Vi presenterar ett immunofluorescens imaging-baserad metod för rumsliga och tidsmässiga lokalisering av aktiv ERK i dissekerade C. elegans gonad. Protokollet som beskrivs här kan anpassas för visualisering av någon signalering eller strukturellt protein i C. elegans gonad, förutsatt att ett lämpligt antikroppsreagens är tillgänglig.
Den evolutionärt konserverad extracellulära signalomvandlande RTK-RAS-ERK-vägen är en viktig kinassignalkaskad som styr flera cellulära och utvecklingsprocesser i huvudsak via aktivering av ERK, terminal kinas av vägen. Tight reglering av ERK-aktivitet är nödvändig för normal utveckling och homeostas; alltför aktiva ERK resultat i överdriven cellulär proliferation, medan active ERK orsakar celldöd. C. elegans är ett kraftfullt modellsystem som har hjälpt karakterisera funktion och reglering av RTK-RAS-ERK signalväg under utveckling. I synnerhet, är en förutsättning för C. RTK-RAS-ERK-vägen elegans könsceller utveckling, som är i fokus för denna metod. Genom att använda antikroppar som är specifika för den aktiva, diphosphorylated form av ERK (dpERK), den stereotypa lokaliseringsmönster kan visualiseras i nedärvda. Eftersom detta mönster är både rumsligt och tidsmässigt controlled, förmågan att reproducerbart analysera dpERK är användbara för att identifiera regulatorer av reaktionsvägen som påverkar dpERK signalens varaktighet och amplitud och därmed arvslinjeutveckling. Här visar vi hur man framgångsrikt att dissekera, bets, och bild dpERK inom C. elegans gonad. Denna metod kan anpassas för spatial lokalisering av någon signalering eller strukturellt protein i C. elegans gonad, förutsatt en antikropp kompatibel med immunofluorescens finns.
Receptor (RTK) -RAt Sarkom (RAS) -Extracellular signal Regulated Kinase (ERK) -vägen förmedlar extracellulära signaler genom en konserverad kinaskaskad som resulterar i fosforyleringen och aktivering av ERK 3/1. ERK proteiner är medlemmar i den konserverade prolin-serin / treonin MAP (Mitogen aktiverat protein) kinasfamiljen, och påverkas direkt av MEK via dubbla fosforylering på treonin (T) och tyrosin (Y) av den konserverade TEY motiv. Aktiv ERK (kallad diphosphorylated ERK, eller dpERK) reglerar sedan många cellulära och utvecklingsprocesser genom dess fosforylering av ett batteri av nedströms substrat 1-3. Således onormal ERK aktivitet leder till många cell och utvecklingsdefekter 4-7.
Strängare reglering av ERK-aktivitet är kritisk för normal utveckling: i däggdjurssystem för mycket ERK aktivitet leder till överdriven celldelning ledandetill onkogen tillväxt; för lite aktivitet leder till celldöd 4,6. Dessutom förändringar i längden på ERK-aktivitet kan också leda till tydliga resultat: i PC12-celler, ERK aktivering för 30 minuter eller mindre inducerar celltillväxt, men ERK aktivering för 60 minuter eller mer inducerar neuronal differentiering 8,9. Tight reglering av ERK-aktivitet är därför absolut nödvändigt för normal utveckling och homeostas.
C. elegans är en kraftfull och genetiskt formbar modellsystem för att dissekera funktion och reglering av RTK-RAS-ERK signalväg 3,10-15. I förhållande till däggdjurssystem, som innehåller flera gener för RAS och ERK, C. elegans innehåller en RAS-genen (let-60) och en ERK-gen (mpk – 1), vilket gör det till en genetiskt mer lättvindig system där att dissekera funktionen av denna reaktionsväg 3,10-14. C. elegans arvslinje är väsentligen ett rör som består av mitotiskastamceller vid sin distala ände och mogna oocyter vid sin proximala ände (figur 1) 16. Könsceller initiera meios alldeles proximalt till den distala mitotiska zonen, och framsteg genom en utsträckt meiotisk profas (pachytene), varefter de börjar bildas oocyter i loopregionen, slutligen genomgår oocytmognad i det proximala området 16.
