Summary
Aqui, descrevemos um procedimento para visualizar e quantificar com alta sensibilidade as interações endógenos entre o retículo endoplasmático e mitocôndrias nas células fixas. O protocolo apresenta um otimizado no ensaio de ligação de proximidade situ visando o inositol 1,4,5-trifosfato de receptor / proteína regulada por glucose 75 / complexo D canal de ânions / ciclofilina dependente da tensão na interface membrana associada à mitocôndria.
Introduction
As mitocôndrias e no retículo endoplasmático (ER) não são independentes organelos na célula, mas eles interagem funcionalmente e estruturalmente em locais de contacto definidos como membranas do retículo endoplasmático associada-mitocôndrias (MAM). Na verdade, MAMs correspondem a regiões onde as membranas do ER e mitocôndrias são intimamente apostos, permitindo interacções entre proteínas a partir de ambos os lados. No entanto, as membranas das organelas estas não fundem dentro destas regiões, de modo que eles mantêm as suas entidades separadas. Os MAMs desempenhar um papel crucial em cálcio (Ca2 +) e de transferência de fosfolípidos de ER para a mitocôndria, afectando o metabolismo da energia e a sobrevivência de células 3/1.
A associação entre o ER e mitocôndrias foi visualizado pela primeira vez na década de 1970 com microscopia eletrônica. Desde então, microscopia eletrônica de transmissão 4,5, tomografia eletrônica de 6,7 ou imuno-localização de ER e específicos de mitocôndrias fluoróforos / proteínas fluorescentes 8 foram classicamente utilizada para estudar interacções ER-mitocôndrias. Outra ferramenta útil para a análise de MAM baseia-se na utilização de fraccionamento subcelular. Ele permite o isolamento de fracções MAM por ultracentrifugação diferencial acoplado a um gradiente de Percoll 9. No entanto, o produto final contém fracções enriquecidas MAM, em vez de fracções puras. No seu conjunto, estas estratégias não são particularmente sensíveis e / ou quantitativa, e eles não são facilmente adaptado a uma grande rastreio. Alternativamente, as abordagens genéticas utilizando ligantes fluorescentes inter-organelos drogas induzível emergiram, mas que não permitem a análise de interacções de organelos nos níveis de expressão de proteínas endógenas 10.
Com base na descoberta de Szabadkai do complexo IP3R / Grp75 / VDAC no MAM 11, foi desenvolvido um método quantitativo para analisar as interações ER-mitocôndrias. Utilizou-se o no ligati proximidade situem ensaio para detectar e quantificar interacções entre VDAC1 e IP3R1, duas proteínas de organelos de superfície envolvidas no Ca 2+ -channeling complexo na interface MAM em células fixas 12. Resumidamente, nós sondadas VDAC1 na membrana mitocondrial externa (anticorpo primário anti-rato VDAC1) e IP3R1 na membrana ER (anticorpo primário anti-coelho IP3R1) (Figura 1, painel A). Em seguida, de acordo com o ensaio, foram adicionados tanto anti-ratinho e anti-IgG de coelho (sondas de ensaio do rato e coelho proximidade ligadura), o qual está conjugado com extensões de oligonucleótido complementar. Se as duas proteínas alvo estão a uma distância inferior a 40 nm, os oligonucleótidos podem hibridizar com os oligos conector posteriormente adicionada para permitir a formação de um modelo circular de ADN (Figura 1, painel b). Esta molécula de ADN circular é ligado e amplificado, criação de um produto de ADN de cadeia simples ligado covalentemente a um dos sensores de proximidade (Figura 1, painel C) 6, a ligação de proximidade e de amplificação pode ser feita, conduzindo à subsequente detecção devido à hibridação da Texas oligonucleótidos vermelho-sondas marcadas (Figura 1, painel D ). Cada ponto representa fluorescente interacções entre VDAC1 / IP3R1, permitindo, assim, a quantificação da in situ interacções ER-mitocôndria em células individuais.
Figura 1: Esquema Ilustração da detecção das interações retículo endoplasmático-mitocôndrias por In Situ Proximidade Ligadura de Ensaio. a) um anticorpo de ratinho dirigido contra o primário VDAC1 e um anticorpo primário de coelho dirigido contra IP3R1 pode se ligarem aos seus epitopos em proximidade na interface MAM, b) A adição de um par de sondas de ligação de proximidadedirigido contra rato e IgG de coelho. Estas sondas têm anexado fitas de DNA que podem formar modelos para a ligação de oligos conector. c) A cadeia de ADN circular formado após a ligação pode ser amplificado e d) visualizadas por microscopia fluorescente como um ponto usando oligonucleótidos marcados Texas-red. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Semelhante em experiências de ensaio in situ de proximidade de ligação pode ser realizada com o par Grp75 / IP3R1 de anticorpos, bem como a ciclofilina D (CypD) / anticorpos IP3R1, considerando que CypD foi mostrado para interagir com o complexo IP3R / Grp75 / VDAC na interface MAM 12-14.
