Introduction
La inmunidad innata proporciona una primera línea inmediata de defensa contra las infecciones y enfermedades en una amplia gama de organismos. No sólo se inicia la respuesta inmune primaria para eliminar la amenaza, sino que también desempeña un papel fundamental en la activación y educar a la inmunidad adaptativa que lleva a cabo respuestas inmunes secundarias de una manera específica del patógeno. La inflamación está orquestada por una gran cantidad de citocinas y quimiocinas, que a su vez tienen la capacidad de atraer otras células inmunitarias al sitio de la infección y para inducir los signos cardinales de la inflamación, tales como enrojecimiento, hinchazón, dolor, pérdida de función, y la fiebre . La duración y la intensidad de la inflamación dependen de varios factores, pero la resolución de la inflamación y la restauración de la homeostasis es un paso crítico para evitar la aparición de enfermedades inflamatorias crónicas. Los recientes avances en el campo de la neurología y la inmunología han desentrañado los mecanismos neuronales específicos con un inmenso potencial terapéutico para controlar la inflinflamación tanto en el sistema nervioso central y en la periferia. Uno de estos mecanismos es la vía anti-inflamatorio colinérgico (CAP), también conocido como el reflejo inflamatorio, que es accionado por el sistema nervioso autónomo 4, 5.
Actualmente se cree que los mediadores inflamatorios activan los nervios sensoriales y envían señales sobre el estado de la inflamación en el sistema nervioso central. Una respuesta refleja se activa a continuación, a través del nervio vago eferente. Un extenso estudio sobre los detalles anatómicos de la PAC ha revelado un modelo parasimpático-simpático compuesto de dos nervios, el nervio vago y el nervio esplénico, respectivamente 6. En el PAC, el colinérgico nervio vago eferente activado termina en el ganglio celíaco-mesentérica, lo que resulta en la activación del nervio esplénico adrenérgico por un mecanismo aún no se ha explorado. El nervio esplénico, activado de este modo, se sabe que internaVate en estrecha proximidad a las células inmunes en la pulpa blanca, de la zona marginal, y la pulpa roja del bazo, el órgano principal y obligatoria de la PAC 7, 8. La norepinefrina (NE) a partir de las terminaciones nerviosas esplénicas se une a los correspondientes receptores adrenérgicos β 2 expresados en los linfocitos T esplénicas. Esto induce la liberación de colina acetil transferasa (ChAT) acetilcolina mediada (ACh), que a su vez activa los receptores nicotínicos de acetilcolina a7 (α7nACh) sobre los macrófagos, lo que limita la producción de citoquinas y la inflamación 2. En consecuencia, ahora está claro que el sistema nervioso es capaz de regular la inflamación en los tejidos periféricos y restaurar la homeostasis inmune local.
Como el nombre de la vía sugiere, el sistema de ACh es de importancia fundamental para el funcionamiento de esta vía de regulación neuro-inmune. Curiosamente, los mecanismos implicados en la activación dela PAC parece ser diferente en la periferia y en el sistema nervioso central. Si bien la importancia de los receptores nicotínicos (α7nAChR) en el bazo se ha demostrado anteriormente 9, los receptores muscarínicos (mAChR) son obligatorios para la activación central de la vía 10, 11. Más recientemente, la administración periférica de un agonista muscarínico M1 de acción central suprimió significativamente suero y tumorales bazo factor de necrosis α (TNF) durante la endotoxemia letal murino, una acción que requiere nervio vago intacto y el nervio esplénico de señalización 12. También hemos demostrado recientemente que los ratones que carecen de la prostaglandina E 2 (PGE 2) no fueron capaces de responder a la estimulación del nervio vago y no disminuye la liberación inducida por LPS de citoquinas en el suero y el bazo 3. Por lo tanto, la PAC también puede ser regulada por sistemas distintos de la principal pathw AChsí.
