Introduction
توفر الحصانة الفطرية على السطر الأول الفوري للدفاع ضد العدوى والأمراض في مجموعة واسعة من الكائنات الحية. ليس فقط أنه يبدأ الاستجابة المناعية الأولية للقضاء على التهديد، ولكنه أيضا يلعب دورا محوريا في تفعيل وتثقيف حصانة التكيفية التي تنفذ الاستجابات المناعية الثانوية بطريقة الممرض محددة. ومدبرة التهاب مجموعة كبيرة من السيتوكينات و chemokines، والتي بدورها لديها القدرة على جذب الخلايا المناعية الأخرى إلى موقع الإصابة وللحث على علامات رئيسية من التهاب، مثل احمرار، تورم، ألم، وفقدان الوظيفة، والحمى . مدة وشدة الالتهاب تعتمد على عدة عوامل، ولكن حل الالتهاب واستعادة التوازن هو خطوة حاسمة لتجنب ظهور الأمراض الالتهابية المزمنة. وقد تكشفت التطورات الحديثة في مجال علم الأعصاب وعلم المناعة الآليات العصبية المحددة مع الإمكانات العلاجية الهائلة للسيطرة على inflammation سواء في الجهاز العصبي المركزي وفي الهامش. واحدة من هذه الآليات هو الكوليني المضادة للالتهابات مسار (CAP)، المعروف أيضا باسم منعكس التهابات، التي يقودها الجهاز العصبي اللاإرادي 4 و 5.
ويعتقد حاليا أن وسطاء التهابات تنشيط الأعصاب الحسية وترسل إشارات بشأن حالة التهاب في الجهاز العصبي المركزي. ثم يتم تنشيط استجابة رد الفعل من خلال العصب المبهم صادر. كشفت دراسة موسعة على التفاصيل التشريحية للCAP نموذج السمبتاوي-متعاطفة تتألف من اثنين من الأعصاب، والعصب المبهم وعصب الطحال، على التوالي 6. في CAP، ينتهي الكوليني العصب المبهم صادر تفعيلها في العقدة-الاضطرابات الهضمية المساريقي، مما أدى إلى تنشيط العصب الطحال الأدرينالية من خلال آلية لم يتم اكتشافها بعد. ومن المعروف أن العصب الطحال، وبالتالي تفعيلها، إلى الداخليةفاتي على مقربة من الخلايا المناعية في اللب الأبيض، منطقة هامشية، واللب الأحمر في الطحال، وأصل الدين والجهاز الإلزامي للCAP 7 و 8. بافراز (NE) من النهايات العصبية الطحال بربط المقابلة مستقبلات الأدرينالية β 2 أعرب عن الخلايا الليمفاوية T الطحال. هذا يدفع كولين أستيل ترانسفيراز (الدردشة) أستيل بوساطة (ACH) الإفراج عنهم، وهذا بدوره ينشط α7 مستقبلات النيكوتين أستيل (α7nACh) على الضامة، مما يحد من إنتاج السيتوكينات والتهاب 2. ونتيجة لذلك، فمن الواضح الآن أن الجهاز العصبي هو قادرة على تنظيم الالتهاب في الأنسجة الطرفية واستعادة توازن المناعة المحلي.
كاسم مسار يوحي، ونظام أدن تشافيز له أهمية مركزية لعمل هذا التنظيم مسار الاعصاب المناعي. ومن المثير للاهتمام، والآليات التي تشارك في تفعيليبدو أن CAP أن تكون مختلفة في محيط وفي الجهاز العصبي المركزي. وفي الوقت الذي ظهر على أهمية مستقبلات النيكوتين (α7nAChR) في الطحال في وقت سابق من 9 مستقبلات المسكارينية (mAChR) إلزامية لتفعيل المركزي للمسار 10 و 11. وفي الآونة الأخيرة، والإدارة الطرفية من المفعول مركزيا M1 ناهض المسكارينية قمعت بشكل ملحوظ في الدم وورم الطحال عامل نخر α (TNFα) خلال endotoxemia الفئران القاتل، وهو العمل الذي يتطلب العصب المبهم سليمة والعصبية الطحال مما يشير إلى 12. لقد أظهرنا أيضا في الآونة الأخيرة أن الفئران التي تفتقر إلى البروستاجلاندين E 2 (PGE 2) لم تكن قادرة على الاستجابة لتحفيز العصب المبهم، ولم أسفل تنظم إطلاق سراح الناجم LPS-السيتوكينات في المصل والطحال 3. ولذلك، فإن CAP ويمكن أيضا أن ينظم من قبل أنظمة أخرى غير pathw أدن تشافيز الرئيسيةعبد المنعم يوسف.
