Summary
Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gevoeligheid een endogene interacties tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondria in gefixeerde cellen. Het protocol is voorzien van een geoptimaliseerde in situ nabijheid ligation assay gericht op de inositol 1,4,5-trifosfaat receptor / glucose-gereguleerd eiwit 75 / voltage-afhankelijke anion kanaal / cyclofiline D-complex aan de mitochondria bijbehorende membraan interface.
Introduction
Mitochondria en het endoplasmatisch reticulum (ER) zijn niet onafhankelijk organellen in de cel, maar ze omgaan structureel en functioneel in contact plaatsen gedefinieerd als mitochondriën verbonden endoplasmatisch reticulum membranen (MAM). In feite, MTM overeen met gebieden waar de membranen van het ER en mitochondria nauw apposed, zodat interacties tussen eiwitten van beide kanten. Toch weet de membranen van deze organellen niet fuseren binnen deze regio's, zodat ze behouden hun afzonderlijke entiteiten. De MTM spelen een cruciale rol in de calcium (Ca 2+) en fosfolipiden transfer van ER naar mitochondriën, invloed energiemetabolisme en celoverleving 1-3.
De associatie tussen het ER en mitochondria werd eerst gevisualiseerd in de jaren 1970 met elektronenmicroscopie. Sindsdien, transmissie-elektronenmicroscopie 4,5, electron tomography 6,7 of immuno-lokalisatie van ER en mitochondriën-specifieke fluorofoors / fluorescente proteïnen werden 8 klassiek gebruikt om ER-mitochondriën interacties te bestuderen. Een ander bruikbaar middel voor de analyse van MAM is gebaseerd op het gebruik van subcellulaire fractionering. Het laat de isolatie van MAM fracties door differentiële ultracentrifugatie gekoppeld met een Percoll gradiënt 9. De eindproduct bevat MAM verrijkte fracties, dan zuivere fracties. In totaal hebben deze strategieën niet bijzonder gevoelig en / of kwantitatieve en zijn lastig om grote screening. Alternatief genetische benadering en de geneesmiddel-geïnduceerd fluorescent inter-organel linkers zijn ontstaan, maar niet de analyse van organel interacties zodat het endogene expressieniveaus van eiwitten 10.
Op basis van de ontdekking Szabadkai's van de IP3R / GRP75 / VDAC complex in het MAM 11, ontwikkelden we een kwantitatieve methode om de ER-mitochondria interacties te analyseren. We gebruikten de in situ omgeving ligatiOp assay voor het detecteren en kwantificeren van interacties tussen VDAC1 en IP3R1 twee organel-oppervlakte-eiwitten betrokken zijn bij de Ca2 + -channeling complex in het MAM interface gefixeerde cellen 12. Samengevat, zijn we gehybridiseerd VDAC1 het buitenste mitochondriale membraan (muis anti-VDAC1 primair antilichaam) en IP3R1 het ER membraan (konijn anti-IP3R1 primaire antilichaam) (Figuur 1, panel a). Vervolgens wordt aan de test, voegden we zowel anti-muis en anti-konijn IgG (muis en konijn nabijheid ligatie assay probes) die zijn geconjugeerd met complementaire oligonucleotide extensies. Als de twee eiwitten gericht zijn op een afstand onder 40 nm, kunnen de oligonucleotiden hybridiseren met de later toegevoegde connector oligo om de vorming van een circulair DNA-matrijs (Figuur 1, paneel b) toestaan. Deze circulaire DNA molecuul wordt geligeerd en geamplificeerd, waardoor een enkelstrengs DNA product covalent aan één van de probes nabijheid (Figuur 1, panel c) 6, nabijheid ligatie en amplificatie kan leiden tot daaropvolgende detectie door hybridisatie van Texas rood gemerkte oligonucleotiden probes (Figuur 1, panel d ). Elke fluorescerende stip staat wisselwerkingen tussen VDAC1 / IP3R1, waardoor de kwantificering van in situ ER-mitochondriën interacties in individuele cellen.
