <ol>
- Om en andra blastocyst krävs för överföring omedelbart värma en andra halm och VTF spets (steg 2.4.9 upprepa - 2.4.11) från patienten innan behandling steg 2.4.12. Flytta båda blastocyster tillsammans i minst eluering i T1 (1,0 M sackaros) av minst 3 min.
- Pre-fylla flexipette med nästa lösning, och sedan flytta och späd blastocyst (s) i T2, T3 och T4 på 3-minuters intervall. Om zona pellucida har inte tidigare laser ablation (dvs kläckt), gör det i T4. Placera skålen på scenen av ett inverterat mikroskop och bild embryot på en datorskärm. Rikta in zona inom en angiven röd cirkel och aktivera 2 eller 3 impulser av en diodlaser (med början vid kanten av perivitellina utrymme och flytta utåt) för att skapa en öppning 2, 19.
- Jämvikta blastocysterna i T5 (dvs., isotont medium) under 5 min på en varm yta (37 ° C).
- Utvärdera den inledande embryot överlevnad bygger på den dominerande närvaron av intakta cellmembran med ens, genomskinliga cytoplasmor saknar pyknotiska mörknar. Placera embryot (s) till kultur för 2 - 6 h före embryoöverföring, vid vilken tidpunkt den embryoutveckling / överlevnad bör åter utvärderas och dokumenteras.
Obs: Om mer än en livskraftig blastocyst föreligger vid tidpunkten för överföringen och patienten väljer att fortsätta med endast en blastocyst, det kompletterande blastocysten kan sedan framgångsrikt åter förglasat (rVTF) genom att upprepa steg 2.3.3 - 2.3.11. Vi har flera bekräftade levande födda efter enstaka rVTF händelser.
Obs: rVTF har experimentellt utföras upp till 5 gånger utan någon signifikant effekt på överlevnaden / livskraft aneuploidi mänskliga blastocyster keramiskt i en metastabil glycerolbaserad lösning.
Representative Results
1.341 keramiskt blastocyster värmdes mellan 2012 till juni 2014 och 1,341 embryon återvinns (100%), medan 1316 överlevde (98,1%). Biopsier blastocyster upplevt under 99,5% överlevnad. Vid överföring av övervägande enda genetiskt testat, euploid, förglasade embryon, kunde vi uppnå några av de högsta implantation priser och levande födelsetalen i USA, oberoende av ålder (Figur 3) 20, enligt de senaste nationell statistik som rapporterats av Centrum for Disease Control och Society for Assisted Reproductive Technologies (tabell 1 och 2). Utvärdera en god prognos patientgrupp (mindre än 35 år gamla) för enbart frysförvarade cykler (tabell 1), vårt laboratorium bättre än riksgenomsnittet för både implantation priser (dvs effektivitet ett embryo att etablera en graviditet) och slutligen leva födelsetal med mer än 30%. Dessutom, den första valideringen / verifiering av våra modifierade lagrings sugrör i mitten av 2014 med hjälp av 70 forskningsgodkänd, åter keramiskt aneuploida blastocyster resulterade i 100% återvinning och 100% överlevnad.