وقد سميت العصب المبهم على هذا النحو لأنه بطبيعة الحال تجول في الجسم، والتعصيب الأجهزة الرئيسية بما فيها الكبد والرئة والطحال والكلى والأمعاء 13. النظر في هذا تعصيب كبير وتأثير مناعة قوية جدا من العصب المبهم، فإن إمكانيات العلاجية للCAP تغطي مجموعة واسعة من الحالات الالتهابية. العصب المبهم يمكن أن يكون كهربائيا (أو ميكانيكيا) تنشيط، مع السيطرة على الجهد والتردد، والعكس مع العلاج التقليدي، مع عدم وجود الأدوية إضافة إلى الجسم. هي المحاكمات الجارية حاليا في مرضى الروماتيزم، على سبيل المثال، لاختبار الأهمية السريرية لVNS في علاج التهاب مزمن 14. وإجمالا، فإن البلاغ والسيطرة على الالتهاب العصبي المناعي حاليا قيد التحقيق، والذي سيوفر إمكانية علاج بديلة للعلاج التقليدي. لذلك، وتحليل العصب المبهم stimulatioتأثير ن في أجهزة معصب مختلفة، ولكن أيضا توصيف عمل العلاجية المحتملة في نماذج حيوانية من التهاب مزمن، بالتأكيد تعطي رؤى ويأمل لأهداف علاجية جديدة محتملة.
منهجية الأصلية التي وضعتها تريسي وزملاؤه 4 لا يمكن نقلها إلى مجالنا من الأبحاث بسبب فرط الاستجابة الالتهابية (عن طريق جرعة قاتلة من LPS) ونطاق زمني قصيرة جدا بين تفعيل CAP وقراءة المغادرة. في هذه الورقة، وسوف نقدم التغييرات التي أدخلت على بروتوكول الأصلي، مقارنة بين المنهجيات المختلفة على مستويات خلوى، وتسليط الضوء على مراقبة جديدة ومعاكسة على الجهاز المستهدف (الطحال).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات المحلية في معهد كارولينسكا في ستوكهولم. التالي لجنة الأخلاقيات المحلية توجيهات الاتحاد الأوروبي بشأن رعاية الحيوان.
ملاحظة: التغييرات الرئيسية من البروتوكول الأصلي هي فترة النقاهة بعد الجراحة (6 ساعات مقابل 1 ساعة) ومستوى LPS حقن (2 ملغ / كغ مقابل 15 ملغ / كلغ). وبخلاف ذلك، لم يتم تغيير إعدادات مختلفة تتعلق الجراحة نفسها.
1. إعداد المواد اللازمة لتحفيز
- بدوره على جهاز الكمبيوتر ونظام الحصول على البيانات المرتبطة إلى تحفيز الكهربائي (الشكل 1A).
- أدخل نعترف البرنامج.
- إعداد محلول المخزون من LPS بتركيز 5 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني 1X، قسامة عليه، وتخزينها في -20 ° C. في يوم من التجربة، وذوبان الجليد قسامة وإعداد اديعينة quate من LPS (0.5 ملغ / مل) من أجل ضخ حوالي 100 ميكرولتر في الحيوان، وفقا للوزن.
2. إعداد الحيوان للتخدير
- استخدام C57BL / 6 الفئران. المحافظة عليها في ظل ظروف المناخ التي تسيطر عليها مع ضوء لمدة 12 ساعة / دورة الظلام، وإطعامهم طعام القوارض القياسية، ومنحهم المياه libitum الإعلانية.
