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Engineering

तरल में आयाम मॉडुलन परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ उप नैनोमीटर संकल्प इमेजिंग

Published: December 20, 2016 doi: 10.3791/54924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physics Department, Durham University
* These authors contributed equally

Summary

हम उप नैनोमीटर संकल्प छवियों आयाम मॉडुलन (दोहन मोड) तरल में परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त करने के लिए एक तरीका मौजूद है। विधि वाणिज्यिक परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी पर प्रदर्शन किया है। हम मानकों की हमारी पसंद के पीछे तर्क समझाने और संकल्प अनुकूलन के लिए रणनीति का सुझाव।

Introduction

अपने आविष्कार के बाद से, तीन दशक पहले परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) 1 से ही पसंद का एक तकनीक के रूप में नैनो पैमाने पर नमूनों की जांच के लिए स्थापित किया है, विशेष रूप से जहां स्थूल सतह क्षेत्रों से अधिक औसत संभव नहीं है और स्थानीय जानकारी आवश्यक है। एक ठेठ AFM माप में, एक लचीला ब्रैकट के विक्षेपन अणुओं की एक छोटी संख्या है और एक UltraSharp टिप ब्रैकट के अंत में घुड़सवार के बीच बातचीत बल यों इस्तेमाल किया जाता है। बातचीत के प्रकार और timescales माना जाता है पर निर्भर करता है, के बारे में जानकारी की एक विस्तृत श्रृंखला मुलायम जैविक झिल्लियों 2,3 के viscoelastic संपत्तियों सहित, प्राप्त किया जा सकता है, एक ही रासायनिक की ताकत या आणविक बांड 4,5, एक की atomistic विवरण सतह 6 - 8, चुंबकीय 9, कैपेसिटिव 10, 11, 12,13 थर्मल और रासायनिक 14 नमूने के गुणों का आयोजन 16 वर्ष की एक विस्तृत श्रृंखला पर और इस तरह के वैक्यूम 17, 11,18 गैस या तरल 19,20 के रूप में कई वातावरण में काम करने की क्षमता है क्योंकि यह जांच और नमूना के बीच एक विशिष्ट बल पर भरोसा नहीं करता ।

अभ्यास में, तथापि, परिवेश के अलावा अन्य स्थितियों में AFM ऑपरेटिंग चुनौतीपूर्ण और कई प्रकाशित परिणाम अभी भी हवा में प्राप्त कर रहे हैं हो सकता है। एक जोड़ा कठिनाई तथ्य यह है कि यह आम तौर पर आदेश बड़े घर्षण बलों से बचने के द्वारा दोनों टिप और नमूना बनाए रखने के लिए गतिशील मोड (हिल टिप) में AFM संचालित करने के लिए आवश्यक है से आता है। हालांकि अधिक चुनौतीपूर्ण है, गतिशील आपरेशन सिद्धांत में नमूना विश्लेषण किया बारे में अधिक जानकारी प्रदान करते हैं और स्थानिक संकल्प का कोई नुकसान के साथ कर सकते हैं। बहु माप करने के लिए, 23 - पिछले दशक के दौरान, तरल में गतिशील AFM के क्षेत्र महत्वपूर्ण घटनाक्रम देखा गया वीडियो दर AFM 21 के आगमन से, 26 पर हाइड्रेशन संरचनाओं के 24,25 और उप नैनोमीटर इमेजिंग - 31। 36, बहुलक अनुसंधान 37, electrochemistry 38 - - 40 और ठोस तरल इंटरफेस लक्षण वर्णन 41 - 44 AFM आपरेशन जबकि तरल में डूब अब नियमित रूप से जीव विज्ञान और बायोफिज़िक्स 32 में प्रयोग किया जाता है। हिल ब्रैकट के आसपास तरल की उपस्थिति काफी अपनी गतिशीलता 45 के रूप में अच्छी तरह से टिप और नमूना 29,42 के बीच बातचीत बदल। जब उचित इस्तेमाल, तरल सबसे अच्छा समाधान परिवेश की स्थिति 46 में हासिल की तुलना में परिमाण के लगभग एक आदेश का एक विशिष्ट सुधार के साथ, इमेजिंग संकल्प 26,29 को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

AFM में, उच्चतम स्थानिक संकल्प एक विशेष माप के लिए प्राप्त दोनों AFM खुद की गुणवत्ता और टी की प्रकृति पर निर्भर करता हैवह बातचीत 20,47,48 की जांच की। वर्तमान समय में, सबसे उच्च अंत, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सशस्त्र बल चिकित्सा सेवा वर्तमान शोर का स्तर है कि थर्मल सीमा 12 के करीब रहे हैं तो समाधान के लिए निर्धारित कारक आमतौर पर टिप नमूना बातचीत है। इसे प्रभावी ढंग से इस बातचीत के प्रस्ताव निर्धारित करता है कि स्थानिक ढाल है: कम दूरी के आधार पर तेजी से बातचीत खस्ताहाल माप से जब लंबी दूरी बातचीत खेलने पर हैं उच्च संकल्प परिणाम का उत्पादन। तरल में, क्योंकि वे तरल के केवल कुछ ही आणविक व्यास भर में गायब हो जाते हैं solvation बलों इमेजिंग संकल्प में सुधार कर सकते हैं (आम तौर पर <1 एनएम) जब नमूना 49 की सतह से दूर जा रहा है। इन बलों तरल अणुओं और नमूना की सतह के बीच बातचीत से उत्पन्न। सतह के लिए एक मजबूत संबंध के साथ एक तरल अधिक का आदेश दिया और नमूना 29,42,50 के साथ इंटरफेस में थोक तरल से कम मोबाइल हो जाते हैं जाएगा। नतीजतन,यह एक हिल AFM टिप के लिए अधिक ऊर्जा लेने से थोक तरल 42 इंटरफेसियल तरल अणुओं विस्थापित करने के लिए, माप प्रतिपादन अत्यधिक nanoscale -इस solvation परिदृश्य पर इंटरफेसियल तरल गुणों में स्थानीय रूपांतरों के प्रति संवेदनशील होगा।

आदेश solvation बलों का दोहन करने के लिए, कई व्यावहारिक पहलुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, टिप के दोलन आयाम solvation बलों की सीमा के बराबर हो जाने की जरूरत है, आम तौर पर 1 एनएम <। दूसरा, तरल इस्तेमाल नमूना की सतह पर एक अच्छी तरह से परिभाषित solvation परिदृश्य फार्म चाहिए। Macroscopically, यह नमूना माना जाता है के लिए एक 'गीला' तरल की आवश्यकता के बराबर है। उदाहरण के लिए, पानी में हाइड्रोफोबिक ग्रेफाइट 42,51 पर से हाइड्रोफिलिक अभ्रक पर आणविक स्तर के संकल्प को प्राप्त करने के लिए आसान है। अंत में, ब्रैकट टिप का समर्थन करने का लगातार वसंत उचित रूप से 52,53 चयनित किया जाना चाहिए। जब इन चुनाव में कामditions, AFM केवल इंटरफ़ेस की आणविक स्तर छवियों प्रदान नहीं करता है, लेकिन यह भी स्थानीय नमूना तरल आत्मीयता के जो नमूना की सतह के बारे में 54 रासायनिक जानकारी हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बारे में जानकारी प्राप्त कर लेता है।