Figur 1. MicroSecure VTF Setup. Den VTF skålen (A) monteras med 3 olika rader av förglasningslösningar, som utnyttjar 3 tvätt droppar innan placering i skilda, numrerade håll droppar. Dessutom är individuella pipetter med förkortade VTF tips (dvs 300 pm ID flexipettes) säkrad och organiseras på ett styrofoam provrörsställ (B), som kan roteras för ordnad användning. Observera att en representativ engångs mikropipett glödlampa pipettering enheten vilar på frigolit rack. Arget = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Modifierad Blastocyst betygssystemet. Vår modifierad Gardner blastocyst betygssystemet svarar för den inducerade herniation av TE-celler för att underlätta blastocyst biopsi. Modifieringen anser tidig kläckning av fulla blastocyster (A: grad 3 = mindre än 10% diskbråck) och expanderade blastocyster (B: Grade 4 = upp till 50% herniation), medan en kläckning blastocyst (C) har mer än 50% herniation 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
54871fig3.jpg "/>
Figur 3. Jämförande pregnancyutfall. Över en kumulativ 1,5 års mellanrum, var graviditetsdata jämföras för att bedöma effekterna av överföring av keramiskt värmas euploid blastocyster (n = 172 cykler / 144 överföringar) jämfört med icke-PGS cykler (n = 160 cykler / 153 överföringar) omfattar huvudsakligen färsk överför 18. För våra experimentsyfte, visar tydligt dessa data att biopsier blastocyster förglasats av iS-VTF förfarande behålla sin livskraft. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Datakälla | # Cykler | Genomsnittlig # av embryon | Implantation priser (%) | Live födelsetalen (%) |
| NB Lab * | 144 | 1,2 | 74,00% | 74,50% |
| Nationella genomsnittet | 20423 | 1,7 | 39,60% | 44,10% |
| * Data genomsnitt baserat på 2014 prestanda Orange County Fertilitet, Southern California Fertilitets Center och Southern California Center for Reproductive Medicine kliniker som använder den aktuella Ovation Fertilitets laboratorium (NB Lab) som grundade microSecure vitrifiering förfarandet 2008. | ||||
Tabell 1. 2014 CDC Assisted Reproductive statistik. Frysta embryo graviditet data för kvinnor under 35 år gammal från tre rapporterar läkare kliniker som använder vår NB Lab jämfört med USA 2013 nationella genomsnittet av över 450 rapporterings kliniker.
| SART riksgenomsnitten | ||||
| Clinic - State | Kvinnor | Kvinnor | Kvinnor | Kvinnor |
| <35 år | 35-37 yrs | 38-40 yrs | 41-42 yrs | |
| SCCRM-CA * | 63,1% | 58,3% | 40,6% | 32,3% |
| CCRM-CO * | 64,7% | 61,5% | 40,4% | 32,2% |
| RMA-NJ * | 63,2% | 59,7% | 34,6% | 18,7% |
| Nationella genomsnittet | 48,6% | 38,3% | 24,3% | 12,3% |
| SCCRM-Southern California Center for Reproductive Medicine; CCRM-Colorado Centrum för för Reproductive Medicine; och RMA-Reprodtiv Medicine Associates | ||||
| * Dessa ledande kliniker har alla övervägande genomfört förglasat embryo överföringscykler, i förening med preimplantatorisk genetisk testning, i sin praxis på patientvård för att optimera levande födda framgång per embryo transplanteras. | ||||
Tabell 2. 2014 Ackumulerade levande födelsetal, som rapporterats av Society for Assisted Reproductive Technologies (SART), för SCCRM Clinic använder vår Ovation Fertilitet Lab i Newport Beach, Kalifornien, i motsats till flera andra respekterade program, liksom med SART nationella genomsnittet.
Discussion
Idag finns det en hög förväntan att uppnå fullständig blastocysten överlevnad (> 95%) och att uppnå implantation framgång som liknar den färska embryon. Vissa grupper har föreslagit att de levande födelsetalen av keramiskt embryoöverföring cykler är kanske ännu högre än färska blastocyster när den intakta frysförvarade embryot transplanteras in i en frisk, icke-hormonellt stimulerade livmoder. Våra data visar tydligt att förglasning effektivt och tillförlitligt upprätthåller livskraft färska embryon. Dessutom har vi visat att vår aseptiska, sluten metod, som kallas MicroSecure Förglasning (iS-VTF), kan uppnå optimala resultat är jämförbar med eller högre än de kommersiella standarder (dvs öppna enhetssystem) som används i IVF industrin.
Variation är förknippad med teknisk repeterbarhet och tillförlitlighet mellan personer som använder en mängd förglasning enheter / metoder. I sin tur har detta resulterat i inconsistencies mellan program tillämpar förglasning. Därför är det inte förvånande att enheten förtrogenhet är en viktig faktor när det gäller laboratoriekompetens och goda resultat. Det är detta koncept med "teknisk signatur" 11 som förklarar varför repeterbarhet mellan program kan vara problematiskt. Inte bara har utvecklingen av mer än ett dussin kommersiella enheter komplicerat detta fenomen, har det skapat kvalitetskontroll oro. Lyckligtvis stängd förglasning system, som iS-VTF, Rapid-I, och VitriSafe, nu visat sig vara lika effektiv för att öppna enhetssystem 12, 13, 14.