- إجراء عمليات جراحية على الفئران التي تزن حوالي 25 غراما في اليوم من هذه التجربة.
ملاحظة: عندما يتم بفعل التفاعلات الالتهابية، من المهم بصفة خاصة لإجراء الفحوصات والملاحظات من ردود الفعل السريرية في الحيوانات العادية. هناك حاجة إلى القتل الرحيم المبكرة بنسبة CO 2 الاستنشاق إذا لم حالة الحيوان تفي بالمعايير الأخلاقية. - تعيين آلة التخدير.
- تأكد من أن الأنبوب متصلا بشكل صحيح وغير معطوب بأي شكل من الأشكال. تأكد من أن منطقة جيدة التهوية يعمل بشكل صحيح. قم بتوصيل مرشح رئيسي في زجاجة الأيزوفلورين وملء vaporizer مع كمية كافية من الأيزوفلورين.
- فتح امدادات الغاز (الهواء والأكسجين) وتأكد من أن زجاجات تحتوي على ما يكفي من الغاز للتجربة. موصل ثلاثي ومن ثم قادرا على إرسال تدفق الأيزوفلورين إلى غرفة تحريض أو قناع.
- بدوره ثلاثية في الموصل لغرفة تحريض. اختيار الماوس واحد من قفص المنزل وادخال الحيوان في الغرفة. ضبط منظم التدفق إلى 1.0 L الأوكسجين / دقيقة و 1.0 L / الهواء دقيقة. ضبط تركيز الأيزوفلورين إلى 4-5٪.
- عند الوصول إلى المستوى المطلوب من التخدير، وعند الوصول إلى المستوى المطلوب من التخدير، حلق المنطقة الجراحية ونقل الحيوان من غرفة إلى قناع. بدوره ثلاثية في الموصل لتدفق قناع. ضبط منظم التدفق إلى 0.25 L الأوكسجين / دقيقة و 0.25 L / الهواء دقيقة.
- ضبط تركيز الأيزوفلورين إلى 1،5-2،5٪. فحص مستوى التخدير عن طريق التحكم عن رد الفعل ومعدل التنفس قبل البدء في الاجراء الجراحيه.
- إصلاح الساقين من الماوس لمقاعد البدلاء العمل باستخدام شريط لاصق. تأكد من أن الأنف من الحيوان ما زال ضعه بعناية في القناع.
3. الجراحة وتحفيز عصب فاجوس
- تطهير المنطقة الجراحية مع 70٪ من الإيثانول.
- باستخدام مشرط، شق بعناية الجلد على مستوى الرقبة (شق حوالي 1-1،5 سم).
ملاحظة: في البروتوكول، وإجراء عملية جراحية ينتهي هنا للحيوانات التي تديرها SHAM. وبالفعل، فقد تبين أن مجرد لمس العصب بأداة معدنية تحفز بالفعل إلى حد ما. لذلك، للحصول على السيطرة جراحة أكثر دقة الحيوان عند استخدام كمية صغيرة من LPS، ووقف عملية جراحية في هذه الخطوة. - بمساعدة المجهر (الهدف 12.5X)، عزل العصب المبهم الأيسر من الشريان السباتي باستخدام ملقط تشريح. تحديد أول عضلة القصية الترقوية الخشائية عن طريق إزالة الجلد والدهون طبقات، ومن ثم التراجع عن ذلك فيأجل وضع ملقط وراء كل من العصب والشريان.
ملاحظة: الخطوة التالية هي صعبة للغاية، كما يتم الالتزام العصب والشريان بشكل وثيق مع بعضها البعض. ولذلك، فمن السهل جدا لقطع السفينة وقتل الحيوان. ومع ذلك، من خلال وضع ملقط بعناية فائقة بين العصب والشريان، فهي تفصل في نهاية المطاف، وأنه من الممكن لعزل العصب. - وضع القطب (الشكل 1B) تحت العصب المبهم. القطب إبرة طويلة جدا، لذلك حتى لو كان يتحرك العصب طفيفا خلال التحفيز، وسوف تكون دائما على اتصال مع القطب.