Figuur 1: Schematische weergave van de Opsporing van het endoplasmatisch reticulum-mitochondria interacties van In Situ Proximity Ligatie Assay. a) Een muis primair antilichaam gericht tegen VDAC1 en een konijn primair antilichaam tegen IP3R1 kan binden aan hun epitopen in de nabijheid van het MAM-interface, b) de toevoeging van een paar proximity ligatieprobesgericht tegen muizen en konijnen IgG. Deze sondes DNA strengen die sjablonen voor de ligatie van oligonucleotiden connector kan vormen verbonden. c) De circulaire DNA-streng gevormd na ligatie kunnen worden geamplificeerd en d) gevisualiseerd door microscopie als fluorescerend dot met Texas-rood gemerkte oligonucleotiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vertaald in situ nabijheid ligatie assay experimenten kunnen worden uitgevoerd met de GRP75 / IP3R1 paar antilichamen, evenals cyclofiline D (CypD) / IP3R1 antilichamen, aangezien CypD bleek interactie met de IP3R / GRP75 / VDAC complex in het MAM-interface 12-14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Solutions
- Bereid 10% formaldehyde in PBS (laag zout) door verdunning van 5,5 ml 37% formaldehyde in 14,5 ml PBS. Bereid 1 M glycine, pH 8,0, door het oplossen van 3,8 g glycine in 50 ml PBS; Verdun deze oplossing 100 mM glycine verkrijgen 1x PBS.
- Bereid 0,1% Triton-X100 in 1x PBS. Bereid 20x Saline natriumcitraat (SSC) met 3,0 M natriumchloride en 0,30 M trinatriumcitraat bereid in gedeïoniseerd water buffer met pH 7,0 bij 25 ° C. Verdun deze buffer om 1x en 0.01x met behulp van gedemineraliseerd water.
2. Fixatie van Cellen
LET OP: We gebruikten de HuH7 hepatocarcinoma cellijn in deze studie, maar deze methode is toepasbaar op andere hechtende celculturen.
- Plaat HuH7-cellen (gekweekt in DMEM 1 g / l glucose, aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en 0,01% penicilline-streptomycine stock) en 150.000 cellen per onbeklede 35-mm glazen onderste schaal. Bij het werken aan primaire celculturen Gebruik collageen beklede schalen.
- De volgende dag, verwijder het kweekmedium. Was de cellen met 1 ml PBS en zuig. Fixeer de cellen door toevoeging van 1 ml 10% formaldehyde en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur (KT) onder schudden.
- Stop de reactie met 1 ml 1 M glycine en meng door rotatie. Verwijder de stop reactieoplossing en was de cellen door toevoeging van 1 ml 1X PBS; ageren door rotatie en aspireren. Voeg 1 ml 100 mM glycine aan de cellen en incubeer ze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder roeren, en vervolgens aspireren.
LET OP: Het protocol kan hier worden gestopt en de volgende stappen kunnen worden uitgesteld naar een andere dag. In dat geval, voeg 1 ml 100 mM glycine en laten 4 ° C, indien noodzakelijk.
3. Permeabilisatie van cellen
- Voeg 1 ml 0,1% Triton-X100 in 1x PBS, incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur onder roeren, en vervolgens aspireren. Deze incubatietijd kan worden verhoogd tot 15 - 20 min bij het werken op primaire cel cultures (bijvoorbeeld primaire muizen hepatocyten). Was de cellen door toevoeging van 1 ml 1X PBS; aspireren.
4. Blocking
- Voeg 40 ul van blokkeeroplossing aan elk monster (door de kit); Dit volume kan worden verhoogd om het monster te dekken. Incubeer de gerechten voor 30 min bij 37 ° C in een vochtige kamer.
- Tik op het blokkeren oplossing af van de gerechten. Probeer om gelijke resterende volumes te krijgen voor elke dia, omdat dit de reproduceerbaarheid zal beïnvloeden. Laat niet de monsters droog!