MicroSecure VTF är en roman, aseptisk förglasning teknik som utvecklats med tekniska lätthet, tillförlitlighet och kryo-säkerhet i åtanke. Genom att kombinera användningen av två tidigare godkända, FDA kompatibla enheter, är det en icke-kommersiell vitrifiering systemet wed den klara fördelen av att ha en etablerad låg kostnad, i motsats till specialiserade enheter. Dessutom har dess unika manipulerings och intern systemet tvåfärgad märkning, liksom många andra kvalitetskontroll fördelar gjort iS-VTF en attraktiv global alternativ 11. Som en icke-kommersiell VTF anordning är emellertid dess utbredda industriell tillämpning utvecklas långsamt. Endast genom fortsatt publicering av dess säkerhet, säkerhet och klinisk effektivitet kommer iS-VTF vinst växande utnyttjande.
I augusti 2014, när man står inför oförmågan att förvärva den ursprungliga 0,3 ml embryo halm tillverkas med en inre, icke transporterande hydrofoba kontakten, kunde vi på ett tillförlitligt sätt modifiera iS-VTF metoden. Kort sagt, var de nya 0,3-ml sperma / embryo strån med sina bomulls PVP pluggar effektivt anpassas. Detta var helt enkelt uppnås genom att skapa en inre tätning före bomullsplugg, vilket förhindrar kontakt och vätsketransporterande medöppen VTF spets (dvs flexipette innehåller embryot eller ägg). Dessutom, om 40 mm ID stavar inte är tillgängliga, flyt frågan i samband med de ljusare 30 mm stavar kan counterweighted med två kullager.
Dessa ytterligare steg har gjort tekniken något mindre enkel, men ändå mycket effektivt. Idag, ekonomi och effektivitet blir allt viktigare problem, som biopsier blastocyster vanligtvis förglasat individuellt tills deras euploidy status bekräftas på en genetik rapport. Blastocyster med en bekräftad icke livskraftiga aneuploidi status vanligtvis får kasseras med patientens medgivande, inom några veckor. Således är en majoritet (> 50%) av VTF enheter kasseras efter kort tids förvaring, vilket orsakar en eskalerande årlig kostnad vid användning av kommersiella enheter. Totalt sett är iS-VTF en mycket effektiv, pålitlig och repeterbar förfarande för kryokonservering av humana blastocyster. Den överlägsna kvalitetskontroll konstruktion securely etiketter och säkert lagrar embryon / ägg samtidigt som man eliminerar återhämtning fel och optimera efter uppvärmningen överlevnad och lönsamhet, vilket motiverar systemets användning som en universell metod för embryo förglasning.
Disclosures
MC Schiewe fungerar som en medlem av den vetenskapliga råd till innovativa Cryo företag och som teknisk direktör till California Cryobank. Produktionen av denna video-artikeln har betalats av Ovation fertilitet. Författarna har inga konkurrerande finansiella avtal eller intressekonflikter för att avslöja om vitrifiering av könsceller och embryon.