सबसे आम गतिशील तरल में AFM के लिए आपरेशन के मोड आयाम मॉडुलन (एएम भी 'मोड दोहन') AFM और आवृत्ति मॉडुलन (एफएम) AFM हैं। पहला मामला 55 में, टिप नमूना रेखापुंज-स्कैन करता है, जबकि इसकी कंपन आयाम एक राय पाश है कि लगातार फिर से समायोजित कर देता है टिप नमूना दूरी के अनुसार स्थिर रखा है। नमूने के एक स्थलाकृतिक छवि सुधार प्रतिक्रिया पाश द्वारा लागू से प्राप्त की है। एफएम-AFM 28,41,56 में, यह ब्रैकट / टिप है कि स्थिर रखा है जबकि टिप नमूना स्कैन के दोलन आवृत्ति है। दोनों तकनीकों तरल 36,57 में तुलनीय स्थलाकृतिक संकल्प प्रदान करते हैं। टिप नमूना बातचीत की मात्रा अधिक strai हो जाता हैghtforward और एफएम-AFM में सही है, लेकिन AM-AFM और अधिक मजबूत लागू करने के लिए आसान है, और नरम cantilevers, कुछ आसानी से विरूप्य या नाजुक नमूनों के अध्ययन के लिए उपयोगी के साथ काम करने की अनुमति देता है। गौरतलब है कि AM-AFM आंशिक रूप से ऐतिहासिक कारणों के लिए, लेकिन यह भी सच है कि यह तकनीकी रूप से नियंत्रित करने के लिए आसान है कि के कारण, AFM उपयोगकर्ताओं के बीच और अधिक व्यापक है।

हालांकि आयाम AM-AFM इमेजिंग के दौरान प्रतिक्रिया पाश से स्थिर रखा है, टिप दोलन दोलन और ड्राइविंग के बीच चरण अंतराल स्वतंत्र रूप से बदलने के लिए अनुमति दी है। चरण अंतराल टिप नमूना बातचीत के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं, ऊर्जा नमूना 58 के साथ इंटरफेस में टिप के दोलन के दौरान व्यस्त से संबंधित जा रहा है। इसलिए पहले चरण इमेजिंग स्थलाकृतिक इमेजिंग के लिए एक साथ प्राप्त किया जा सकता है, और अक्सर एक नमूना की सतह की विविधता पर प्रकाश डाला में पूरक है। चरण इमेजिंग बातचीत के विभिन्न मानचित्रण, Di सहित के लिए उपयोग किया गया हैआसंजन ऊर्जा 42, viscoelastic गुण 58 और एक इंटरफेस 44 के हाइड्रेशन परिदृश्य के रंगरूट मानचित्रण।

व्यावहारिक रूप से, तरल में उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के मानकों को नियंत्रित करने की बड़ी संख्या है, और एक सरल, व्यवस्थित प्रोटोकॉल है कि हर स्थिति में काम करता है के अभाव के कारण गैर तुच्छ बनी हुई है। छवि गुणवत्ता आम तौर पर ब्रैकट ज्यामिति और लोच, टिप रसायन विज्ञान, दोलन आयाम, और नमूना कठोरता, दूसरों के बीच में 55 निर्भर करता है। AFM माप भी कर रहे हैं, परिभाषा से, व्यवस्था करने के लिए perturbative। नतीजतन, उचित विचार के बिना इमेजिंग चर और पर्यावरण की स्थिति को बदलने के reproducibility और / या misrepresentative टिप्पणियों और नकली परिणामों में कठिनाई हो सकती है।

यहाँ, हम समाधान में हार्ड और सॉफ्ट नमूनों की उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल मौजूद है, ampl में संचालित व्यावसायिक उपकरणों का उपयोगitude मॉडुलन। हमारा लक्ष्य मुख्य मापदंडों विभिन्न नमूनों से अधिक संकल्प को प्रभावित करने की संभावना के अनुकूलन, प्रत्येक मामले में इमेजिंग प्रक्रिया अंतर्निहित भौतिक सिद्धांतों से हमारी पसंद के लिए तर्क समझाने के लिए एक व्यावहारिक प्रक्रिया का प्रस्ताव है। हम विस्तार से एक कदम-दर-कदम दृष्टिकोण, सब्सट्रेट सफाई और तैयारी से, इमेजिंग मापदंडों के ब्रैकट की पसंद है, समायोजन और आम समस्याओं के निवारण के लिए। उच्च संकल्प के लिए हमारी पसंद और प्रक्रियाओं के पीछे वैज्ञानिक तर्क समझाते हुए तर्कसंगत विकल्प बनाने जब कार्यप्रणाली अनुकूल ढालने में मदद, और इमेजिंग उपन्यास प्रणालियों के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम करना चाहिए।

इस पाठ के दौरान हम AM एक AFM के आयाम मॉडुलन ऑपरेशन मोड का उल्लेख करने का उपयोग करें। हम रखा निरंतर या तो ब्रैकट विक्षेपन (संपर्क मोड) या setpoint मूल्य के रूप में दोलन आयाम (AM मोड) के दौरान प्रतिक्रिया पैरामीटर को देखें। AM मोड में, ब्रैकट बाहर से संचालित हैया तो एक ध्वनिक दोलन द्वारा या एक स्पंदित लेजर द्वारा ब्रैकट के आधार पर ध्यान केंद्रित किया। ड्राइव आयाम बाहरी oscillatory संकेत की तीव्रता है। ड्राइव ब्रैकट का एक दिया दोलन आयाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक आयाम के निरपेक्ष मूल्य इस तरह के (कठोरता, ज्यामिति) ड्राइविंग की विधि (ध्वनिक, photothermal या चुंबकीय), ब्रैकट निर्धारण और मानकों और लेजर संरेखण के रूप में कई मापदंडों पर निर्भर करता है। ड्राइव आयाम का सही मूल्य इसलिए प्रासंगिक नहीं है बल्कि यह एक प्रयोग में निकाला जाता है तो के रूप में ब्रैकट का एक उचित (और मात्रात्मक) दोलन आयाम प्रदान करने के लिए। जब संचालित ब्रैकट दूर नमूना से दूर है और इसका कंपन का कोई भिगोना टिप नमूना बातचीत के माध्यम से होता है, इसका दोलन आयाम मुक्त दोलन आयाम कहा जाता है। हिल टिप नमूना की सतह nears के रूप में, उसके आयाम को कम करने के लिए शुरू होता है। प्रतिक्रिया सक्षम है, तो जेड पीजो const होगाताकि चयनित setpoint आयाम उलटना करने के लिए, निरंतर antly इसके विस्तार को फिर से समायोजित करें। setpoint मूल्य सामान्य रूप से हमेशा मुक्त आयाम की तुलना में छोटा होता है। यह नि: शुल्क आयाम खत्म setpoint अनुपात, setpoint आयाम का अनुपात (इमेजिंग आयाम) का उल्लेख करने के लिए आम है। छोटे setpoint अनुपात, कठोर इमेजिंग शर्तों रहे हैं।

Protocol

1. उपकरण और अन्य सतहों की सफाई

नोट: जब उच्च संकल्प के लिए लक्ष्य, प्रदूषण का किसी भी रूप में हानिकारक परिणाम हो सकते हैं। इसलिए यह सब हेरफेर करने के लिए नमूना, सब्सट्रेट या AFM सुझावों का अच्छी तरह से साफ कर रहे हैं इस्तेमाल उपकरणों सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। निम्नलिखित किसी भी सतह या साधन (जैसे, चिमटी) कि नमूना, ब्रैकट, या AFM सेल, नमूना मंच ही सहित के साथ संपर्क में आ सकता करने के लिए लागू होता है।