El nervio vago ha sido nombrado como tales debido a su curso errante en el cuerpo, que inervan los órganos principales incluyendo el hígado, pulmón, bazo, riñones, y el intestino 13. Teniendo en cuenta este gran inervación y el efecto inmunosupresor muy potente del nervio vago, el potencial terapéutico de la PAC podría cubrir un amplio rango de condiciones inflamatorias. El nervio vago puede ser eléctricamente (o mecánicamente) activado, con el control de la tensión y la frecuencia, y contrariamente al tratamiento convencional, sin fármacos añadidos al cuerpo. Actualmente se están realizando ensayos en pacientes reumáticos, por ejemplo, para probar la significación clínica de la estimulación del nervio vago en el tratamiento de la inflamación crónica 14. En total, la comunicación y la regulación de la inflamación neuro-inmune están actualmente bajo investigación, que proporcionará un tratamiento posible alternativa a la terapia convencional. Por lo tanto, el análisis de la estimulación del nervio vagon efecto en los diferentes órganos inervados, sino también la caracterización del potencial de acción terapéutica en modelos animales de inflamación crónica, sin duda dar ideas y la esperanza de nuevas dianas terapéuticas potenciales.
La metodología original desarrollado por Tracey y sus colegas 4 no podía aplicarse a nuestro campo de la investigación debido a la sobre-estimulación de la respuesta inflamatoria (por una dosis letal de LPS) y un intervalo de tiempo demasiado corto entre la activación de la PAC y de la lectura de salida. En el presente trabajo, presentaremos los cambios realizados en el protocolo original, comparar las dos metodologías diferentes en los niveles de citoquinas, y poner de relieve una nueva y opuesta de observación en el órgano diana (bazo).
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales aprobados por el Comité de Ética local en el Instituto Karolinska, Estocolmo. El Comité de Ética local sigue las directrices de la Unión Europea sobre el cuidado de los animales.
NOTA: Los principales cambios desde el protocolo original son el tiempo de recuperación después de la cirugía (6 hr frente a 1 hr) y el nivel de LPS inyectados (2 mg / kg frente a 15 mg / kg). De lo contrario, los diferentes ajustes relacionados con la cirugía en sí no se han cambiado.
1. Preparar el material para la estimulación
- Encender el ordenador y el sistema de adquisición de datos vinculados a la electrodo de estimulación (Figura 1A).
- Abra el programa de Reconocimiento.
- Preparar una solución madre de LPS a una concentración de 5 mg / ml en 1X PBS, alícuota, y almacenarlo a -20 ° C. En el día del experimento, descongelar una alícuota y preparar un ademuestra cuada de LPS (0,5 mg / ml) con el fin de inyectar alrededor de 100 l en el animal, de acuerdo con el peso.
2. Preparación del animal para la anestesia
- Utilice ratones C57BL / 6. Mantener ellos en condiciones de clima controlado con un ciclo de luz de 12 h / oscuridad, alimentarlos comida estándar para roedores, y darles agua ad libitum.
- Realizar la cirugía en ratones que pesan alrededor de 25 g en el día del experimento.
Nota: Cuando se inducen reacciones inflamatorias, es particularmente importante para llevar a cabo revisiones regulares y observaciones de las reacciones clínicos en los animales. Se necesita la eutanasia prematura mediante inhalación de CO2 si la condición animal no cumple los criterios éticos. - Ajuste la máquina de anestesia.
- Asegúrese de que el tubo está conectado correctamente y no está dañado de alguna manera. Asegúrese de que el área de ventilación está funcionando correctamente. Conectar el filtro llave de la botella de isoflurano y llene el vaporizer con una cantidad suficiente de isoflurano.
- Abra el suministro de gas (aire y oxígeno) y asegúrese de que las botellas contienen suficiente gas para el experimento. Un conector de tres vías es entonces capaz de enviar el flujo de isoflurano a la cámara de inducción o la máscara.
- Gire el conector de tres vías a la cámara de inducción. Elige una ratón de la jaula hogar e insertar el animal en la cámara. Ajuste el regulador de flujo de 1,0 L / min de oxígeno y 1,0 L de aire / min. Ajustar la concentración de isoflurano al 4 - 5%.
- Cuando se alcanza el nivel deseado de anestesia, Cuando se alcanza el nivel deseado de anestesia, afeitar el área quirúrgica y mover el animal de la cámara a la máscara. Gire el conector de tres vías para el flujo máscara. Ajuste el regulador de flujo de 0,25 L / min de oxígeno y 0.25 L de aire / min.
- Ajustar la concentración de isoflurano a 1.5 a 2.5%. Comprobar el nivel de anestesia por control reflejo y la frecuencia respiratoria antes de iniciar el procedur quirúrgicomi.
- Fije las patas del ratón al banco de trabajo utilizando cinta adhesiva. Asegúrese de que la nariz del animal está siendo cuidadosamente colocado en la máscara.