5. primaire antilichamen
- Verdun de primaire antilichamen in 1x PBS en voeg de oplossing van de gerechten (VDAC1 muizenantilichaam: 1/100, IP3R1 konijn antilichaam: 1/500). Als alternatief kan GRP75 of CypD antilichamen (zowel muis antilichamen gebruikt 1/500) worden gebruikt in plaats van VDAC1.
- Incubeer overnacht in een vochtige kamer bij 4 ° C. Was de glaasjes tweemaal met gebruikmaking Tris gebufferde zoutoplossing met 0,01% Tween (TBS-T).
- Nabijheid ligatie assay probes werden door de kit. Kies probes volgens de soort van primaire antilichamen.
- Bereid de twee nabijheid ligatie assay probes 1: 5 in antilichaam verdunningsmiddel. Laat het mengsel zitten 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg de verdunde nabijheid ligatie assay probe oplossing. Incubeer de gerechten in een voorverwarmde vochtige kamer gedurende 1 uur bij 37 ° C. De afwas twee maal met TBS-T.
7. Ligatie
- Met de in situ detectie reagens Texas rood kit.
- Verdun de 5x ligatie voorraad (verstrekt door de kit) 1: 5 in een hoge zuiverheidsgraad water en meng goed. Verdun het ligase in 1x ligatie oplossing (geleverd door de kit) 01:40 en vortex. Wachten om de ligase toe tot vlak voor toevoeging aan de monsters.
- Voeg deze oplossing toe aan elk monster (40 ul van 35 mm glazen bodem gerechten) en incubeer de objectglaasjes in een voorverwarmde vochtigheid chamber gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Was de glaasjes tweemaal met TBS-T.
8. Amplification
LET OP: Wees voorzichtig, lichtgevoelige reagentia.
- Verdun de 5x versterking voorraad (verstrekt door de kit) 1: 5 in een hoge zuiverheidsgraad water. Verwijder het polymerase uit de vriezer met de bevriezing blok (-20 ° C). Verdun het polymerase (geleverd door de kit) 1:80 in 1x amplificatie oplossing en vortex. Voeg de polymerase onmiddellijk alvorens het mengsel.
- Voeg deze oplossing toe aan elk monster (40 ul voor 35-mm glazen bodem gerechten). Incubeer de glaasjes in een voorverwarmde vochtige kamer gedurende 100 min bij 37 ° C. Tik op de Amplification-Polymerase oplossing off van de dia's.
9. Final Wassen
- Was de dia's in 1 x SSC wasbuffer gedurende 2 min. Was de dia's in 0.01x SSC wasbuffer gedurende 2 min. Laat de gerechten drogen bij kamertemperatuur in het donker.
10. Voorbereiding for Imaging
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Op basis van onze ervaring met dit protocol, kunnen we gerust deze methode voor de visualisatie en kwantificatie van ER-mitochondria interacties in vaste cellen aanraden. Representatieve beelden van in situ nabijheid ligation-assay gevisualiseerd ER-mitochondria interacties in de HuH7 hepatocarcinoma cellijn, met behulp van verschillende paren van antilichamen, worden getoond. Zoals getoond in figuur 2 door fluorescentiemicroscopie, elke rode stip voor een wisselwerking tussen de twee beoogde eiwitten en kernen blauw weergegeven. Als negatieve controle, het gebruik van slechts één primaire antilichaam tot geen signaal (Figuur 2, panel a), het valideren van de dubbele vereiste erkenning in situ nabijheid ligation assay signaalgeneratie. Klassiek, analyseren we ER-mitochondriën interacties met behulp van de VDAC1 / IP3R1 paar antilichamen (figuur 2, paneel b). Vertaald in situ nabijheid ligation assay Experiments kan ook worden uitgevoerd met de GRP75 / IP3R1 of CypD / IP3R1 paren antilichamen (Figuur 2, panelen c en d, respectievelijk), aangezien GRP75 een chaperone koppeling VDAC en IP3R de MAM-interface 11 en CypD werd aangetoond dat interactie met de VDAC / GRP75 / IP3R Ca 2+ -channeling complex 12-14. Kwantificering van fluorescente dots kunnen worden uitgevoerd met behulp van Blob-finder 15 of ImageJ software. Als de kernen van cellen gelabeld in blauw, kwantificatie van de ER-interacties mitochondriën per cel geschikt te voeren. We grondig gevalideerde deze test 12, en we kunnen concluderen dat deze gerichte eiwitten zijn goede kandidaten om ER-mitochondria interacties te bestuderen.
