Summary
هنا، نحن تصف الإجراء لتصور وقياس مع حساسية عالية التفاعلات الذاتية بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا في الخلايا الثابتة. يتميز البروتوكول والأمثل في الموقع قرب ربط فحص استهداف إينوزيتول 1،4،5-ثلاثي مستقبلات / التنظيم الجلوكوز البروتين 75 / قناة أنيون / cyclophilin مجمع تعتمد على الجهد D في واجهة غشاء المرتبطة الميتوكوندريا.
Introduction
الميتوكوندريا والشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) ليست العضيات مستقلة في الخلية، لكنها تتفاعل هيكليا ووظيفيا في مواقع الاتصال الذي يعرف بأنه أغشية الشبكة الإندوبلازمية المرتبط الميتوكوندريا (MAM). في الواقع، MAMs تتوافق مع المناطق التي الرئيسي يعارضها أغشية ER والميتوكوندريا عن كثب، والسماح التفاعلات بين البروتينات من كلا الجانبين. ومع ذلك، فإن أغشية هذه العضيات لا تلتحم في هذه المناطق، حتى أنها تحافظ على كياناتها المنفصلة. وMAMs تلعب دورا حاسما في الكالسيوم (الكالسيوم 2+) ونقل فوسفورية من ER إلى الميتوكوندريا، مما يؤثر استقلاب الطاقة وبقاء الخلية 1-3.
وتصور العلاقة بين لائحة والميتوكوندريا الأول في 1970s مع المجهر الإلكتروني. ومنذ ذلك الحين، انتقال المجهر الإلكتروني 4،5، والإلكترون التصوير المقطعي 6،7 أو المناعية توطين ER والميتوكوندريا الخاصة fluorophoreق / البروتينات الفلورية 8 استخدمت تقليديا لدراسة التفاعلات-ER الميتوكوندريا. ويستند أداة أخرى مفيدة لتحليل MAM على استخدام تجزئة التحت خلوية. وهو يتيح للعزل كسور MAM بواسطة تنبيذ فائق الفرق بالإضافة إلى التدرج Percoll 9. ومع ذلك، فإن المنتج النهائي يحتوي على كسور MAM المخصب، بدلا من كسور نقية. وإجمالا، فإن هذه الاستراتيجيات ليست حساسة بشكل خاص و / أو الكمية، وأنها ليست قابلة بسهولة إلى غربلة واسعة. بدلا من ذلك، برزت طرق الوراثية باستخدام linkers محرض المخدرات الفلورسنت بين عضية، لكنها لا تسمح لتحليل التفاعلات عضية في مستويات التعبير الذاتية للبروتينات 10.
وبناء على اكتشاف Szabadkai للمجمع IP3R / GRP75 / VDAC في MAM 11، قمنا بتطوير الأسلوب الكمي لتحليل التفاعلات-ER الميتوكوندريا. استخدمنا في ligati قرب الموقععلى الفحص لكشف وتحديد التفاعلات بين VDAC1 وIP3R1، اثنين من البروتينات عضية سطح تشارك في كا 2+ -channeling مجمع في واجهة MAM في الخلايا الثابتة 12. باختصار، نحن سبر VDAC1 في الغشاء الخارجي الميتوكوندريا (الماوس مكافحة VDAC1 الأجسام المضادة الأولية) وIP3R1 في غشاء ER (أرنب مكافحة IP3R1 الأجسام المضادة الأولية) (الشكل 1، لوحة أ). ثم، وأضاف نحن على حد سواء لمكافحة فأر ومفتش المضادة للأرنب (تحقيقات الماوس والقرب أرنب ربط الفحص)، والتي يتم تصريفها إلى ملحقات النوكليوتيد التكميلية وفقا للفحص. إذا اثنين من البروتينات المستهدفة هي على مسافة أقل من 40 نانومتر، يمكن للأليغنوكليوتيد هجن مع oligos موصل وأضاف في وقت لاحق للسماح بتشكيل قالب دائري الحمض النووي (الشكل 1، لوحة ب). هو ligated هذا الجزيء DNA دائري وتضخيمها، وخلق منتج الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل تعلق تساهمي إلى واحدة من تحقيقات القرب (الشكل 1، لوحة ج) 6، ربط القرب والتضخيم يمكن القيام به، مما أدى إلى كشف لاحقا بسبب التهجين تكساس [أليغنوكليوتيد الحمراء المسمى المسابير (الشكل 1، لوحة د ). وتمثل كل نقطة الفلورسنت التفاعلات بين VDAC1 / IP3R1، مما يسمح للالكمي لفي الموقع التفاعلات ER-الميتوكوندريا في الخلايا الفردية.