- إجراء حقن داخل الصفاق (IP) من LPS (2 ملغ / كغ) مع مساعدة من حقنة (لللقراءة من على مستويات خلوى، أي لقياس تأثير تنظيم لأسفل).
- انتظر 5 دقائق قبل بدء التحفيز.
- تحفيز العصب المبهم لمدة 5 دقائق في 5 V و 1 هرتز من خلال الضغط على زر البدء في برنامج الاعتراف.
- إعادةنقل القطب وخياطة الجرح من الحيوان مع خيوط الجروح الجراحية.
- رش لا ستينغ الحاجز فيلم (NSBF) على الجرح من أجل تحسين الشفاء وللحماية من العدوى.
4. استرداد الحيوان
- بعد الجراحة، ونقل الحيوانات إلى قفص وطنه للصحوة والانتعاش. تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء من أجل الحفاظ على درجة حرارة الجسم، تأكد من مراقبة الحيوانات حتى يتم استعاد وعيه الكامل.
- السماح للحيوان التعافي في قفصه ل6 ساعات قبل التضحية من أجل التحليل.
ملاحظة: تأثير تحفيز العصب المبهم هو سريع جدا وكما أظهرت أن تكون طويلة الأمد (تصل إلى 48 ساعة)، وبالتالي فإن الوقت الانتعاش يمكن وضعها عن طريق المجرب وفقا لاحتياجات الدراسة.
5. التضحية لمزيد من التحليل
- وضع الحيوانات في قفص ترتبط إلى جهاز إدارة CO 2.
- ضبط الجهاز على 5دورة -min من CO 2 الاستنشاق.
- عندما يتم القتل الرحيم، وجمع أجهزة الفائدة وتجميد مباشرة لهم على الثلج الجاف لمزيد من التحليل (على سبيل المثال، وقياس مستويات خلوى في مقتطفات الطحال باستخدام الماوس TH1 / فحص TH2 9 بلكس) 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مستوى TNFα وانترلوكين 1β (IL-1β) بعد زيادة الفاصل الزمني بعد الجراحة وتقليل جرعة من LPS
كما هو موضح سابقا، وذلك باستخدام بروتوكول الأصلي، وانخفاض VNS مستويات TNFα (169.3 ± 24.9 جزء من الغرام / ملغ في SHAM مقابل 39.7 ± 10.8 جزء من الغرام / ملغ في VNS، ف <0.001) وIL-1β (360.0 ± 40.21 الغرام / ملغ في SHAM مقابل 191.7 ± 27.2 جزء من الغرام / ملغ في VNS، ف <0.01) في الطحال بعد الحقن داخل الصفاق LPS (15 ملغ / كلغ) (الشكل 2A). بعد تغيير الوقت لتحليل 1-6 ساعة وخفض الجرعة LPS 15-2 مغ / كغ، لاحظنا سوى تأثير VNS على TNFα (13.67 ± 1.81 جزء من الغرام / ملغ في SHAM مقابل 8.82 ± 1.20 جزء من الغرام / ملغ في VNS، ف <0.05)، في حين لم تتأثر IL-1β (368.62 ± 35.65 الغرام / ملغ في SHAM مقابل 304.99 ± 43.54 الغرام / ملغ) (الشكل 2B). دون أي ينج LPSection (أي المياه المالحة)، يمكن أن يتم الكشف عن أي فرق بعد VNS (الشكل 2C).