Acknowledgments
MC Schiewe vill tacka Mr Forest Garner vid Fertilitetscentrum i Las Vegas för hans statistisk expertis i att analysera och utvärdera årliga CDC och SART uppgifter. Även författarna vill tacka sin Medical Director, Dr Robert E. Anderson, för hans hängivna stöd och tro på vår tekniska kompetens och expertis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum Cane | IVM | XC055 | |
| Ball bearings, 3/32" | VXB.com | KIT15977 | stainless steel |
| CBS semen/embryo straw, 0.3 mL | CryoBioSystems | 25292 | individual sterile |
| Color, ID rods, 30 mm | CryoBioSystems | 019021-26 | weighted |
| Culture tubes, 15 mL | Falcon | 352099 | Conical |
| Culture tubes, 10 mL | Falcon | 352057 | Snap-cap |
| Cryosleeves | Nalgene | 5016-001 | |
| Filter, 250 mL | Fisher Sci. | 09-740-2A | 0.22 μm |
| Flasks, Tissue Culture 50 mL | Falcon | 353014 | |
| Flexipettes, 300 μm ID | Cook Med. | K-FPIP-1300-10BS-5 | Sterile, 20/pack |
| Forcep, Large | Miltex | 6-30TC | |
| Forcep, Splinter - fine | Miltex | 17-305 | |
| Goblet | IVM | PA003 | |
| Heat Sealer, SYMS 1 | CryoBioSystems | 16399 | 110 V or 220 V with adapter |
| Hepes-buffered media | Life Global or | LGGH-100; 100 mL, or | stored at 2 - 8 ºC |
| Irvine Scientific | H-HTF; 90126; 100 mL | with non-essential AA's | |
| Labels, Cryo | GA International | CL-23T1 | Various colors |
| Liquid Nitrogen Tank, 40 L | MVE or Taylor Warton | various | liquid storage |
| LN2; Dewar flask, 0.5 L | Hampton Research | HR4-695 | Stainless steel |
| 6-well Custer Dishes | Biogenics | 015/020 | plasticware by case |
| Pipette Bulb, Micro Cap | Drummond | Fisher#13681451 | Hole on bulb apex |
| Petri Dishes, 35 mm | Falcon | 351006 | |
| Petri Dishes, 58 mm | Nunc | 150288 | |
| Petri Dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Pipette Tips, ART long | Fisher Sci. | 02-707-80 | 10 - 100 μL |
| Pipet Aid | Drummond or Falcon | various | rechargeable |
| Pipetting Device, Stripper | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| Pipettes, Serological 1 mL | Falcon | 357521 | |
| Pipettes, Serological 2 mL | Falcon | 357507 | |
| Pipettes, Serological 5 mL | Falcon | 357543 | |
| Pipettes, Serological 10 mL | Falcon | 357551 | |
| Scissors, Surgical Mayo | Miltex | 5-SC-16 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Olympus, Leica | various | |
| Sterile Gauze pads, 4" x 4" | Kendall Healthcare | 6939 | |
| Synthetic serum | Life Global, or | LGPS-20; 20 mL, or | stored at 2 - 8 ºC |
| Irvine Scientific | SS-99193; 12 x 10 mL | purchase low endotoxin lot | |
| Sucrose | Sigma Chemical Co. | #S9378 | Aliquot into 50 mL flasks, 1 year; 17.1 g/flask + Medium to 50 mL; makes a 1 M solution; Filter with 0.22 µm unit |
| Timer | Nalgene | 5016-001 | |
| Thawing Solution | Innovative Cryo Enterprises | BL-TS (≤1.0 M Sucrose) | T1, T2, T3, T4; tored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening |
| Vitrification Solution*,** | Innovative Cryo Enterprises | BL-VS (≥7.9 M [Glycerol/EG]) | V1, V2, V3; stored at 2 - 8 ºC for ≤1 month after opening |
| * Non-permeating cryoprotective additives may include: sucrose, ficoll and sodium hyaluronate | |||
| ** Other commercial preparations are typically ethylene glycol (EG)/dimethyl sulfoxide (DMSO; 30% v/v; 4.8 M), but could be EG/propylene glycol (32% v/v; 5.2 M). Mixed solutions are typically used to reduce cryo-toxicity concerns of a high molar solution. Commercial solutions typically include an ES and VS solution. The formulation of commercial preparation is typically proprietary property. | |||
References
- Edgar, D. H., Gook, D. A. A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos. Hum. Reprod. Update. 16, 536-554 (2012).
- Schiewe, M. C., Whitney, J. B., Anderson, R. E. Potential risk of monochorionic dizygotic twin blastocyst formation associated with early laser zona dissection of group cultured embryos. Fertil. Steril. 103, 417-421 (2015).