3. Cirugía y la estimulación del nervio vago
- Desinfectar el área quirúrgica con 70% de etanol.
- El uso de un escalpelo, incisión cuidadosamente la piel a nivel del cuello (incisión de alrededor de 1 a 1,5 cm).
Nota: En el protocolo, el procedimiento de cirugía termina aquí para los animales con operación simulada. De hecho, se ha demostrado que apenas tocando el nervio con una herramienta de metal ya que estimula, en cierta medida. Por lo tanto, para obtener un animal de control cirugía más precisa cuando se utiliza una pequeña cantidad de LPS, detener la cirugía en este paso. - Con la ayuda de un microscopio (objetivo 12,5X), aislar el nervio vago izquierdo desde la arteria carótida usando fórceps de disección. En primer lugar localizar el músculo esternocleidomastoideo mediante la eliminación de capas de la piel y la grasa, y luego retractarse enfin de poner las pinzas detrás de tanto nervio y la arteria.
Nota: El siguiente paso es muy complicado, ya que el nervio y la arteria están estrechamente adheridas entre sí. Por lo tanto, es muy fácil de cortar el vaso y matar al animal. Sin embargo, mediante la colocación de las pinzas con mucho cuidado entre el nervio y la arteria, con el tiempo se separan, y es posible aislar el nervio. - Coloque el electrodo (Figura 1B) bajo el nervio vago. El electrodo de aguja es bastante largo, por lo que incluso si el nervio se mueve ligeramente durante la estimulación, siempre estará en contacto con el electrodo.
- Realizar una inyección intraperitoneal (ip) de LPS (2 mg / kg) con la ayuda de una jeringa (para la lectura de salida en los niveles de citoquinas, es decir, para medir el efecto de regulación hacia abajo).
- Esperar 5 min antes de comenzar la estimulación.
- Estimular el nervio vago durante 5 min a 5 V y 1 Hz pulsando el botón de inicio en el programa Reconocer.
- Remover el electrodo y suturar la herida del animal con hilo de sutura quirúrgica.
- Rociar una Película Barrera No Irritante (PBNI) sobre la herida con el fin de mejorar la cicatrización y para protegerse de las infecciones.
4. Recuperación de los Animales
- Después de la cirugía, mover al animal a su jaula para despertar y recuperación. Bajo la luz de infrarrojos con el fin de mantener la temperatura corporal, asegúrese de controlar al animal hasta la plena conciencia se ha recuperado.
- Deje que el animal se recupere en su jaula durante 6 horas antes del sacrificio para el análisis.
Nota: El efecto de la estimulación del nervio vago es muy rápido y también se ha demostrado que ser de larga duración (hasta 48 h), por lo que el tiempo de recuperación puede ser establecido por el experimentador de acuerdo con las necesidades del estudio.
5. Sacrificio para su posterior análisis
- Colocar el animal en una jaula vinculado a un dispositivo de administración de CO 2.
- Permite configurar el dispositivo en un 5ciclo -min de inhalación de CO2.
- Cuando se realiza la eutanasia, recoger los órganos de interés y congelar directamente en hielo seco para análisis adicional (por ejemplo, la medición de los niveles de citoquinas en los extractos de bazo usando un TH1 ratón / TH2 ensayo 9-Plex) 3.
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Representative Results
Nivel de TNF y la interleucina-1β (IL-1β) después de aumentar la Lapso de tiempo después de la cirugía y la disminución de la dosis de LPS
Como se indica anteriormente, utilizando el protocolo original, VNS disminuyó los niveles de TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg en SHAM frente a 39,7 ± 10,8 pg / mg en VNS, p <0,001) y la IL-1β (360,0 ± 40,21 pg / mg en SHAM frente a 191,7 ± 27,2 pg / mg en VNS, p <0,01) en el bazo después de la inyección intraperitoneal de LPS (15 mg / kg) (Figura 2A). Después de cambiar el tiempo para el análisis de 1 a 6 hr y la disminución de la dosis de LPS de 15 a 2 mg / kg, sólo se observó un efecto de la estimulación del nervio vago en TNFa (13,67 ± 1,81 pg / mg en SHAM frente a 8,82 ± 1,20 pg / mg en VNS, p <0,05), mientras que IL-1β no se vio afectada (368,62 ± 35,65 pg / mg en SHAM frente a 304,99 ± 43,54 pg / mg) (Figura 2B). Sin inj LPSreflexión (es decir, solución salina), no hay diferencia podría ser detectado después de VNS (Figura 2C).