مستويات تنظم النمو، الكيراتينية جاذب كيميائي / الإنسان Oncogen (KC / GRO) في الطحال بعد VNS عن طريق شروط مختلفة
مع البروتوكول الأصلي، أظهرنا أن KC / اللائحة العامة للمنظمة وبقوة تنظيم أسفل من VNS (597.4 ± 17.8 جزء من الغرام / ملغ في SHAM مقابل 416.4 ± 29.7 جزء من الغرام / ملغ في VNS، ف <0.001) (الشكل 3A). باستخدام نقطة زمنية 6 ساعة و 2 ملغم / كغم من LPS، لم يلاحظ أي تغيير بين SHAM والحيوانات VNS (الشكل 3B)، في حين لا يزال قويا VNS هو على TNFα، على سبيل المثال. ومع ذلك، عندما تم حقن لا LPS لنقطة زمنية 6-ساعة، لاحظنا قوي يصل تنظيم KC / GRO التالية VNS (59.37 ± 4.29 جزء من الغرام / ملغ في SHAM مقابل 141.22 ± 10.56 الغرام / ملغ في VNS، ف <0.001 ) (الشكل 3C). كما هو متوقع، فإن معظمكانت السيتوكينات الأخرى (TNFα، IL-1β، IL-2، IL-4 و IL-5، IL-10، IL-12، وIFNγ) عند مستويات منخفضة جدا (إذا كشف)، ويمكن أن ينظر إليه لا فرق بين SHAM والحيوانات VNS حفز.
الشكل 1: صور من المواد المطلوبة من أجل تنفيذ وتحفيز عصب فاجوس. A) ط) الكمبيوتر، والثاني) نظام الحصول على البيانات، وج) تحفيز الجهاز الكهربائي. B) عن قرب القطب التي يتم وضعها تحت العصب المبهم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مستويات TNFα وIL-1β في الطحال Extracts من SHAM والحيوانات تعامل VNS. وتتعرض الحيوانات للSHAM أو جراحة VNS، وفقا للشروط التالية: أ) الانتعاش 1-ساعة بعد الحقن الملكية الفكرية من 15 ملغ / LPS كجم، B) استرجاع 6 ساعة بعد الحقن الملكية الفكرية من 2 ملغ / LPS كغ، وC) انتعاش 6 ساعة بدون حقن LPS. يتم قياس مستويات على الموالية للالتهابات لوحة المغلفة خلوى وكنسبة من الغرام / ملغ من الأنسجة. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM. معارض نجمية فروق ذات دلالة إحصائية بين VNS والفئران SHAM (ن = 8 في كل مجموعة). طالب تي -test * ف <0.05. ** ف <0.01. *** ع <0.001. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): مستويات KC / اللائحة العامة للمنظمة في يرة سوريةلين مقتطفات من SHAM وVNS المعالجة الفئران السذاجة. وتتعرض الحيوانات للSHAM أو جراحة VNS، وفقا للشروط التالية: أ) الانتعاش 1-ساعة بعد الحقن الملكية الفكرية من 15 ملغ / LPS كجم، B) استرجاع 6 ساعة بعد الحقن الملكية الفكرية من 2 ملغ / LPS كغ، وC) انتعاش 6 ساعة بدون حقن LPS. يتم قياس مستويات على الموالية للالتهابات لوحة المغلفة خلوى وكنسبة من الغرام / ملغ من الأنسجة. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM. معارض نجمية فروق ذات دلالة إحصائية بين VNS والفئران SHAM (ن = 8 في كل مجموعة). طالب تي -test *** ع <0.001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
منذ اكتشافه في وقت مبكر 2000s، آليات CAP تم دراسة وافية. لدينا الآن صورة جيدة عن الطريق، وعلى وجه الخصوص، الجهاز المستهدف، والطحال، حيث NE، خلايا الذاكرة T، منظمة العمل ضد الجوع، والضامة العمل كفريق واحد فعال جدا إلى أسفل تنظيم وسطاء التهابات 2. ونحن أيضا نشرت مؤخرا بيانات على أهمية وجود نظام البروستاجلاندين وظيفية في الفئران، على وجه الخصوص، PGE 2، التي من الواضح أن عنصر إلزامي لإطلاق أدن تشافيز في الطحال بعد تفعيل CAP 3.