  1. ultrapure पानी में उपकरणों (18.2 MΩ, <5 पीपीएम ऑर्गेनिक्स), isopropanol (99.7% शुद्धता) द्वारा पीछा किया, फिर ultrapure पानी के द्वारा पीछा किया, प्रत्येक स्नान-sonicate 10 मिनट के लिए। जब संभव हो, एक धूआं हुड के तहत isopropanol का उपयोग धुएं की साँस लेना कम करने के लिए।
  2. एक नाइट्रोजन प्रवाह के तहत सूखी।
  3. अगर पूर्ण विसर्जन के लिए संभव नहीं है (जैसे, ब्रैकट धारक / इलेक्ट्रॉनिक्स के लिए), शारीरिक रूप से स्वच्छ एकल प्लाई, कम एक प्रकार का वृक्ष ऊतकों (प्रकाश कर्तव्य ऊतकों वाइपर) के साथ पोंछते द्वारा सतह ultrapu में भिगोफिर से पानी, isopropanol और ultrapure पानी, क्रमिक रूप से। सतह से हवा में सूखने के लिए (आमतौर पर 15 से 30 मिनट के भीतर) की अनुमति दें।

2. सब्सट्रेट तैयारी

नोट: सब्सट्रेट ठोस सतह सीधे, नमूने समर्थन आम तौर पर दोनों AFM स्कैनर और नमूने के साथ शारीरिक संपर्क में designates। अधिकांश सशस्त्र बल चिकित्सा सेवा एक चुंबकीय पर्वत है और इस्पात डिस्क का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक ही प्रोटोकॉल भी इस तरह के कांच स्लाइड के रूप में substrates के लिए उपयुक्त है। यहाँ हम एक इस्पात डिस्क जिस पर एक अभ्रक डिस्क चिपका है मान लेते हैं। इस प्रक्रिया के लक्ष्य संदूषण के संभावित बाहरी स्रोतों कि इमेजिंग को प्रभावित कर सकते हैं जितना की सीमा है। दस्ताने हर समय पहना जाना चाहिए।

  1. ultrapure पानी से फिर 10 मिनट के लिए प्रत्येक स्नान-sonicate ultrapure पानी में स्टील नमूना डिस्क (18.2 MΩ), isopropanol द्वारा पीछा किया, और अंत में,।
  2. एक नाइट्रोजन प्रवाह के तहत डिस्क सूखी।
  3. अच्छी तरह से मिला अभिकर्मकों और जगह के साथ epoxy गोंद की एक छोटी मात्रा में तैयार ~ 1081; इस्पात डिस्क पर एल।
  4. सब्सट्रेट पर दबाव लागू करने से इस्पात डिस्क के लिए सब्सट्रेट (रूसी अभ्रक, 2 Sio क्रिस्टल, कांच, आदि) प्रत्यय। epoxy (निर्माता विनिर्देशों देखें) एक ऊंचा तापमान पर कई घंटे के लिए इलाज के लिए अनुमति दें।
  5. सुनिश्चित करें कि कोई epoxy सीधे हवा के संपर्क में है सब्सट्रेट के किनारों के आसपास। यह अगर epoxy की अत्यधिक मात्रा में प्रयोग किया जाता है और प्रदूषण का एक स्रोत बन सकता है कुछ नहीं होगा।
    1. एक अभ्रक सब्सट्रेट के लिए, दृढ़ता, सब्सट्रेट पर प्रेस ~ 2.5 सेमी चौड़ा चिपकने वाला टेप ताकि पूरे चेहरे को कवर किया जाता है, और सुचारू रूप से इसे बंद छील। हल्का चिपकने वाला टेप का प्रयोग करें, और सतह के समानांतर खींच कर अभ्रक छील। हटा सामग्री टेप पर दिख रहा है। इस प्रक्रिया को दोहराएं 2-3 बार है, जब तक अभ्रक दर्पण-चिकनी आंखों के लिए है।
    2. कांच के लिए / 2 Sio, अगर आगे रासायनिक सतह संशोधन की आवश्यकता है, कदम 2.1-2.2 के स्नान-sonication दिनचर्या को दोहराएँ। वैकल्पिक रूप से, यू का उपयोगवी जोखिम इकाई (18 डब्ल्यू यूवी सी कीटाणुनाशक लैंप) 30-60 मिनट के लिए, बिजली पर निर्भर करता है) किसी भी ऑर्गेनिक्स कि सतह पर छोड़ा जा सकता है pyrolyze करने के लिए। यह प्रक्रिया भी काफी खुरदरापन में वृद्धि के बिना सतह अधिक हाइड्रोफिलिक प्रदान करता है।

3. ब्रैकट और टिप की तैयारी

  1. isopropanol के एक स्नान में ब्रैकट चिप, 60 मिनट के लिए प्रत्येक ultrapure पानी के बाद विसर्जित कर दिया।
  2. ब्रैकट / टिप व्यापक सफाई (जैसे, जेल बॉक्स में लंबे समय तक भंडारण के बाद) की आवश्यकता है, चरण 1 से पहले एसीटोन में एक 30 मिनट भिगोने (> 99.5% शुद्धता) जोड़ने (यह भी खंड को संबोधित कर रहे प्रदूषण को देखें)। जेल के बक्से में सुझावों के भंडारण के हमारे अनुभव, संदूषण है कि बहुत तेजी से हो सकता है 59 के प्राथमिक स्रोत में से एक में है।
  3. टिप आदेश स्थिर हाइड्रेशन साइटों 60 के गठन के पक्ष में करने में प्रकाश संक्षिप्त (<5 मिनट) यूवी को बेनकाब। अब overexposure बार के रूप में यह टिप या उद्योग जगत को नुकसान पहुंचा सकता से बचेंवक्रता त्रिज्या rease।
  4. AFM के ब्रैकट धारक और पिपेट ~ इमेजिंग समाधान के 50 μl में ब्रैकट डालें (समाधान नमूना पर निर्भर करेगा की प्रकृति की जांच की जा रही है, लेकिन इस मामले में ultrapure पानी में रूबिडीयाम क्लोराइड की एक 10 मिमी समाधान का उपयोग करें) ब्रैकट पर और पूर्व गीला करने के लिए यह टिप; जब नमूना आ रहा यह हवा के बुलबुले की उपस्थिति सीमित कर देगा।

AFM सेल के 4. सेट-अप

  1. नमूना डिस्क और सब्सट्रेट नमूना मंच पर माउंट और इमेजिंग तरल पदार्थ की एक छोटी बूंद (तरल आम तौर पर अपने उच्चतम बिंदु पर मोटी 2-3 मिमी) जोड़ें।
  2. AFM के लिए ब्रैकट धारक कनेक्ट करें।
  3. इतनी के रूप में ब्रैकट / टिप और नमूना पर तरल पदार्थ के बीच एक केशिका पुल के रूप में करने के लिए करीब निकटता में ब्रैकट और नमूना ले आओ।