Los niveles de regulado de crecimiento de queratinocito humano quimioatrayente / Oncogen (KC / GRO) en el bazo después de VNS Uso de las diferentes condiciones de
Con el protocolo original, se demostró que KC / GRO fue fuertemente reducido regulado por VNS (597,4 ± 17,8 pg / mg en SHAM frente a 416,4 ± 29,7 pg / mg en VNS, p <0,001) (Figura 3A). Usando un punto de tiempo de 6 horas y 2 mg / kg de LPS, se observó ningún cambio entre SHAM y animales VNS (Figura 3B), mientras que VNS es todavía potente sobre TNF, por ejemplo. Sin embargo, cuando no se inyectó LPS para el punto de tiempo de 6 horas, se observó una fuerte regulación de KC / GRO siguiente VNS (59,37 ± 4,29 pg / mg en SHAM frente a 141,22 ± 10,56 pg / mg en VNS, p <0,001 ) (Figura 3C). Como era de esperar, la mayor parte delotras citocinas (TNF, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, y de IFN-) estaban en niveles muy bajos (si detectable), y no hubo diferencia se podían ver entre SHAM y animales VNS estimulada.
Figura 1: Fotos de los materiales necesarios a fin de realizar la estimulación del nervio vago. A) i) del ordenador, ii) el sistema de adquisición de datos, y iii) estimular el dispositivo de electrodos. B) Primer plano del electrodo que se coloca debajo del nervio vago. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Niveles de TNF y IL-1β en el bazo Extracts de SHAM y animales tratados con estimulación del nervio vago. Los animales se sometieron a cirugía simulada o VNS, de acuerdo con las siguientes condiciones: A) de recuperación de 1-hr después de la inyección ip de 15 mg / kg de LPS, B) de recuperación de 6 horas después de la inyección ip de 2 mg / kg de LPS, y C) recuperación 6-hr sin inyección de LPS. Los niveles se midieron en un plato pro-inflamatoria de citoquinas recubierto y se expresaron como pg / mg de tejido. Los datos se expresan como la media ± SEM. Un asterisco muestra diferencias estadísticas entre VNS y ratones SHAM (n = 8 en cada grupo). De la t de Student-test * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Niveles de KC / GRO en SpLeen Los extractos de SHAM y VNS-ratones tratados ingenuo. Los animales se sometieron a cirugía simulada o VNS, de acuerdo con las siguientes condiciones: A) de recuperación de 1-hr después de la inyección ip de 15 mg / kg de LPS, B) de recuperación de 6 horas después de la inyección ip de 2 mg / kg de LPS, y C) recuperación 6-hr sin inyección de LPS. Los niveles se midieron en un plato pro-inflamatoria de citoquinas recubierto y se expresaron como pg / mg de tejido. Los datos se expresan como la media ± SEM. Un asterisco muestra diferencias estadísticas entre VNS y ratones SHAM (n = 8 en cada grupo). Prueba t de Student *** p <0,001.
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Discussion
Desde su descubrimiento en la década de 2000, los mecanismos de la PAC han sido estudiados a fondo. Ahora tenemos una buena imagen de la vía y, en particular, el órgano diana, el bazo, donde NE, las células T de memoria, Ach, y macrófagos trabajo como un equipo muy eficiente para regular a la baja mediadores inflamatorios 2. También hemos publicado recientemente datos sobre la importancia de un sistema de prostaglandina funcional en ratones, en particular, PGE 2, que es obviamente un componente obligatorio para la liberación de ACh en el bazo después de la activación de la PAC 3.
La técnica experimental, conocida como estimulación del nervio vago, fácilmente se puede realizar en un laboratorio, pero debe observarse unos protocolos importantes con respecto a los animales y el procedimiento de cirugía. Utilizamos una señal de estimulación de onda sinusoidal, que se supone que es un estímulo "carga equilibrada", con el fin de evitar la creación de cargas eléctricas en ellos nervios que podrían destruirlo (en contraposición a la estimulación monofásica). Al tiempo que estimula el nervio, no es posible separar el aferente de la señal eferente, que sólo se puede hacer para otros fines con los experimentos vagotomía. La duración y la frecuencia usada para el experimento se sabe que tienen un efecto sobre la liberación de citocinas después de la estimulación inflamatoria, por ejemplo, pero no afectarían a la frecuencia cardíaca o dar efectos secundarios obvios en los controles sanos.