هذه التقنية التجريبية، والمعروفة باسم تحفيز العصب المبهم، ويمكن بسهولة أن يؤديها في المختبر، ولكن يجب أن يكون لاحظت بعض البروتوكولات الهامة المتعلقة الحيوانات وإجراء عملية جراحية. نحن نستخدم إشارة تنبيه شرط لا الموجة، التي من المفترض أن تكون "تهمة متوازن" التحفيز، وذلك لتجنب بناء الشحنات الكهربائية فيالعصبية التي يمكن تدميره (على العكس من التحفيز الطور). في حين تحفيز العصب، فإنه ليس من الممكن فصل وارد من إشارة صادر، والتي يمكن أن يتم إلا لأغراض أخرى مع التجارب قطع المبهم. ومن المعروف مدة والترددات المستخدمة للتجربة أن يكون لها تأثير على الافراج خلوى التالية التحدي التهابات، وعلى سبيل المثال، ولكن لن تؤثر على معدل ضربات القلب أو إعطاء آثار جانبية واضحة في الاصحاء.
أولا وقبل كل شيء، يجب المجرب نضع في اعتبارنا دائما أن يعالج، والجراحة، والتعافي من الحيوانات يجب أن يتم وفقا للقواعد الأخلاقية للرعاية الحيوان. النقطة الأخرى هي أن ممارسة عملية جراحية له أهمية كبيرة. عزل العصب المبهم هو خطوة صعبة، والتي يمكن أن تكون قاتلة للحيوان في حالة حدوث تلف الأوعية الدموية. من ذوي الخبرة، ويمكن أن يتم العملية في غضون 15-20 دقيقة، وهذا يعني أن الحيوان ليس من الضروري أن يكون تخدير لفترة طويلة من الزمن، والتييساعد على الانتعاش.
ويمكن أيضا أن أثير نقاش فيما يتعلق باختيار حيوان حسن تشغيلها SHAM. في بروتوكول لدينا، كنا الحيوانات التي خضعت فقط لعملية جراحية على مستوى الرقبة، دون وضع القطب تحت العصب المبهم. وكان سبب اختيار هذا الخيار أن مجرد وضع القطب تحت العصب شأنه أن يحفز ميكانيكيا العصب إلى حد ما (كما لوحظ سابقا) 19، وخلق خطر اخفاء الآليات المحتملة التي تحدث عند مستويات منخفضة جدا من الالتهابات. في حالة استخدام جرعات عالية جدا من LPS، ربما يكون أفضل تحكم تعمل SHAM لوضع القطب تحت العصب، كما أن تأثير الجراحة SHAM لا تتداخل أو قناع تأثير التحفيز الكهربائي واضح على انفجار السيتوكينات.
لقد قمنا بتطوير البروتوكول الحالي لتتناسب مع مختلف القضايا التي تواجهها في مجال عملنا من البحوث. كما نوقش في ورقتنا السابقة،ونحن ننظر في احتمال تورط النظام البروستاجلاندين في CAP. بسبب التمثيل الغذائي الأنزيمي، كنا نظن أن الوقت الانتعاش 1-ساعة من البروتوكول الأصلي لن تتناسب مع تجربتنا. ولذلك، فإننا مدد مرور الوقت بعد عملية جراحية ل6 ساعات. وبذلك، كان لدينا أيضا يعاير أسفل جرعة من LPS من أجل تلبية المعايير الأخلاقية. لقد اخترنا وقت الانتعاش من 6 ساعات، وهو التأخير الذي اعتقدنا لفترة كافية لهذا الغرض. نحن أيضا معاير وLPS من 15 مغ / كغ (البروتوكول الأصلي) وصولا الى 0 ملغم / كغم. في 2 مغ / كغ، رأينا تأثير الأخير من VNS على السيتوكينات (الشكل 2)، وهو التأثير الذي اختفى في الجرعات المنخفضة.