5. आरंभ मापन और ब्रैकट के कैलिब्रेशन

  1. मापने लेजर (आमतौर पर लाल) को टिप-ए बंद संरेखितब्रैकट के एन डी। AFM मॉडल पर निर्भर करता है, तो सॉफ्टवेयर नियंत्रण के माध्यम से या लेजर स्थिति के मैनुअल समायोजन से ऐसा करते हैं। तरल में ब्रैकट के थर्मल स्पेक्ट्रम मोल (चित्रा 1 ए देखें)। प्रक्रिया रिकॉर्ड लेसर का उपयोग ब्रैकट के थर्मल में उतार-चढ़ाव, आदेश ब्रैकट के मुख्य अनुनाद (मौलिक eigenmode) की आवृत्ति लगता है। सबसे आधुनिक AFM में, इस सॉफ्टवेयर के नियंत्रण में स्वचालित प्रक्रियाओं के माध्यम से किया जाता है, लेकिन विवरण AFM से AFM के लिए भिन्न हो सकते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: ट्यूनिंग और ब्रैकट औजार। एक: मौलिक eigenmode (लाल) के एक सरल हार्मोनिक थरथरानवाला (एसएचओ) फिट के साथ ब्रैकट के ऊर्ध्वाधर विक्षेपन (काला) के थर्मल शोर स्पेक्ट्रम। यहाँ गूंज पानी में 18.7 kHz है। पहले तीन गूंज आवृत्तियों जो पहले तीन flexural eigenmodes के अनुरूप highli हैंनीले तीर के साथ ghted। बी: ब्रैकट का उलटा ऑप्टिकल लीवर संवेदनशीलता के कैलिब्रेशन। ब्रैकट एक कठोर (गैर विरूप्य) सतह के खिलाफ दबाया के रैखिक नीचे को झुकाव नीचे को झुकाव वोल्ट में मापा जाता है और नैनोमीटर में इसी मूल्य के बीच रूपांतरण कारक (InvOLS) को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. बनाम एक कड़ा सब्सट्रेट (जैसे, अभ्रक या ग्लास) पर ब्रैकट के साथ दूरी की अवस्था एक विक्षेपन रिकॉर्ड और भव्य है कि रैखिक विक्षेपन क्षेत्र में वक्र (चित्रा 1 बी के रूप में) की ढलान एकता 61 से नीचे को झुकाव जांचना - 63।
    नोट: यह प्रक्रिया (वोल्ट में) photodetector पर मापा विक्षेपन के बीच रूपांतरण कारक पाता है और ब्रैकट की असली विक्षेपन (नैनोमीटर में) - knoउलटा ऑप्टिकल लीवर संवेदनशीलता (InvOLS) के रूप में WN। अंशांकन टिप नुकसान हो सकता है, तो यह संचालन करने के लिए सभी मापन पूरा कर रहे हैं के बाद बेहतर है। अंशांकन से पहले सच आयाम के एक अनुमान (आमतौर> 90% सही) प्राप्त करने के लिए पिछले एक प्रयोग के दौरान एक ही प्रकार का एक और ब्रैकट के लिए निकाली गई InvOLS मान का उपयोग करें।
  2. एक सरल हार्मोनिक थरथरानवाला मॉडल 64 के साथ थर्मल स्पेक्ट्रम में गूंज शिखर फ़िट - 66 ब्रैकट के वसंत निरंतर उपज के लिए। यह प्रक्रिया सबसे AFM सॉफ्टवेयर में स्वचालित है और आमतौर पर प्रश्न में मॉडल के विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता नहीं है।
  3. ट्यून ब्रैकट। जब बाहर से संचालित ब्रैकट के आयाम प्रतिक्रिया मिल (जैसे, ध्वनिक या photothermal उत्तेजना से) अपने नाममात्र अनुनाद आवृत्ति के करीब आवृत्तियों की एक सीमा से अधिक। थोड़ा बाईं ओर, इस स्पेक्ट्रम में अधिकतम पास करने के लिए ड्राइविंग आवृत्ति सेट करें। ब्रैकट acou हैstically संचालित है, कई नकली Maxima प्रकट हो सकता है जब ट्यूनिंग।
    1. एक गूंज शिखर संभव के रूप में बंद करने के लिए (और के लिफाफे के भीतर) गूंज AFM लेकिन बारीकियों का नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग सॉफ्टवेयर के प्रकार और संस्करण है कि AFM को नियंत्रित करता है पर निर्भर हो सकता द्वारा थर्मल स्पेक्ट्रम में पहचान का चयन करें।

6. दृष्टिकोण और नमूना की प्रारंभिक जांच

  1. ड्राइविंग आयाम इतना तय है कि मुक्त दोलन आयाम लगभग 5 एनएम है। यह आम तौर पर 0.2-0.8 वी सबसे सशस्त्र बल चिकित्सा सेवा पर से मेल खाती है (मामले में InvOLS calibrated नहीं है)। आयाम setpoint मुक्त आयाम की ~ 80% करने के लिए समायोजित करें।
  2. प्रतिक्रिया लाभ अपेक्षाकृत उच्च (निरपेक्ष मूल्य AFM पर निर्भर करता है) सेट, लेकिन यह सुनिश्चित करें कि कोई अस्थिरता या बज होता है।
  3. (, जैसे ~ 1 हर्ट्ज और 10 एनएम क्रमशः) प्रारंभिक स्कैन दर और आकार स्कैन छोटे मूल्यों को निर्धारित करें। इस टिप मामले में कुछ प्रतिक्रिया मानकों को खराब समायोजित कर रहे हैं की रक्षा में मदद करता हैबड़ी दूरी पर स्कैनिंग से बचने के द्वारा। आकार स्कैन बाद में एक बड़ा मूल्य (जैसे, 100 एनएम) स्कैनिंग की स्थिति उपयुक्त दिखाई यदि करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
  4. सतह दृष्टिकोण से पहले (कुछ मामलों में यह ऑप्टिकली किया जाना चाहिए) की अनुमानित ऊंचाई निर्धारित करते हैं।
  5. सतह AFM नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए टिप के दृष्टिकोण आरंभ करें। इस प्रक्रिया का ठीक विवरण का इस्तेमाल किया AFM और सॉफ्टवेयर के मॉडल पर निर्भर करेगा।
    1. अगर वहाँ दृष्टिकोण के साथ समस्या है जब एक नरम ब्रैकट का उपयोग कर रहे हैं, संपर्क मोड में दृष्टिकोण का संचालन। इस मामले में, यह सुनिश्चित करें कि लाभ AM विधा की तुलना में कम कर रहे हैं, और (photodetector पर लेजर केंद्रित करने के बाद 0.1-0.2 वी) एक अपेक्षाकृत कम मूल्य के लिए setpoint सेट टिप संरक्षित करने के लिए।
    2. आकलन टिप थोड़ा setpoint मूल्य (संपर्क मोड या AM मोड में कमी में वृद्धि) को बदलने की छवि के लिए शुरू करने के बिना सतह में पहुंच गया है। टिप सतह पर है, तो टी पर प्रभाववह जेड पीजो के विस्तार नगण्य होना चाहिए। जेड पीजो का जीना गतियों आमतौर पर सबसे AFM के नियंत्रण सॉफ्टवेयर में रेखांकन भी प्रदर्शित कर रहे हैं। setpoint परिवर्तन पीजो के एक दृश्य गति से चलाता है, तो यह एक झूठी संलग्न इंगित करता है। उत्तरार्द्ध मामले में, वर्तमान टिप स्थिति से दृष्टिकोण को फिर से शुरू, एक से थोड़ा अधिक (संपर्क) या कम (एएम) का उपयोग कर setpoint।
  6. एक बार जब टिप सतह तक पहुँच गया है, (बस 'बंद' दबाकर आमतौर पर) जेड पीजो वापस लेना और ब्रैकट retune (दोहराने कदम 5.4।); गुंजयमान आवृत्ति संभावना टिप नमूना संबंधों के कारण एक कम मूल्य के लिए स्थानांतरित कर दिया जाएगा।
  7. सेट बिंदु नव देखते मुक्त आयाम की ~ 80% (इस टिप नमूना दूरी पर) के लिए परिवर्तित करें।
  8. ब्रैकट व्यस्त हैं और सत्यापित करने के लिए कि इमेजिंग पैरामीटर उपयुक्त हैं AM मोड में सतह का एक 10 × 10 एनएम 2 स्कैन आचरण।
    1. जाँच करें कि ट्रेस (स्कैनिंग बाएं से दाएं) और वापस (स्कैनिंग दाएं से बाएं)प्रोफाइल मिलाना। तो आगे नहीं setpoint कम करने और लाभ को बढ़ाने के प्रयास करें।
    2. लाभ कम छवि शोर हो जाता है।
  9. एक बड़े के साथ ऑपरेशन दोहराएँ - 1 × 1 माइक्रोन 2 से 5 × 5 माइक्रोन से 2 - नमूने की स्कैन प्रदान की यह संभव है। मुलायम या जैविक नमूने पर, इस टिप का एक संदूषण परिणाम हो सकता है।