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Protocol
1. Preparação de Soluções
- Prepare a 10% de formaldeído em PBS (sal baixo) por diluição de 5,5 ml de formaldeído a 37% em 14,5 ml de PBS. Prepare 1 M de glicina, pH 8,0, dissolvendo 3,8 g de glicina em 50 ml de PBS; diluir esta solução para se obter glicina 100 mM em PBS 1x.
- Prepare 0,1% de Triton-X100 em PBS 1x. Prepare 20x Solução salina de citrato de sódio (SSC) utilizando 3,0 M de cloreto de sódio e citrato de trissódio 0,30 M preparada num tampão de água desionizada com pH 7,0 a 25 ° C. Diluir esse buffer para 1x e 0.01x usando água deionizada.
2. Fixação de Células
NOTA: Utilizou-se a linha celular de carcinoma hepatocelular Huh7 neste estudo, mas este método é aplicável a outras culturas de células aderentes.
- células da placa HuH7 (cultivadas em DMEM, 1 g / L de glicose, suplementado com 10% de soro de vitelo fetal e penicilina-estreptomicina estoque 0,01%) a 150.000 células por placa com fundo de vidro não revestido de 35 mm. Ao trabalhar em células primáriasculturas, usar pratos revestidos com colagénio.
- No dia seguinte, remover o meio de cultura. Lavam-se as células com 1 ml de PBS e aspirar. Fixar as células por adição de 1 ml de formaldeído a 10% e incubar durante 10 min à temperatura ambiente (TA), sob agitação.
- Parar a reacção com 1 ml de 1 M de glicina e misturar por rotação. Remover a solução de reacção parada e lavar as células por adição de 1 ml de PBS 1x; Agitar, por rotação e aspirado. Adicionar 1 ml de glicina 100 mM para as células e incubar durante 15 min à TA com agitação, e, em seguida, aspirado.
NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui e as etapas a seguir pode ser adiada para outro dia. Nesse caso, adicionar 1 ml de glicina 100 mM e manter a 4 ° C, se necessário.
3. A permeabilização de células
- Adicionar 1 ml de 0,1% de Triton-X100 em PBS 1x, incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente sob agitação, e, em seguida, aspirado. Este tempo de incubação pode ser aumentada até 15 - 20 min quando se trabalha em cultur célula primáriaES (por exemplo, hepatócitos primários ratos). Lavam-se as células por adição de 1 ml de PBS 1x; aspirar.
4. Bloqueio
- Adicionar 40 ul de solução para cada amostra (fornecida pelo kit) de bloqueio; este volume pode ser aumentado, a fim de cobrir a amostra. Incubar os pratos durante 30 min a 37 ° C numa câmara de humidade.
- Toque na solução de bloqueio fora dos pratos. Tente obter volumes residuais iguais para cada slide, como isso vai afetar a reprodutibilidade. Não deixe que as amostras de secar!
5. Anticorpos Primários
- Diluir os anticorpos primários em 1x PBS e adicionar a solução para os pratos (anticorpo de rato VDAC1: 1/100, anticorpo de coelho IP3R1: 1/500). Alternativamente, os anticorpos ou CypD Grp75 (ambos os anticorpos de ratinho utilizados em 1/500) pode ser usado em vez de VDAC1.
- Incubar durante a noite numa câmara de humidade a 4 ° C. Lavar as lâminas duas vezes com tampão salino Tris com Tween (TBS-T) de 0,01%.
- sondas de ensaio de proximidade de ligação são fornecidos pelo kit. Escolha sondas de acordo com as espécies de anticorpos primários.
- Prepare os dois proximidade sondas de ensaio de ligação 1: 5 em diluente de anticorpo. Deixar a mistura em repouso durante 20 min à temperatura ambiente. Adicionar a solução de sonda de ensaio de proximidade de ligação diluída. Incubar os pratos em uma câmara de humidade pré-aquecida durante 1 hora a 37 ° C. Lavar os pratos duas vezes com TBS-T.
7. Ligadura
- Utilizar o reagente de detecção in situ em Texas kit de vermelho.
- Dilui-se a ligadura da 5x (fornecida pelo kit) 1: 5 em água de elevada pureza e misturar bem. Dilui-se a solução a ligase em 1x de ligação (fornecida pelo kit) 01:40 e vortex. Espera para adicionar a ligase até imediatamente antes da adição às amostras.
- Adicionar esta solução para cada amostra (40 ul para pratos com fundo de vidro de 35 mm) e incubar os slides em uma cham humidade pré-aquecidoBER durante 30 min a 37 ° C. Lavar as lâminas duas vezes com TBS-T.
8. Amplification
Nota: Tenha cuidado, luz reagentes sensíveis.
- Dilui-se a amplificação da 5x (fornecida pelo kit) 1: 5 em água de elevada pureza. Remover a polimerase a partir do congelador utilizando o bloco de congelação (-20 ° C). Dilui-se a polimerase (fornecida pelo kit) 1:80 em solução a amplificação 1x e vortex. Adicionar a polimerase imediatamente antes de utilizar a mistura.