الشكل 1: رسم توضيحي تخطيطي للكشف عن التفاعلات اندوبلازمية شبكية-الميتوكوندريا من قبل في الموقع القرب من ربط الفحص. أ) الأجسام المضادة الماوس الأولية الموجهة ضد VDAC1 والأجسام المضادة أرنب الأولية الموجهة ضد IP3R1 يمكن ربط الحواتم في القرب في واجهة MAM، ب) إضافة زوج من تحقيقات ربط القربالموجهة ضد الماوس ومفتش أرنب. وتعلق هذه التحقيقات جدائل الحمض النووي التي يمكن أن تشكل نماذج لربط من oligos الموصل. ج) حبلا الحمض النووي دائرية شكلت بعد ربط يمكن تضخيمها ود) تصور بواسطة المجهر بمثابة نقطة الفلورسنت باستخدام تكساس أليغنوكليوتيد] وصفت الأحمر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تشبه في التجارب فحص الموقع قرب ربط يمكن القيام بها مع الزوج GRP75 / IP3R1 من الأجسام المضادة، وكذلك cyclophilin D (CypD) / الأجسام المضادة IP3R1، معتبرا أن تبين CypD للتفاعل مع مجمع IP3R / GRP75 / VDAC في واجهة MAM 12-14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد حلول
- إعداد 10٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني (قليل الملح) عن طريق تمييع 5.5 مل من 37٪ الفورمالديهايد في 14.5 مل من برنامج تلفزيوني. إعداد 1 M الجلايسين، ودرجة الحموضة 8.0، عن طريق إذابة 3.8 غرام من الجلايسين في 50 مل من برنامج تلفزيوني. تمييع هذا الحل للحصول على 100 ملي الجلايسين في برنامج تلفزيوني 1X.
- تحضير 0.1٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني 1X. إعداد 20x والمالحة سترات الصوديوم (SSC) باستخدام 3.0 M كلوريد الصوديوم و 0.30 سترات M صوديوم أعدت في منطقة عازلة الماء منزوع الأيونات مع 7.0 درجة الحموضة عند 25 درجة مئوية. تمييع هذا المخزن المؤقت ل1X و 0.01x باستخدام الماء منزوع الأيونات.
2. تثبيت للخلايا
ملاحظة: استخدمنا خط خلية سرطانة الكبد HuH7 في هذه الدراسة، ولكن هذه الطريقة تنطبق على غيرها من الثقافات خلية ملتصقة.
- لوحة الخلايا HuH7 (مثقف في DMEM 1 جم / لتر جلوكوز، على أن تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين و 0.01٪ الأسهم البنسلين ستربتومايسين) في 150،000 الخلايا في غير المصقول طبق من الزجاج السفلي 35 ملم. عند العمل على الخلية الأوليةالثقافات، واستخدام الأطباق المغلفة الكولاجين.
- في اليوم التالي، وإزالة ثقافة المتوسط. غسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ونضح. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من الفورمالديهايد بنسبة 10٪ واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) في إطار التحريض.
- وقف رد فعل مع 1 مل من 1 M الجلايسين ومزيج من قبل التناوب. إزالة الحل محطة والتفاعل وغسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X. تستنهض الهمم بالتناوب ونضح. إضافة 1 مل من 100 ملي الجلايسين إلى الخلايا واحتضان لهم لمدة 15 دقيقة في RT في إطار التحريض، ثم نضح.
ملاحظة: بروتوكول يمكن أن يتوقف هنا، ويمكن تأجيل الخطوات التالية ليوم آخر. في هذه الحالة، إضافة 1 مل من 100 ملي الجلايسين والحفاظ على 4 درجات مئوية، وإذا لزم الأمر.
3. Permeabilization من الخلايا
- إضافة 1 مل من 0.1٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني 1X، واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT في إطار التحريض، ثم نضح. ويمكن زيادة هذا الوقت حضانة تصل إلى 15-20 دقيقة عند العمل على الثقافيه الخلية الأوليةوفاق (على سبيل المثال، خلايا الكبد الفئران الأولية). غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X. نضح.