7. उच्च संकल्प इमेजिंग

  1. एक मूल्य के लिए आकार स्कैन सुविधाओं visualizing के लिए उपयुक्त में कमी (जैसे, प्रोटीन क्रिस्टल के लिए 100 × 100 एनएम 2 या 20 × 20 एनएम 2 मीका या केल्साइट के लिए)।
  2. ब्रैकट प्रतिक्रिया पाश स्वचालित रूप से जेड पीजो और इसलिए सतह से टिप वापस लेना करने के लिए पर्याप्त की ड्राइव आयाम को कम। जबकि ब्रैकट सतह से दूर है, ड्राइव आयाम 1-2 एनएम (पीक से पीक) को समायोजित इतना है कि ब्रैकट आयाम है ~।
  3. AFM नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, progressively एक समय में setpoint एम वी के कुछ दसियों को कम जब तक जेड पीजो सतह की ओर फिर से फैली हुई है और मूल छवि बरामद किया है। 75% और नया मुफ्त आयाम के 95% के बीच setpoint आयाम रखें।
  4. AFM नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर लाभ मरम्मत करना; उच्च लाभ महत्वपूर्ण शोर शुरू करने के बिना कम आयाम पर इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. कदम 7.2-7.4 दोहराएँ के रूप में तो मुक्त आयाम, setpoint का सबसे अच्छा संयोजन का निर्धारण और उच्च संकल्प के लिए हासिल करने के लिए। इष्टतम स्थितियों नमूना (solvation परिदृश्य और तरल के गीला गुण) पर भी ब्रैकट (लगातार वसंत, जकड़न) पर निर्भर करते हैं।
    2. इमेजिंग शर्तों का अनुकूलन करने के आयाम के विभिन्न संयोजनों का अन्वेषण करें। यह फिर से मुक्त आयाम 42 बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता है। ऐसे एक मामले में, पहले एक उच्च मूल्य के लिए setpoint को समायोजित करने और उसके बाद ड्राइव (यानी, रिवर्स आयाम को कम करने के लिए इस्तेमाल की तुलना में प्रक्रिया) में वृद्धि।
    3. setpoi रखें0.5 एनएम की सीमा में NT आयाम - 1.5 एनएम (पीक करने के लिए पीक) setpoint अनुपात के साथ 0.7 (आमतौर पर 0.75-0.95) के ऊपर रखा। 2 एन / एम - solvophilic इंटरफेस के लिए, 0.5 का एक लगातार वसंत के साथ cantilevers का उपयोग करें। इस टिप सतह से टकराने के बिना इंटरफेसियल तरल के सबसे को दूर करने के लिए पर्याप्त है। अंगूठे का एक नियम EQ में प्रस्तावित है। संदर्भ 29 में से 4।

Representative Results

पिछले अनुभाग में वर्णित प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक कई वाणिज्यिक सशस्त्र बल चिकित्सा सेवा के साथ लागू किया गया है molecular- या परमाणु स्तर छवियों को प्राप्त करने के लिए। सभी छवियों 0.5 एनएम और 1.5 एनएम के बीच काम कर आयाम अलग-अलग प्रक्रिया के बाद समायोजित साथ प्राप्त किया गया 7.1-7.4 कदम। परिणाम नरम (चित्रा 2) और कठोर (चित्रा 3) नमूने की एक व्यापक रेंज पर प्राप्त किया जा सकता है। प्रत्येक मामले में, ब्याज की सुविधाओं डाला जाता है। तकनीक के महान लाभ में से एक यह है कि छोटे दोलन आयाम और उच्च सेट अंक, बल नमूना पर टिप द्वारा लगाए गए कम से कम लिपिड (2A चित्रा), प्रोटीन (चित्रा 2 बी और डी) के नाजुक आत्म विधानसभाओं अनुमति देता है, और है amphiphilic अणुओं (चित्रा 2 सी) के घोल में क्षति के बिना imaged किया जाना है। इस तरह के खनिजों (आंकड़े 3 ए, बी, डी) के रूप में कठिन और क्रिस्टलीय सामग्रीएकल धातु एक सतह (चित्रा 3 सी) पर adsorbed आयनों दृष्टिकोण का उपयोग कर, क्योंकि हर मामले में, यह इंटरफेसियल तरल है कि प्रभावी ढंग से प्रोटोकॉल का वर्णन के साथ imaged किया जाता है imaged किया जा सकता है। Solvation बलों दिखाए गए आंकड़े 2 और 3 नमूने पर तुलना कर रहे हैं: सभी नमूनों हाइड्रोफिलिक कर रहे हैं (और अधिक आम तौर पर, "solvophilic" आंकड़े -2, 3 बी, 3 डी के मामले में) इमेजिंग समाधान के संबंध में। लगातार, तुलनीय कठोरता के साथ cantilevers (0.2 - 0.8 एन / मी) सभी मामलों में इस्तेमाल किया गया। दोनों नमूना और टिप सुनिश्चित करने के लिए कि तरल अणुओं एक अच्छी तरह से परिभाषित solvation संरचना है कि imaged किया जा सकता फार्म solvophilic होना चाहिए। यह हमेशा एक पर्याप्त शर्त नहीं है, लेकिन ज्यादातर मामलों में और अपेक्षाकृत छोटे तरल अणुओं के लिए, एक ही रास्ता है कि नमूना समरूपता mimics में तरल फिर से संरचनाओं ही। उच्च संकल्प का मुख्य चालक adsorbed विलायक अणुओं की आत्मीयता में स्थानीय भिन्नता हैसतहों (angstrom पैमाने पर, आंकड़े 2A, 3 ए, 3 सी के मामले में) के लिए। जहां विलायक संरचना सतह भर में काफी हद तक भिन्न होता है तकनीक इसलिए सबसे अच्छा सामग्री के लिए अनुकूल है।