في حين أن الأثر الرئيسي للVNS في الطحال هو معروف وتتميز تنشيط الخلايا التائية الذاكرة وبعد ذلك، الضامة الخلايا التي تسمح لل-نحن السيتوكينات أظهر انخفاضا من هنا أيضا أن VNS يبدو للحث مباشرة الإفراج عن وسطاء ( فإنه لا يزال من غير الواضح من الذي الخلايا، necessitatiنانوغرام مزيد من الدراسة) من أجل تجنيد أنواع الخلايا الأخرى من الاستجابة الأولية للالتهاب. في الواقع، في حين انخفضت VNS بقوة KC / اللائحة العامة للمنظمة بعد تحريض قوي للالتهابات (15 ملغ / كغ LPS، أي البروتوكول الأصلي)، كما أنه ينشط بيان سريع جدا من KC / اللائحة العامة للمنظمة في غياب الالتهاب. ومن المعروف أن chemokine KC / اللائحة العامة للمنظمة، وIL-8 البروتين ذات الصلة مع خصائص الكيميائي قوية، أن يكون لها دور مهم في تطوير الكرية البيضاء (على سبيل المثال، والقيادة النضج وتفعيل)، والاتجار (على سبيل المثال، جذب وتوظيف العدلات)، وتعمل 15 . على سبيل المثال، العدلات هي أعضاء هاما من نظام أكلة لنظام المناعة الفطري. كما أنها بمثابة خط الدفاع الأول ضد الجراثيم الغازية المضيف، ولكنها أيضا وسطاء مهمة الإصابة التي يسببها التهاب 16. ومن المثير للاهتمام، في محاولة لتحسين والبروتوكول، ونحن بعد ذلك جاء عبر هذه الملاحظة التي تسلط الضوء على المباشرهمشاركة طن من أنواع الخلايا الأخرى في الطحال في عمل العصب المبهم.
وقد ركزت كل العمل الرائد في هذا المجال على الطحال، الجهاز المستهدف من CAP، وعلى أثر immunoregulatory لمسار ردا على الإنتان أو التهاب النظامية الطرفية. الأهم من ذلك، وقد تم هذا العمل باستخدام التحفيز حاد في العصب المبهم، مثل تلك الواردة في هذه الورقة. وهذا يمكن أن تستخدم لتحليل الجزيئي للأجهزة بعينها أو الآثار على المدى القصير ينظر في الدراسات الفنية التي تنطوي على نماذج حيوانية المزمنة من التهاب (24-48 ساعة كحد أقصى بعد الجراحة).
ومع ذلك، وبالطبع يتجول من العصب المبهم يعني أيضا أن CAP يمكن أن تكون ذات فائدة كبيرة لعلاج الأمراض الالتهابية المزمنة التي تنطوي على أجهزة معصب مختلفة (13). واحد من الأجهزة الأكثر دراسة في هذا السياق هو القناة الهضمية، مع التركيز على مرض التهاب الامعاء (IBD)، والذي يتضمن كرون & # 39؛ ق المرض والتهاب القولون التقرحي، ولكن أيضا التي يسببها بعد العملية الجراحية العلوص 17. وعلاوة على ذلك، فإن أهمية تنظيم CAP في العديد من الأمراض الالتهابية الأخرى التي تنطوي على الكبد والكلى والرئة هي أيضا قيد التحقيق 18. ومع ذلك، فإن البروتوكول الحالي لا يمكن استخدامها في هذا السياق، حيث أن تأثير طويل الأجل من تفعيل العصب المبهم يتطلب التحفيز المتكررة التي يمكن بالطبع أن يتم إلا مع القطب زرعها في الجسم الحي. لهذا الغرض، ينبغي أن يخضع الحيوان لعملية جراحية حيث يتم وضع أقطاب صفعة محفزة حول العصب المبهم 20. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن الأسلوب الأخير هو أكثر من ذلك بكثير في كثير من الأحيان وصفها في البشر أو في الحيوانات ذات حجم أكبر. وهناك طريقة أخرى لتحفيز العصب المبهم هو الميكانيكية، والتحفيز غير الغازية وعن طريق الجلد من العصب المبهم أظهرت تأثير مثبط للمناعة في نموذج الفئران من endotoxemiaالمرجع "> 21. ومع ذلك، فإن الشواغل الرئيسية لهذه التقنية سيكون استنساخ النتائج وكيفية التأكد من أن العصب المبهم هو حفز بنفس الطريقة في التقييم على المدى الطويل من النماذج الحيوانية. وقد وضعت أجهزة للبشر مثل عبر أذني VNS تحفيز أو تنشيط VNS عبر عنق الرحم، والتي تقدم النبضات الكهربائية التي تحملها جيدا من المواد 21، وقد تستخدم أساسا لعلاج الصرع والصداع النصفي، وقد أظهرت نتائج واعدة يمكن أن تؤدي إلى حركيا في المستقبل والعلاج خارجي.