Genetiska studier från flera laboratorier, inklusive vår egen, har visat att RTK-RAS-ERK-vägen är avgörande för könsceller utveckling i C. elegans 12,13,15,17-19. Specifikt fann vi att ERK kontroller och samordnar åtminstone nio olika biologiska processer under könsceller utveckling, från utvecklings växlar såsom könsceller apoptos att cellbiologiska processer såsom äggcellen tillväxt 11,18. Ungefär som i däggdjurssystem, för mycket ERK aktivitet i C. elegans nedärvda resulterar i produktion av flera små ägg, medan för little aktivitet resulterar i en stor äggcellen 11. Således är en förutsättning för normal könsceller utveckling stram reglering av dpERK. Den aktiva formen av ERK, såsom visualiseras genom en antikropp specifik för dpERK visar en stereotyp, dynamisk, bimodal lokalisering mönster: dpERK är hög under mitten pachytene (zon 1, figur 1) som är låg i loopregionen och hög igen i moget oocyter (Zon 2, Figur 1). Nyligen fann vi att näring verkar genom insulinliknande tillväxtfaktorreceptor-1 (daf-2) för att aktivera ERK i zon 1 12; tidigare arbete visade att spermier signalen (via ephrin receptortyrosinkinas) aktiverar ERK i zon 2 13.
Med tanke på att aktiva ERK fungerar som en reostat i könsceller för att reglera äggcellen tillväxt, rumsliga och tids lokalisering, liksom amplitud dpERK, är nyckeln till att förstå sin normala signaler resultatet. Med användning av metoden som beskrivs här, förändringar istereotypa lokalisering av dpERK kan lätt övervakas och förutsägelser erhållas på effekterna av miljö- eller genetiska störningar på ERK-aktivitet och därmed funktionen. Således, analys för dpERK möjliggör en omfattande förståelse för sin roll under könsceller utveckling.
Aktiv ERK (dpERK) följer en stereotyp rumslig och dynamisk lokaliseringsmönster i C. elegans arvslinje. Detta stereotypa dpERK rumsliga mönstret (figur 5), och amplitud hos en vuxen C. elegans gonad, kan effektivt korreleras med de många biologiska processer som ERK reglerar. Till exempel, en oförmåga att aktivera ERK i zon 2 resulterar i ett gripande i oocyter i profas av meios, en fenotyp observerats hos kvinnliga germlines som inte anger sperma, och därför inte aktiverar ERK i mogna ägg (Figur 5). Parning med hanar resultat i effektiv ackumulering av dpERK i zon 2 i den kvinnliga germlines 11,13, tillsammans med uppkomsten av äggcellen mognad och ägglossning. Således analys av rumsliga mönster och tids aktivering av dpERK på vissa genetiska störningar (t.ex. RNA-interferens medierad geninaktivering) eller kemiska behandlingar möjliggör identifiering av faktorer som förordsen ERK signaleringen och därmed ERK beroende biologiska processer. Sådana analyser möjliggör också upptäckten av nya genetiska interaktioner mellan signalvägar.
En kritisk flaskhals för varje avbildning baserad analys är tillgången på funktionella reagens såsom antikroppar som är specifika för ansökan. Om en sådan reagens existerar sedan metoder såsom den som beskrivits ovan kan lätt anpassas för analys av lokalisering mönster för vilket protein som helst av intresse. Ansökan är således begränsad av tillgången på en fungerande antikropp. Dessutom, eftersom metoden beskriver dissekering och färgning vid en given utvecklings tid, endast gör det möjligt att fånga information i en tidsram, och inte belysa dynamiken eller protein reglering i realtid eller hastigheten av proteinomsättningen.
Den ovan beskrivna metoden är anpassad från Francis et al. 23, som är skild från den Seydoux och Dunn metod 24 för gonad extrudering och antikroppsfärgning. Metoden bygger på Francis et al. Kommer att kallas "suspensionsmetoden" och Seydoux och Dunn metod som kallas "frys sprickbildning metod" för jämförelse. Upphängnings Metoden har varit mycket effektiva i våra händer för att erhålla reproducerbara lokaliseringsmönster signalmolekyler som dpERK, som till sin natur är mer känsliga för hårda hantering. När det gäller dpERK lokalisering, i vår erfarenhet, är signalen i zon 1 praktiskt taget omöjlig att upptäcka med frys sprickbildning metoden. Dessutom provtorkning, som ofta kan förekomma med den fryst sprickbildning metod, resulterar i falska signaler antikropps. Suspensionen metod minimerar prov torkning, eftersom gonaderna suspenderas i vätska under hela processen. Vi finner också att upphängnings metoden är användbar för att avbilda flera olika genotyper på en enda bild. Till exempel, om två genotyper, såsom hermafroditer vshonor är att direkt jämföras för dpERK lokalisering, de två genotypema kan blandas samman och bearbetas. Detta är möjligt eftersom de fenotyper är distinkta och kan urskiljas via DAPI morfologier. Färgning i samma rör följt av avbildning på samma glas möjliggör direkt jämförelse mellan könskörtlarna från olika genotyper. Alternativt, om DAPI morfologier inte kan särskiljas, då kan antas en tvåstegs antikroppar färgning. Först varje enskild genotyp behandlas med två olika antikroppar, antikropp A för WT och antikropp B för mutant (båda antikropparna måste höjas i en värd som skiljer sig från den dpERK antikropp). När väl de två genotyper har färgats med den primära antikroppen, och tvättas, kan de blandas samman i ett rör och nu färgades med dpERK antikropp, följt av en sekundär antikroppsbehandling för att visualisera alla antikropparna i röret. En möjlighet att jämföra olika genotyper på en enda bild, speciellt när deductions av aktiveringsmönster görs säkerställer korrekta tolkningar som inte påverkas av distinkta färgningsförhållanden.