चित्र 2
चित्रा 2: शीतल इंटरफेस जलीय समाधान में AM-AFM द्वारा imaged। एक: Dipalmitoyl-phosphatidylcholine (DPPC) जेल चरण में लिपिड bilayer 150 मिमी KCl में imaged। hexagonally पैक लिपिड headgroups, दोनों स्थलाकृति और चरण में अलग पहचाना जाता है स्थानीय हाइड्रेशन में साइट विशेष बदलाव के संकेत मिलते हैं इसके विपरीत के साथ। बी: Halobacterium salinarum 150 मिमी KCl, 10 मिमी Tris, 7.4 पीएच में imaged की बैंगनी झिल्ली। कई bacteriorhodopsin प्रोटीन trimers डाला जाता है। चरण प्रोटीन पर स्थानीय हाइड्रेशन साइटों की वजह से विपरीत स्थलाकृति से अलग दर्शाती है। व्यक्ति प्रोटीन trimers (धराशायी लाइनों) से बाहर किया जा सकता है। सी: Amphiphilic डाई (Z907) एक डाई अवगत सौर सेल में एक 2 Tio nanoparticle की सतह पर adsorbed अणुओं। छवि की एथिल-isopropyl sulfone में अधिग्रहण कर लिया था। स्पंज की तरह उपस्थिति adsorbed डाई अणु द्वारा बनाई गई है। डी: मूल गोजातीय लेंस बी एक aquaporin टेट्रामर के रूप में ही बफर में imaged झिल्ली में Aquaporin क्रिस्टल प्रकाश डाला है। उप-संरचना अंतर-पेचदार छोरों को इसी स्थलाकृति में दिखाई दे रहा है, जबकि चरण प्रोटीन के पास असामान्य व्यवहार के कारण पानी एक भिन्न विपरीत चलता कर रहे हैं। छवियों refs 36 (बी), रेफरी 38 (सी) और रेफरी 67 (डी) से अनुकूलित कर रहे हैं। पैमाने पर पट्टी रंग पैमाने क्रमश इंगित करता है 200 बजे और 15 डिग्री (ए), 600 की ऊंचाई और चरण भिन्नता एनएम 5 (ए), 10 एनएम (बी), (सी) में 3 एनएम, और 15 एनएम (डी) है PM और 4 डिग्री (बी), 2.5 एनएम और 2.5 डिग्री (सी), और 1.6 एनएम और 9.5 डिग्री (डी)।लोड / 54924 / 54924fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: तरल पदार्थ समाधान में मुश्किल नमूने के प्रतिनिधि हूँ-AFM छवियों। एक: केल्साइट क्रिस्टल [ Equation2 ] सतह एक equilibrated ultrapure पानी के घोल में imaged। बी: स्ट्रोंटियम titanate imaged डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में प्राप्त की। उच्च संकल्प पानी में संभव नहीं था। सी: रूसी अभ्रक 3 मिमी RbCl में imaged - एकल adsorbed आरबी + आयनों दोनों चरण और ऊंचाई स्कैन में अभ्रक के जाली साइटों पर दिखाई दे रहे हैं। डी: DMSO में imaged में सिलिकॉन कार्बाइड। उम्मीद क्रिस्टेलोग्राफिक व्यवस्था छवियों बी में दिखाया जाता है और डी छवियों, रेफरी 68 (ए) से अनुकूलित कर रहे हैं रेफरी 42 (बी और डी),और रेफरी 44 (सी)। पैमाने पर पट्टी 3 एनएम (ए, बी, डी) और एनएम 5 (सी) है। रंग पैमाने क्रमश: 250 बजे और 14 ° (ए), 600 बजे और 5.5 डिग्री (बी), 800 बजे और 15 डिग्री (सी), और 500 बजे और 3.5 डिग्री (डी) की ऊंचाई और चरण बदलाव का संकेत है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह मानते हुए कि इमेजिंग तरल और ब्रैकट कठोरता उचित रूप से चुना गया है, सफल उच्च संकल्प को प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम इमेजिंग आयाम का समायोजन, और इस प्रणाली की जांच के समग्र साफ-सफाई कर रहे हैं।

इंटरफेसियल तरल क्षेत्र (आम तौर पर कम से कम 2 एनएम) की मोटाई के लिए तुलनीय आयाम मुख्य रूप से इंटरफेसियल विलायक 42 के गुणों में भिन्नता जांच। अगर दोलन आयाम बहुत बड़ी है, हिल टिप लंबी दूरी, गैर रेखीय बल क्षेत्रों 52 कि ब्रैकट गति की स्थिरता को रोकता है, और अनिवार्य रूप से इमेजिंग शर्तों 29 की परवाह किए बिना नमूना मारा, संकल्प की गिरावट में जिसके परिणामस्वरूप पार करेंगे। संकल्प में नुकसान के अलावा, उच्च harmonics टिप गति में प्रकट करने के लिए शुरू करते हैं और प्रणाली 55 मॉडल करने के लिए और अधिक जटिल हो जाता है। वैकल्पिक रूप से, बहुत छोटा है, तो इमेजिंग आयाम है ओइंटरफ़ेस की nly हिस्सा (इंटरफेसियल तरल के आम तौर पर विशिष्ट परतों) की जांच की जाती है और स्थिर इमेजिंग केवल कड़ी cantilevers के साथ प्राप्त किया जा सकता है एक संतोषजनक संकेत करने वाली शोर अनुपात के लिए (> 10 एन / पानी के 53 में मीटर), के जोखिम के साथ बड़ी ऊंचाई रूपों से ज्यादा हानिकारक नरम नमूने हैं। कड़ी cantilevers के लिए जरूरत थर्मल शोर है कि अधिक महत्वपूर्ण है कि संकेत मापा जब छोटे आयाम के साथ काम करना, टिप और नमूना के बीच लंबी दूरी की बातचीत अभी भी मौजूद हैं, लेकिन मोटे तौर पर लगातार कर रहे हैं और प्रभावित नहीं करते हो सकता है पर काबू पाने के लिए है प्राप्त छवियों में उच्च संकल्प इसके विपरीत।