4. حجب
- إضافة 40 ميكرولتر من عرقلة الحل لكل عينة (المقدمة من عدة)؛ ويمكن زيادة هذا الحجم من أجل تغطية العينة. احتضان الأطباق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة الرطوبة.
- اضغط على عرقلة الحل الخروج من الأطباق. حاول الحصول على كميات المتبقية متساوية لكل شريحة، لأن هذا سوف يؤثر التكاثر. لا تدع العينات الجافة!
5. الأجسام المضادة الابتدائية
- تمييع الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني 1X وإضافة حل للأطباق (VDAC1 الماوس الأضداد: 1/100، IP3R1 أرنب الأجسام المضادة: 1/500). بدلا من ذلك، GRP75 أو CypD الأجسام المضادة (سواء الأجسام المضادة الماوس المستخدمة في 1/500) يمكن استخدامها بدلا من VDAC1.
- احتضان بين عشية وضحاها في غرفة الرطوبة في 4 درجات مئوية. تغسل الشرائح مرتين باستخدام تريس مخزنة المالحة مع 0.01٪ توين (TBS-T).
- وتقدم القرب تحقيقات ربط فحص من قبل عدة. اختيار تحقيقات وفقا لنوع من الأجسام المضادة الأولية.
- إعداد اثنين قرب ربط فحص تحقيقات 1: 5 في مخفف الأجسام المضادة. يسمح هذا المزيج على الجلوس لمدة 20 دقيقة في RT. إضافة إلى قرب ربط حل فحص التحقيق المخفف. احتضان الأطباق في غرفة الرطوبة قبل ساخنة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. غسل الأطباق مرتين مع TBS-T.
7. من ربط
- استخدام في الموقع كشف كاشف تكساس عدة الحمراء.
- تمييع الأسهم ربط 5X (التي قدمها مجموعة) 1: 5 في المياه عالية النقاء وتخلط جيدا. تمييع يغاز في حل 1X ربط (التي قدمها عدة) 01:40 ودوامة. الانتظار لإضافة يغاز حتى قبيل بالإضافة إلى العينات.
- إضافة هذا الحل إلى كل عينة (40 ميكرولتر لأطباق الزجاج السفلي 35 ملم)، واحتضان الشرائح في شام الرطوبة قبل ساخنةنوفمبر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تغسل الشرائح مرتين مع TBS-T.
8. التضخيم
ملاحظة: كن حذرا، الكواشف الحساسة للضوء.
- تمييع الأسهم 5X التضخيم (التي قدمها مجموعة) 1: 5 في المياه عالية النقاء. إزالة البلمرة من الفريزر باستخدام كتلة تجميد (-20 درجة مئوية). تمييع البلمرة (التي قدمها عدة) 1:80 في حل التضخيم 1X ودوامة. إضافة البلمرة فورا قبل استخدام الخليط.
- إضافة هذا الحل إلى كل عينة (40 ميكرولتر لأطباق الزجاج السفلي 35 ملم). احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة قبل ساخنة لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اضغط على حل التضخيم، البلمرة من الشرائح.
9. غسل النهائي
- تغسل الشرائح في غسل العازلة 1X SSC لمدة 2 دقيقة. تغسل الشرائح العازلة في غسل SSC 0.01x لمدة 2 دقيقة. السماح للأطباق الجافة في RT في الظلام.