وباختصار، لا سيما بسبب تعصيب واسعة من العصب المبهم في الجسم، ودرس تنظيم CAP في مجموعة واسعة من الأمراض الالتهابية أملا في العثور على الممتلكات الآلية الجزيئية للاهتمام التي يمكن أن تؤدي إلى الأهداف العلاجية المحتملة في المستقبل. هنا، قدمنا طريقة الحاد لتحفيز العصب المبهم. وهو يتيح للدراسة CAP في محدودةردود flammatory بفضل التحفيز التهابات المعتدل جنبا إلى جنب مع مجموعة وقتا أطول بين VNS والتحليل (السماح التمثيل الغذائي الأنزيمي لتأخذ مكان، على سبيل المثال).
فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تأثير تحفيز العصب المبهم، فضلا عن الاستخدام الفعال في علاج الأمراض الالتهابية، أهمية كبيرة، خاصة من منظور السريرية. في الواقع، ومزايا منهجية واسعة. نظرا لطبيعة الإشارات العصبية سريع للغاية، فهي سريعة وفعالة؛ تأثير ملحوظ على مستويات خلوى، على سبيل المثال، يحدث في أقل من 1 ساعة. 4 أيضا، التحفيز الميكانيكي، غير الغازية، وعن طريق الجلد من العصب يمكن استخدامها، وإعطاء الأمل لعلاجات الخارجية الملحقة به وتدار بسهولة في المستقبل. وأخيرا، خلافا لعلاج منتظم، يستخدم تحفيز العصب المبهم مسارا الذاتية. وبالتالي، فخلافا في جميع العلاجات المخدرات، يتم إدخال أي عوامل جديدة فيللجسم، وبالتالي تجنب أي آثار جانبية محتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Toshiba | - | Any computer is actually compatible |
| MP-150 data acquisition system | Biopac Systems | MP150WSW | |
| Acknowledge software | Biopac Systems | ||
| Mice C57Bl/6 | Charles River | ||
| Anesthetic machine | Simtec Engineering | ||
| Medical oxygen bottle | AGA | 107563 | |
| Medical air bottle | AGA | 108639 | |
| Vetflurane (1,000 mg/g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Saline | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493 | Diluted 10 times for used concentration |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| Needles 23 G | KD-FINE | 900284 | 0.6 x 30 mm (blue) |
| Microdissecting forceps (curved) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Surgical suture 4-0 | Ethicon | G667G | |
| Euthanasia unit | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon No Sting Barrier Film | 3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit | MesoScale Discovery | K15013C-1 | |
| Stimulating electrode device | Biopac Systems | STIMSOC | |
| Aesculap Isis shaver | Agnthos | GT420 | |
| R70 | Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden |
References
- Nathan, C. Points of control in inflammation. Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).
- Rosas Ballina, M., et al. Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit. Science. 334 (6052), 98-101 (2011).
- Le Maître, E., et al. Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).
- Borovikova, L. V., et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).
- Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity. Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).
- Pavlov, V. A., Tracey, K. J. Neural circuitry and immunity. Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).
- Huston, J. M., et al. Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis. J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).
- Rosas-Ballina, M., et al. Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).
- Wang, H., et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).
- Pavlov, V. A., et al. Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).
- Pavlov, V. A., et al. Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).
- Rosas-Ballina, M., et al. Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation. Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).
- Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L. Psychoneuroimmunology. Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. 55, Academic. San Diego. 55-112 (2001).
- Andersson, U., Tracey, K. J. A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation. Cerebrum. 2012, 3 (2012).
- Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function. J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).
- Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis. Blood. , (2016).
- Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. The vagal innervation of the gut and immune homeostasis. Gut. 62, 1214-1222 (2013).
- Pereira, M. R., Leite, P. E. The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex. J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. 9 (8), e104530 (2014).
- Huston, J. M., et al. Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis. Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).
- Yuan, H., Silberstein, S. D. Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II. Headache. 56 (2), 259-266 (2016).