इमेजिंग के वातावरण की सफाई सर्वोपरि महत्व का है जब यह उच्च संकल्प AFM के लिए आता है। प्रणाली में अवांछित यौगिकों दोनों इमेजिंग और बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। वहाँ संदूषण के दो मुख्य श्रेणियों कि प्रयोगों को प्रभावित करने के लिए करते हैं: जब इमेजिंग (i) दूषित पदार्थों को सीधे दिखाई ( (चित्रा -4 ए) के खिलाफ विपरीत कर रहे हैं पर के रूप में अत्यधिक आर्दश सिस्टम में हो जाता है। टिप और नमूना बदलने से पहले, यह एक बड़ी विक्षेपन के साथ स्पेक्ट्रोस्कोपी घटता प्राप्त प्रभावी रूप से कठिन नमूना के खिलाफ टिप बार बार दबाने के लायक है। यह सामान्य रूप से एक नए सिरे नुकसान होगा, लेकिन कभी कभी एक गंदा टिप साफ या इमेजिंग के लिए उपयुक्त स्थिर हाइड्रेशन साइटों के लिए प्रेरित कर सकते हैं। इस टिप, हालांकि, अनिवार्य रूप से पा लिया जाएगा और इसलिए भले ही इमेजिंग में सुधार फ्लैट नमूना के लिए ही उपयुक्त हो। कड़ी नमूने भर में संदिग्ध प्रदूषण के मामले में, यह कुछ हद तक विनाशकारी ऊपर वर्णित प्रक्रिया प्रयास करने से पहले ब्रैकट के दूसरे eigenmode के साथ छवि के लिए कोशिश कर रहा लायक हो सकता है। यह बस दप की आवश्यकता हैदूसरी eigenmode के लिए ड्राइविंग आवृत्ति खुजली और आयाम / setpoint (नीचे निवारण चर्चा देखें) readjusting। ब्रैकट बढ़ जाती है काफी जब दूसरी eigenmode पर संचालित है और किसी भी कमजोर adsorbed दूषित पदार्थों को टिप जबकि इमेजिंग द्वारा दूर धकेल दिया जा सकता है की प्रभावी कठोरता। इस रणनीति के लिए एक साफ नमूना और टिप के लिए जगह की जरूरत नहीं है, लेकिन एक टिप / नमूना स्पष्ट रूप से आदर्श नहीं है जब संतोषजनक छवियों को प्राप्त करने के लिए कुछ और आगे अवसर प्रदान करता है।

चित्रा 4
चित्रा 4: मनाया रूसी अभ्रक जब इमेजिंग संदूषण के उदाहरण है कि उच्च संकल्प इमेजिंग रोकना। एक: मीका 5 मिमी RbCl में imaged - कोई प्रदूषक कणों दिखाई दे रहे हैं। बी: संदूषण जबकि नाममात्र ultrapure पानी में इमेजिंग भर एनएम के दसियों के आदेश का समुच्चय का रूप ले। सी: आत्म इकट्ठे दूषित द्वारा गठित संरचनाओंNant कणों प्रकृति में शायद amphiphilic। इमेजिंग फिर नाममात्र ultrapure पानी में आयोजित किया गया। डी: लंबवत ऑफसेट वर्गों ए, बी और सी में धराशायी लाइनों अभ्रक के atomically फ्लैट सतह से विचलन illustrating के लिए इसी। ए, बी और सी में स्केल सलाखों 300 एनएम के अनुरूप हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रकरण (ii) अधिक आम और निराशा तथ्य यह है कि उप नैनोमीटर सुविधाओं बस, हल नहीं किया जा सकता है इमेजिंग की स्थिति की परवाह किए बिना द्वारा मुख्य रूप से होती है। इस प्रकार की स्थिति के हस्ताक्षर आमतौर पर बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप जो कुछ विसंगतियां दिखाई देते हैं में दिख रहा है। ये खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य घटता है और आयाम बनाम दूरी घटता उल्लेखनीय है कि एक विशिष्ट sigmoidal आकार 42 से विचलित शामिल हो सकते हैं। contaminants, आयनिक या अन्यथा हैं, तो dispers हैंएड समान रूप से तरल पदार्थ भर में, वे नहीं स्थलाकृतिक इमेजिंग में दिखाई दे सकते हैं, लेकिन नमूना 69 है, जो एक नियमित रूप से टिप नमूना बातचीत 29 को बनाए रखने और उच्च संकल्प 70 प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है की हाइड्रेशन संरचना को बाधित कर सकता है। वहाँ भी नमूना पर प्रदूषणों से प्रत्यक्ष प्रभाव, विशेष रूप से नरम, जैविक प्रयोगों में हो सकता है। उदाहरण के लिए, यह सर्वविदित है कि एल्कोहल की उपस्थिति (सफाई प्रक्रिया से) जेल चरण लिपिड bilayers fluidify कर सकते हैं 71 - 73, प्रतिपादन उप नैनोमीटर स्तर संकल्प असंभव है। उच्च संकल्प संभव नहीं है, तो ख्याल सबसे पहले, सफाई की प्रक्रिया में लिया जाना चाहिए किसी भी उपकरण है कि इमेजिंग समाधान के साथ संपर्क में आता है पर विशेष रूप से ध्यान दे। अगर पूरी तरह ठीक नहीं किया यहां तक ​​कि ऐसे epoxy राल के रूप में जाहिरा तौर पर स्थिर यौगिकों कुछ हद तक तरल पदार्थ में solvate सकता है।

AM-AFM के साथ उच्च संकल्प इमेजिंग, की मांग की है और धैर्य की आवश्यकता हैसबसे अच्छा संभव इमेजिंग की स्थिति तक पहुँचने से पहले अक्सर कई परीक्षणों। छोटे प्रयोगात्मक मुद्दों को आसानी से काफी महत्वपूर्ण बन सकता है उच्च संकल्प और समस्या निवारण कौशल आवश्यक हैं रोकने के लिए। इसके बाद हम सबसे आम समस्याओं को हम अपने प्रस्तावित समाधान के साथ सामना करना पड़ा से कुछ की सूची।

ब्रैकट ट्यूनिंग

सबसे वाणिज्यिक सशस्त्र बल चिकित्सा सेवा ध्वनिक उत्तेजना का उपयोग ब्रैकट ड्राइव करने के लिए। ऐसे मामले में, कदम 5.4 में वर्णित के रूप में, ब्रैकट ट्यूनिंग, के पास अपनी गुंजयमान आवृत्ति अक्सर हवा में ऑपरेशन के लिए पर्याप्त प्रदर्शन प्रदान करता है। तरल वातावरण में, तरल ऐसे ब्रैकट चिप और धारक के रूप में AFM के विभिन्न यांत्रिक भागों के बीच कुछ युग्मन के लिए प्रेरित करने के लिए जाता है। इस ब्रैकट के स्पष्ट गूंज, अक्सर एक ब्रैकट आवृत्ति स्पेक्ट्रम है कि कई तेज चोटियों और घाटियों सामान्यतः एक "चोटियों के वन" के रूप में वर्णित दर्शाती से यह साफ प्रभावित कर सकते हैं। नतीजतन, यह अक्सर Corre खोजना मुश्किल हैसीटी ड्राइव आवृत्ति। इन चोटियों भी गैस वातावरण में मौजूद हैं, लेकिन ब्रैकट की गुणवत्ता कारक के उच्च मूल्य की वजह से, अनुनादों पर आयाम काफी बड़ा 74,75 है। तरल में ब्रैकट ड्राइव करने के लिए उचित चोटी का चयन करना आसान नहीं होगा और परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता होती है सकते हैं। अभ्यास में, "चोटियों के वन" अनुनाद आवृत्ति के आसपास में आयाम में तेज बदलाव के साथ आवृत्ति चोटी आमतौर पर गूंज पर है और अक्सर एक ड्राइविंग आवृत्ति उच्च संकल्प इमेजिंग प्राप्त करने के लिए पर्याप्त प्रदान करता है बिल्कुल जरूरी नहीं होने के बावजूद सबसे अच्छा शर्त है।