10. إعداد للتصوير
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بناء على خبرتنا باستخدام هذا البروتوكول، يمكن أن نوصي بأمان هذه الطريقة لتصور وتقدير من التفاعلات-ER الميتوكوندريا في الخلايا الثابتة. ، وتظهر الصور التمثيلية للفي التفاعلات خارج الموقع قرب ربط-تصور فحص-ER الميتوكوندريا في الخلية خط HuH7 سرطانة الكبد، وذلك باستخدام عدة أزواج من الأجسام المضادة. كما هو مبين في الشكل 2 بواسطة المجهر الفلورسنت، وتمثل كل نقطة حمراء على التفاعل بين اثنين من البروتينات المستهدفة، وتظهر نوى في الزرقاء. ونتيجة لسيطرة سلبية، أدى استخدام الأجسام المضادة الأولية واحد فقط لعدم وجود إشارة (الشكل 2، لوحة أ)، التحقق من صحة شرط الاعتراف المزدوج للفي القرب ربط الجيل إشارة الفحص الموقعي. تقليديا، نقوم بتحليل التفاعلات-ER الميتوكوندريا باستخدام زوج VDAC1 / IP3R1 من الأجسام المضادة (الشكل 2، لوحة ب). تشبه في التجربه فحص الموقع قرب ربطويمكن أيضا أن يؤديها نهاية الخبر مع GRP75 / IP3R1 أو CypD / IP3R1 أزواج من الأضداد (الشكل 2، لوحات جيم ودال، على التوالي)، منذ GRP75 هو كوصي اقتران VDAC وIP3R في واجهة MAM 11 وتجلى CypD للتفاعل مع وVDAC / GRP75 / IP3R الكالسيوم 2+ -channeling معقدة 12-14. الكمي من النقاط الفلورسنت يمكن القيام بها باستخدام إما النقطة مكتشف 15 أو برنامج ImageJ. كما وصفت نوى الخلايا باللون الأزرق، التحديد الكمي للتفاعلات ER-الميتوكوندريا في الخلية هي مناسبة لأداء. نحن التحقق من صحتها تماما هذا الاختبار 12، ويمكننا أن نستنتج أن هذه البروتينات المستهدفة هي مرشحة جيدة لدراسة التفاعلات-ER الميتوكوندريا.
الشكل 2: التصور VDAC1 / IP3R1، GRP75 / IP3R1 وCypD / IP3R1 التفاعلات التي كتبها في الموقع القرب Ligatioن الفحص في خلايا HuH7. تظهر نواة الخلية باللون الأزرق، ويصور التفاعلات بين البروتينات المستهدفة في الحمراء (63X التكبير، على مقياس بار = 20 ميكرون). وتبين لنا أن VDAC1، GRP75، وCypD التفاعل مع IP3R1. ونتيجة لسيطرة سلبية، علينا أن نبرهن على واحد فقط الأجسام المضادة الأولية لا يؤدي إلى مضان أحمر. للتحقق من صحة الاختبار، وقد أجريت عدة عناصر أخرى لإثبات أن VDAC1، GRP75، وCypD لا تتفاعل مع البروتينات ER الأخرى والتي IP3R1 لا تتفاعل مع بروتينات الميتوكوندريا أخرى (لا تظهر البيانات، انظر المرجع 9 و 13). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر جميع الناس في مختبرنا الذي ساهم في تحسين والتحقق من صحة البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل INSERM وكالة أبحاث وطنية (وكالة الاستخبارات الوطنية-09-JCJC-0116 وكالة الاستخبارات الوطنية-11-BSV1-033-02). وأيد ET خلال شهادة الدكتوراه من قبل زمالة بحثية من الوزارة الفرنسية للتعليم العالي والبحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | |
| Glycine | Sigma | G-8898 | |
| Triton | Sigma | T8532 | |
| 35 mm Glass bottom culture dishes | MatTeK corporation | P35G-0-14-C | |
| Blocking solution | Sigma | DUO-92004 or DUO-92002 | provided in the Duolink PLA probes, Sigma |
| VDAC1 antibody | Abcam | ab14734 | |
| IP3R1-H80 antibody | Santa Cruz | sc28614 | |
| CypD antibody | Abcam | ab110324 | |
| Grp75 antibody | Santa Cruz | sc13967 | |
| TBS 10x | euromedex | ET220 | Dilute to obtain 1x |
| Tween 100x | euromedex | 2001-B | dilute in TBS to obtain 0,01% |
| PLA Probes Mouse MINUS | Sigma | DUO-92004 | Duolink, Sigma |
| PLA Probes Rabbit PLUS | Sigma | DUO-92002 | Duolink, Sigma |
| Duolink detection reagents red | Sigma | DUO-92008 | Duolink, Sigma |
| Ligation solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Ligase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Amplification solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Polymerase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Duolink Mounting Medium | Sigma | DUO80102 | Duolink, Sigma |
| Softwares | |||
| Blob-finder software | BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm | ||
| ImageJ software | Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | ||
References
- Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
- Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
- Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
- Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169 (2012).
- Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
- Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
- Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
- Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
- Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
- Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
- Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
- Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
- Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. , (2016).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
- De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
- Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).