En primer lugar, el experimentador debe tener siempre en cuenta que el manejo, la cirugía y la recuperación de los animales debe realizarse de acuerdo a las normas éticas para el cuidado de animales. El otro punto es que la práctica de la cirugía es de gran importancia. Aislar el nervio vago es un paso difícil, que puede ser letal para el animal si se produce daño vascular. Con la experiencia, la cirugía puede hacerse dentro de 15 - 20 minutos, lo que significa que el animal no tiene que ser anestesiado durante un largo período de tiempo, lo cualayuda a la recuperación.
Una discusión también se puede levantar con respecto a la elección de un buen animal con operación simulada. En nuestro protocolo, se utilizaron animales que sólo se sometieron a cirugía a nivel del cuello, sin colocar el electrodo en el marco del nervio vago. La razón de la elección de esta opción es que sólo colocar el electrodo en el marco del nervio estimularía la mecánica del nervio en cierta medida (como se ha observado anteriormente) 19, creando el riesgo de enmascarar los posibles mecanismos que se producen a niveles muy bajos de inflamación. Si el uso de dosis muy altas de LPS, el mejor control con operación simulada sería probablemente para colocar el electrodo en el marco del nervio, como el efecto de la cirugía simulada no interferiría o enmascarar el efecto de estimulación eléctrica obvio en la ráfaga de citoquinas.
Hemos desarrollado el protocolo actual para adaptarse a los diferentes problemas encontrados dentro de nuestro campo de investigación. Como se discutió en nuestro anterior documento,nos fijamos en la posible implicación del sistema de prostaglandinas en la PAC. Debido al metabolismo enzimático, pensamos que el tiempo de recuperación de 1 hora del protocolo original no es adecuado para nuestro experimento. Por lo tanto, hemos extendido el lapso de tiempo después de la cirugía a 6 horas. Al hacerlo, también tuvimos que bajar titular la dosis de LPS con el fin de cumplir con los criterios éticos. Elegimos un tiempo de recuperación de 6 horas, un retraso que pensamos el tiempo suficiente para este propósito. También titularon los LPS a partir de 15 mg / kg (el protocolo original) a 0 mg / kg. A 2 mg / kg, vimos el último efecto de la estimulación del nervio vago en citocinas (Figura 2), un efecto que desapareció en dosis más bajas.
Mientras que el efecto principal de la VNS en el bazo se conoce y se caracteriza por la activación de células T de memoria y a partir de entonces, los macrófagos-las células que permiten la disminución de citocinas de que también mostró aquí que VNS parece inducir directamente la liberación de mediadores ( todavía no está claro a partir de la cual las células, necessitating estudio) con el fin de reclutar a otros tipos de células de la respuesta primaria a la inflamación. De hecho, mientras que VNS disminuyó fuertemente KC / GRO después de una inducción fuerte inflamatoria (15 mg / kg de LPS, es decir, el protocolo original), se activa una liberación muy rápida de KC / GRO en ausencia de inflamación. La quimioquina KC / GRO, una proteína relacionada con IL-8 con fuertes propiedades quimiotácticas, se sabe que tiene un papel importante en el desarrollo de leucocitos (por ejemplo, la conducción maduración y activación), el tráfico (por ejemplo, la atracción y reclutamiento de neutrófilos) y la función 15 . Por ejemplo, los neutrófilos son miembros importantes del sistema fagocíticas del sistema inmune innato. Actúan como la primera línea de defensa del huésped contra los patógenos invasores, pero también son importantes mediadores de la inflamación inducida por la lesión 16. Curiosamente, en nuestro intento de mejorar el protocolo, entonces encontramos con esta observación que resalta la direct participación de otros tipos de células en el bazo en el funcionamiento del nervio vago.
Todo el trabajo pionero en el campo se ha enfocado en el bazo, el órgano diana de la PAC, y en el efecto inmunorregulador de la ruta en respuesta a la sepsis o la inflamación sistémica periférica. Es importante destacar que este trabajo fue realizado utilizando la estimulación aguda del nervio vago, como el que se presenta en este documento. Esto se puede utilizar para el análisis molecular de órganos específicos o de los efectos a corto plazo observados en estudios funcionales que implican modelos animales crónicos de inflamación (de 24 a 48 hr máximo después de la cirugía).