- Schiewe, M. C. The historic development and incorporation of four assisted reproductive technologies shaping today's IVF industry. J. Fertil. In Vitro Reprod. Med. Genet. 4, 2-9 (2016).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Rall, W. F., Wood, M. J., Kirby, C., Whittingham, D. G. Development of mouse embryos cryopreserved by vitrification. J. Reprod. Fertil. 80, 499-504 (1987).
- Schiewe, M. C., Rall, W. F., Stuart, L. D., Wildt, D. E. Analysis of cryoprotectant, cooling rate and in situ straw dilution using conventional freezing or vitrification for cryopreserving sheep embryos. Theriogenology. 36, 279-293 (1991).
- Lane, M., Schoolcraft, W. B., Gardner, D. Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique. Fertil. Steril. 72, 1073-1078 (1999).
- Mukaida, T., Oka, C., Goto, T., Takahashi, K. Artificial shrinkage of blastocoeles using either a micro-needle or a laser pulse prior to the cooling steps of vitrification improves survival rate and pregnancy outcome of vitrified human blastocysts. Hum. Reprod. 21, 3246-3252 (2006).
- Kuwayama, M., Vatja, G., Ieda, S., Kato, O. Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and elimination of potential contamination. Reprod. Biomed. Online. 11, 608-614 (2005).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Hum. Reprod. 17, 744-751 (2002).
- Schiewe, M. C. Quality control factors influencing the successful and reliable implementation of oocyte and embryo vitrification. Cryopreservation. Marco-Jiménez, F., AkdemirKoç, H. , 1st Ed, InTech. Rijeka, Croatia. (2016).
- Stachecki, J. J., Garrisi, J., Sabino, S., Caetano, J. P. J., Wiemer, K., Cohen, J. A new safe, simple, and successful vitrification method for bovine and human blastocysts. Reprod. Biomed. Online. 17, 360-367 (2008).
- Panagiotidis, Y., et al. Open versus closed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme: a prospective randomized study. Reprod. Biomed. Online. 26, 470-476 (2013).
- Papatheodorou, P., et al. Open versus closed oocyte vitrification system: a prospective randomized study. Reprod. Biomed. Online. 26, 595-602 (2013).
- Schiewe, M. C., Zozula, S., Anderson, R. E., Fahy, G. M. Validation of microSecure vitrification (µS-VTF) for the effective cryopreservation of human embryos and oocytes. Cryobiology. 71, 264-272 (2015).
- Schiewe, M. C. MicroSecure vitrification for oocytes and embryos: optimum simplicity, security and cost and effectiveness combining FDA-approved products. J. Clin. Embryol. 13, 33-51 (2010).
- Rall, W. F. Factors affecting the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification. Cryobiology. 24, 387-402 (1987).
- Seki, S., Mazur, P. Effect of warming rate on the survival of vitrified mouse oocytes and on the recrystallization of intracellular ice. Biol. Reprod. 79, 727-737 (2008).
- Schiewe, M. C. General hygiene and quality control practices in an embryo-production laboratory. Manual of the International Embryo Transfer Society: A Procedural Guide and General Information for the Use of Embryo Transfer Technology, Emphasizing Sanitary Precautions. Stringfellow, D. A., Givens, D. , 3rd Ed, International Embryo Transfer Society. Champaign, IL. (2008).
- Whitney, J. B., Nugent, N. L., Anderson, R. E., Schiewe, M. C. Single center validation of routine blastocyst biopsy implementation. J. Asst. Reprod. Genet. , (2016).
- Liebermann, L., Conaghan, J. Artificial collapse prior blastocyst vitrification: improvement of clinical outcomes. J. Clin. Embryol. 16, 107-118 (2014).
- Parmegiani, L., Tatone, C., Cognigni, G. E., Bernardi, S., Troilo, E., Arnone, A., Maccarini, A. M., Di Emidio, G., Vitti, M., Filicori, M. Rapid warming increases survival of slow-frozen sibling oocytes: a step towards a single warming procedure irrespective of the freezing protocol. Reprod Biomed Online. , (2014).