- Adicionar esta solução para cada amostra (40 ul para pratos com fundo de vidro de 35 mm). Incubar as lâminas numa câmara húmida pré-aquecida durante 100 minutos a 37 ° C. Toque a solução de amplificação da polimerase fora dos slides.
9. lavagem final
- Lavar as lâminas em tampão de lavagem 1x SSC durante 2 minutos. Lavar as lâminas em tampão de lavagem SSC 0.01x por 2 min. Deixe os pratos secar à temperatura ambiente no escuro.
10. Preparação para criação de imagens
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Representative Results
Com base em nossa experiência de utilização deste protocolo, podemos seguramente recomendar este método para a visualização e quantificação das interações ER-mitocôndrias nas células fixas. Imagens representativas de interacções in situ em proximidade de ligação de ensaio visualizado-ER-mitocôndrias na linha celular de carcinoma hepatocelular Huh7, utilizando vários pares de anticorpos, são mostradas. Como mostrado na Figura 2 por microscopia de fluorescência, cada ponto vermelho representa uma interacção entre as duas proteínas específicas, e núcleos aparecem em azul. Como controlo negativo, a utilização de apenas um anticorpo primário conduziu a nenhum sinal (Figura 2, painel A), validando o requisito para o reconhecimento dupla na geração de sinal de ensaio de proximidade de ligação in situ. Classicamente, que a análise da interacção ER-mitocôndria utilizando o par de VDAC1 / IP3R1 de anticorpos (Figura 2, painel b). Semelhante em experimen ensaio situ proximidade ligaduraTS também poderia ser realizada com os Grp75 IP3R1 ou CypD / IP3R1 pares de anticorpos (Figura 2, painéis C e D, respectivamente) /, desde Grp75 é uma chaperona acoplamento VDAC e IP3R na interface MAM 11 e CypD foi demonstrada para interagir com o VDAC / Grp75 / IP3R Ca 2+ -channeling complexo 12-14. Quantificação de pontos fluorescentes pode ser realizada utilizando-Blob localizador 15 ou software ImageJ. À medida que os núcleos de células são marcadas em azul, quantificações de as interacções ER-mitocôndrias por célula são adequados para executar. Nós absolutamente validado neste ensaio 12, e podemos concluir que estas proteínas alvo são bons candidatos para estudar interações ER-mitocôndrias.
Figura 2: Visualização da VDAC1 / IP3R1, Grp75 / IP3R1 e CypD / IP3R1 Interações por In Situ Proximidade Ligation Composição em células HuH7. núcleos celulares aparecem em azul, e as interações entre as duas proteínas-alvo são representadas em vermelho (63X de ampliação; barra de escala = 20 mm). Mostramos que VDAC1, Grp75 e CypD interagir com IP3R1. Como um controlo negativo, foi demonstrado que apenas um anticorpo primário não conduz a fluorescência vermelha. Para validar o ensaio, vários outros controlos foram realizados para demonstrar que VDAC1, Grp75 e CypD não interagem com outras proteínas de ER e que IP3R1 não interage com outras proteínas mitocondriais (dados não mostrados, ver ref. 9 e 13). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Acknowledgments
Agradecemos a todas as pessoas em nosso laboratório que contribuíram para otimizar e validar o protocolo. Este trabalho foi apoiado pelo INSERM ea agência nacional de pesquisa (ANR-09-JCJC-0116 E ANR-11-BSV1-033-02). ET foi apoiado durante o seu doutoramento por uma bolsa de pesquisa do ministério francês de ensino superior e pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formaldehyde | Sigma | F-8775 | |
| Glycine | Sigma | G-8898 | |
| Triton | Sigma | T8532 | |
| 35 mm Glass bottom culture dishes | MatTeK corporation | P35G-0-14-C | |
| Blocking solution | Sigma | DUO-92004 or DUO-92002 | provided in the Duolink PLA probes, Sigma |
| VDAC1 antibody | Abcam | ab14734 | |
| IP3R1-H80 antibody | Santa Cruz | sc28614 | |
| CypD antibody | Abcam | ab110324 | |
| Grp75 antibody | Santa Cruz | sc13967 | |
| TBS 10x | euromedex | ET220 | Dilute to obtain 1x |
| Tween 100x | euromedex | 2001-B | dilute in TBS to obtain 0,01% |
| PLA Probes Mouse MINUS | Sigma | DUO-92004 | Duolink, Sigma |
| PLA Probes Rabbit PLUS | Sigma | DUO-92002 | Duolink, Sigma |
| Duolink detection reagents red | Sigma | DUO-92008 | Duolink, Sigma |
| Ligation solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Ligase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Amplification solution | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Polymerase | Sigma | DUO-92008 | Part of the Duolink detection reagents red, Sigma |
| Duolink Mounting Medium | Sigma | DUO80102 | Duolink, Sigma |
| Softwares | |||
| Blob-finder software | BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm | ||
| ImageJ software | Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | ||
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