Sin embargo, el curso errante del nervio vago también implica que la PAC podría ser de utilidad significativa para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas que afectan a los diferentes órganos inervados 13. Uno de los órganos más estudiados en este contexto es el intestino, con un enfoque en la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que incluye Crohn y # 39; enfermedad y la colitis ulcerosa s, sino también el íleo postoperatorio 17 inducida. Además, la importancia de la regulación de la PAC en muchas otras enfermedades inflamatorias que afectan al hígado, riñón, y pulmón también está bajo investigación 18. Sin embargo, el protocolo actual no podría ser utilizado en este contexto, ya que el efecto a largo plazo de la activación del nervio vago requeriría estimulaciones repetitivas que pueden, por supuesto, sólo se puede hacer con un electrodo implantado en vivo. Para este fin, el animal debe someterse a una cirugía en la que los electrodos estimulantes del manguito se colocan alrededor del nervio vago 20. También es importante tener en cuenta que esta última técnica se describe con mucha más frecuencia en los seres humanos o en animales de un tamaño más grande. Otra forma de estimular el nervio vago es mecánico, como la estimulación no invasiva y percutánea del nervio vago mostraron un efecto inmunosupresor en un modelo murino de endotoxemiaref "> 21. Sin embargo, las principales preocupaciones de esta técnica sería la reproducibilidad de los resultados y la forma de garantizar que el nervio vago se estimuló la misma manera en una evaluación a largo plazo de los modelos animales. Los dispositivos han sido desarrollados para los seres humanos , tal como trans-auricular estimulación VNS o estimulación VNS trans-cervical, que entregan impulsos eléctricos, que son bien tolerados por los sujetos 21. se han utilizado principalmente para tratar la epilepsia y migrañas y han mostrado resultados prometedores que podrían conducir a futuro ambulant y la terapia exógena.
Para resumir, en particular debido a la extensa inervación del nervio vago en el cuerpo, la regulación PAC se estudia en una amplia gama de enfermedades inflamatorias en la esperanza de encontrar propiedades mecánicas moleculares interesantes que podrían conducir a posibles futuras dianas terapéuticas. A continuación, presentamos un método aguda para estimular el nervio vago. Permite el estudio de la PAC en limitado enrespuestas inflamatorios gracias a un estímulo inflamatorio moderado combinado con un intervalo de tiempo más largo entre el VNS y el análisis (permitiendo metabolismo enzimático se lleve a cabo, por ejemplo).
La comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen el efecto estimulación del nervio vago, así como su uso eficiente en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, es de gran importancia, particularmente desde una perspectiva clínica. De hecho, las ventajas de la metodología son amplias. Debido a la naturaleza de las señales nerviosas extremadamente rápido, es rápido y eficaz; un efecto observable sobre los niveles de citoquinas, por ejemplo, se produce en menos de 1 hr. 4 Además, la estimulación mecánica, no invasiva, y percutánea del nervio se puede usar, dando esperanza para futuras terapias ambulantes y fácilmente administrados. Por último, contrariamente al tratamiento regular, estimulación del nervio vago utiliza una ruta endógena. Por lo tanto, a diferencia de todas las terapias de drogas, no hay nuevos agentes se introducen enal cuerpo, evitando de este modo cualquier efecto secundario potencial.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Toshiba | - | Any computer is actually compatible |
| MP-150 data acquisition system | Biopac Systems | MP150WSW | |
| Acknowledge software | Biopac Systems | ||
| Mice C57Bl/6 | Charles River | ||
| Anesthetic machine | Simtec Engineering | ||
| Medical oxygen bottle | AGA | 107563 | |
| Medical air bottle | AGA | 108639 | |
| Vetflurane (1,000 mg/g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Saline | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493 | Diluted 10 times for used concentration |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| Needles 23 G | KD-FINE | 900284 | 0.6 x 30 mm (blue) |
| Microdissecting forceps (curved) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Surgical suture 4-0 | Ethicon | G667G | |
| Euthanasia unit | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon No Sting Barrier Film | 3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit | MesoScale Discovery | K15013C-1 | |
| Stimulating electrode device | Biopac Systems | STIMSOC | |
| Aesculap Isis shaver | Agnthos | GT420 | |
| R70 | Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden |
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