Figuur 2: Visualisatie van de VDAC1 / IP3R1, GRP75 / IP3R1 en CypD / IP3R1 interacties van In Situ Proximity Ligation Assay in HuH7-cellen. Celkernen verschijnen in blauw, en interacties tussen de twee beoogde eiwitten zijn afgebeeld in het rood (63x vergroting; schaal bar = 20 pm). We laten zien dat VDAC1, GRP75 en CypD interactie met IP3R1. Als negatieve controle, tonen we aan dat slechts één primaire antilichaam niet tot rode fluorescentie. Om de test te valideren, hebben verscheidene andere controles uitgevoerd om aan te tonen dat VDAC1, GRP75 en CypD geen interactie met andere ER eiwitten en IP3R1 geen interactie met andere mitochondriale eiwitten (gegevens niet getoond, zie ref. 9 en 13). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken alle mensen in ons laboratorium die hebben bijgedragen aan het optimaliseren en valideren van het protocol. Dit werk werd ondersteund door INSERM en de nationale onderzoeksbureau (ANR-09-JCJC-0116 EN ANR-11-BSV1-033-02). ET werd gesteund tijdens haar promotieonderzoek door een onderzoeksbeurs van het Franse ministerie van hoger onderwijs en onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | |
| Glycine | Sigma | G-8898 | |
| Triton | Sigma | T8532 | |
| 35 mm Glass bottom culture dishes | MatTeK corporation | P35G-0-14-C | |
| Blocking solution | Sigma | DUO-92004 or DUO-92002 | provided in the Duolink PLA probes, Sigma |
| VDAC1 antibody | Abcam | ab14734 | |
| IP3R1-H80 antibody | Santa Cruz | sc28614 | |
| CypD antibody | Abcam | ab110324 | |
| Grp75 antibody | Santa Cruz | sc13967 | |
| TBS 10x | euromedex | ET220 | Dilute to obtain 1x |
| Tween 100x | euromedex | 2001-B | dilute in TBS to obtain 0,01% |
| PLA Probes Mouse MINUS | Sigma | DUO-92004 | Duolink, Sigma |
| PLA Probes Rabbit PLUS | Sigma | DUO-92002 | Duolink, Sigma |
| Duolink detection reagents red | Sigma | DUO-92008 | Duolink, Sigma |
| Ligation solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Ligase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Amplification solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Polymerase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Duolink Mounting Medium | Sigma | DUO80102 | Duolink, Sigma |
| Softwares | |||
| Blob-finder software | BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm | ||
| ImageJ software | Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | ||
References
- Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
- Giorgi, C., et al. Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications. Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).
- Phillips, M. J., Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).
- Cosson, P., et al. The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes. PLoS One. 7, 39169 (2012).
- Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).
- Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. Biofactors. 8, 225-228 (1998).
- Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280, 1763-1766 (1998).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).
- Csordas, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Szabadkai, G., et al. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).
- Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).
- Paillard, M., et al. Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury. Circulation. 128, 1555-1565 (2013).
- Rieusset, J., et al. Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance. Diabetologia. 59, 614-623 (2016).
- Allalou, A., Wahlby, C. BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry. Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).
- Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of molecular cell biology. , (2016).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature methods. 3, 995-1000 (2006).
- De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane. FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).
- Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. Mortalin: present and prospective. Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).