Medan fördelaktig, det finns flera steg i hela upphängningsmetod som kräver noggrann hantering. Det är viktigt att de dissektioner uppträder på ett tidseffektivt sätt; viktigare, bör de dissektioner inte ta över 5 min. Längre dissektion gånger resulterar i variabel dpERK signal, som ofta kan misstolkas som reglerade förändringar i ERK aktivering, snarare än som tekniska fel. Det är viktigt att börja med över 100 till 150 djur för varje dissektion eftersom hela olika tvättsteg könskörtlar kan lätt förloras från rören på grund av pipetteringsfel. Förlust av könskörtlar kan minskas antingen genom att dissekera i flera små partier (t.ex. tre partier av 50 djur vardera) som kan kombineras, eller genom att dissekera en stor sats av 150. En annan utmaning är att få könskörtlarna att ligga i en väl fördelade bildningpå objektglaset, så att hela distala gonad kan avbildas. För att möjliggöra detta, använda en ögonfrans på en tändsticka eller en drog pipett till rymden ut könskörtlarna. Emellertid bör man vara noga med att inte skada gonaderna under denna process. Ofta med dessa tekniker tar det flera försök att bemästra de dissektioner samt arrangemang i könskörtlarna på bilderna.
När denna teknik har bemästrat, tjänar den som en kraftfull metod för varierande biologiska analyser, och kan användas för att studera mer än bara dpERK nivåer. Exempelvis kan denna metod användas för att visualisera aktiva p38 nivåer, eller aktiva CDK nivåer, eller vilket protein som helst för vilken en antikropp-reagens existerar. Dessutom kan förfarandet vara kopplad med en kemisk inhibering skärmen i hela djur för analys av nya inhibitorer eller aktivatorer av reaktionsvägen, via analys med avseende på dpERK nivåer. Detta kommer att möjliggöra en in vivo avläsning av både reaktion och känslighet för de hämmare som kan interact med RTK-RAS-ERK signalväg. Dessutom kan denna metod användas i antikroppskombinationer med ett flertal signalutgångar som alla kan användas och visualiseras på en gång. Använda flera antikroppar medger korrelation mellan flera vägar, deras aktiveringsstatus, och utfall alla inom samma vävnad, vilket möjliggör en bättre förståelse av dessa interaktioner. Dessa är bara några exempel på ytterligare tillämpningar av denna metod, men detta system kan modifieras för att studera flera forskningsintressen.
The authors have nothing to disclose.
Work in the Arur Lab is supported by grants from the National Institutes of Health, NIHGM98200; Cancer Prevention Research Institute of Texas, CPRIT RP160023; the American Cancer Society Research Scholar Award (ACS RSG014-044-DDC); and by the Anna Fuller Funds.
Agarose | Sigma Inc. | A9539 | Dissolve 2 g in 100 ml to make the 2% agarose |
Flat bottom glass watch dish | Agar Scientific | AGL4161 | We use glass, because dissected gonads often stick to plastic |
25 gauge needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
Syringes (could be 1 or 5 ml) | BD Syringes | 1 ml: BD 309659 | |
Microscope slides (25mm x 75mm x 1.0mm) | Fisherbrand | 12-550-343 | |
Coverslips (24x50mm) | Corning | 2935-245 | |
5ml glass conical tube | Corning | 8060-5 | |
9" disposable Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20D | |
Clinical bench top centrifuge | |||
Glass tubes (6x50mm) | Fisherbrand | 14-958-A | |
*M9 solution | |||
Levamisole | Sigma | L9756 | |
3% Paraformaldehyde | Electron microscopy services | 17500 | Obtained as 16% solutions in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer |
**PBS | |||
1X PBST | 1X PBS with 0.1% Tween 20 | ||
Methanol | Electron microscopy services | 18510 | |
Normal goat serum (NGS) | Cell Signaling | 5425 | Diluted to 30% in 1x PBST |
MAPKYT (dpERK) antibody | Sigma Inc. | M9692 | Dilution 1:400 in 30% NGS |
Secondary antibody | Invitrogen | A-11005 | Dilution 1:500 in 30% NGS |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
*M9 Buffer Recipe | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. | ||
**PBS (1X) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2.2H2O, 0.10 g MgCl2.6H2O, H2O to 1 litre | ||
Nematode Growth Medium (NGM) | 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 minutes. Cool, and add 1 mL of 1M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1M MgSO4 and 25 mL of 1M KPO4. |