छवि विरूपण

इमेजिंग बहाव अक्सर एक मुद्दा है जब उच्च संकल्प की मांग है और बनाता है छवियों विकृत (आमतौर पर फैला) देखो। इसके मूल में आम तौर पर थर्मल है, या तो (जैसे, एल्कोहल में इमेजिंग स्कैनर क्योंकि / AFM अपने संतुलन ऑपरेटिंग तापमान तक पहुँच नहीं है, क्योंकि या नमूना तरल का हिस्सा तेजी से evaporating है )। सभी मामलों में, बहाव थर्मल संतुलन में नगण्य हो जाता है। यह नमूना यदि संभव हो तो के तापमान को ठीक करने के लिए इसलिए उपयोगी है। अन्यथा, यह प्रयोग आयोजित करने से पहले कई घंटे के लिए (धीमी दर स्कैन में बड़े आकार स्कैन) एक खाली नमूना स्कैन करने के लिए AFM छोड़ने के लायक है। तो वाष्पीकरण एक मुद्दा नहीं है, इस प्रक्रिया के लिए सबसे अच्छा प्रक्रिया के 6 कदम के बाद किया जाता है, देखभाल करने के लिए पहली टिप सतह से एक कम दूरी (जैसे, 20 माइक्रोन) वापस लेने के लिए। कभी कभी, बहाव व्यापक thermalization के बाद भी रहेगा। यह आमतौर पर इंगित करता है कि ब्रैकट या उसके चिप आंशिक रूप से नमूना खींच रहा है, जबकि इमेजिंग, कुछ है कि इस तरह की फिल्मों पतली के रूप में या यदि टिप / ब्रैकट / चिप को उपयुक्त नहीं रखा गया है मुलायम एकजुट नमूनों पर भी हो सकता है। चिप्स है कि मेजबान एक से अधिक ब्रैकट / टिप, यह अक्सर मददगार ब्रैकट कि उपयोग में नहीं हैं बल्कि उन्हें सतह पर खींच तोड़ने के लिए है पर।

ईओण का शक्ति

ntent "> चूंकि इमेजिंग इंटरफेसियल तरल का प्रभुत्व है, यह पानी में आरोप लगाया सतह के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए कुछ नमक जोड़ने के लिए कभी कभी उपयोगी है। नमक की भूमिका दुगना है। सबसे पहले, यह की हाइड्रेशन परिदृश्य को संशोधित सतह सोखना, जो अक्सर विपरीत बढ़ाता पर imaged। दूसरे, यह टिप और नमूना के बीच स्क्रीन मजबूत electrostatic बातचीत में मदद करता है (जैसे, अभ्रक पर)। आम तौर पर, बड़ा आयनों जैसे पोटेशियम, रूबिडीयाम और सीज़ियम उनकी विशिष्ट हाइड्रेशन गुणों के कारण बेहतर छवियों की अनुमति देते हैं 76, और तथ्य यह है कि वे अक्सर एक अद्वितीय हाइड्रेशन राज्य में मुख्य रूप से 77 सोखना।

बुरा ब्रैकट / टिप

यह (ऊपर वर्णित लक्षण देखें) संदिग्ध है कि ब्रैकट प्रदूषण का एक स्रोत है, यह पहली बार एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण किया जाना चाहिए। अगर एक जेल बॉक्स में संग्रहीत, ब्रैकट जेल पॉलिमर या सिलिकॉन तेल 59 कि प्रकट कर सकते हैं के निशान उठा सकते हैं, कई मामलों में, गहरे रंग के धब्बे के रूप में, (चित्रा 5 ए के रूप में) ब्रैकट की पीठ पर। ब्रैकट के Photothermal दोलन समान धब्बे पैदा कर सकते हैं, लेकिन वे गाड़ी चला लेजर द्वारा ब्रैकट कोटिंग की गिरावट / overheating के कारण कर रहे हैं। संदूषण ब्रैकट पर बेतरतीब ढंग से प्रकट होता जाता है। isopropanol और, फिर साथ एक लंबे समय (12 घंटे) सफाई, ultrapure पानी के साथ ब्रैकट से किसी भी अवांछित कणों को दूर कर सकते हैं।

चित्रा 5
चित्रा 5: एक नए ब्रैकट और एक समान एक है कि एक विस्तारित अवधि के लिए कठोर सतहों पर बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है और छोड़ दिया एक जेल बॉक्स में बीच तुलना करें। एक: शीर्ष; नया ब्रैकट के ऑप्टिकल छवि (प्रक्रिया देखें) है कि साफ किया गया है। तल; ऑप्टिकल छवि जेल बॉक्स से दिखाई संदूषण की उपस्थिति (नीले तीर) का प्रदर्शन है। बी: cantilevers 'संबंधित थर्मल स्पेक्ट्रा की तुलना।वर्ष ब्रैकट की पहली गूंज चोटी के विस्तार स्पष्ट है (हरा तीर) और कुछ उच्च आदेश मोड बढ़ा रहे हैं (नीले तीर)। स्पेक्ट्रा खड़ी ऑफसेट और स्पष्टता के लिए एक लॉग-लॉग पैमाने पर प्रस्तुत किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आवश्यक उप नैनोमीटर संकल्प हासिल नहीं है, तो कम संकल्प पर स्वीकार्य छवियों के बावजूद, यह संभव है कि AFM टिप रासायनिक इसके भंडारण पर्यावरण के दौरान संशोधित हो गया है। यह 120 सेकंड है, जो टिप 60 पर हाइड्रोफिलिक सतह समूहों की रचना एड्स के लिए एक पराबैंगनी आक्सीकारक के लिए ब्रैकट चिप के जोखिम के द्वारा इलाज किया जा सकता है। जॉब हालांकि लिया जाना चाहिए, आवश्यक टिप ज्यामिति और यूवी शक्ति के आधार पर भिन्न हो सकते हैं सही समय के रूप में, और अधिक जोखिम टिप और कम संकल्प के blunting में हो सकता है।

थर्मल शोर </ P>

उच्च संकल्प इमेजिंग बल में बदलाव और दूरी (आम तौर पर उप-पी.एन. बलों और उप Angstrom दूरी 78) को महान संवेदनशीलता की आवश्यकता है। नरम cantilevers के लिए, अपने आंतरिक ब्राउनियन गति (थर्मल कंपन) की वजह से ब्रैकट के थर्मो-यांत्रिक गति एक समस्या हो सकती है। पहली सन्निकटन में, कठोरता कश्मीर की एक ब्रैकट के साथ, यह संभव नहीं मापने के लिए की तुलना में छोटे सुविधाओं Equation1 , थर्मल शोर, जहां कश्मीर बी बोल्ट्जमान स्थिर है और टी तापमान के आयाम। व्यावहारिक रूप से, उच्च गूंज आवृत्तियों के साथ ब्रैकट का उपयोग कर एक बड़ा आवृत्ति रेंज पर शोर फैलता है, और माप बैंडविड्थ 79 में समग्र शोर का स्तर कम कर देता है।

उच्चतर eigenmode इमेजिंग

यह कभी कभी अपनी दूसरी eigenmode पर ब्रैकट संचालित करने के लिए उपयोगी हो सकता हैवृद्धि प्रभावी कठोरता के कारण (प्रदूषण की चर्चा देखें)। व्यावहारिक रूप से, यह अपनी दूसरी eigenmode पर ब्रैकट ड्राइविंग द्वारा आसानी से किया जाता है (उच्च आवृत्ति पर दूसरे गूंज शिखर, चित्रा 1 ए देखें)। जब ब्रैकट ट्यूनिंग, बस मुख्य गूंज के बजाय दूसरी eigenmode का चयन करें और कदम के लिए 5.4 आगे बढ़ें। ध्यान दें कि InvOLS अलग है जब ब्रैकट दूसरी eigenmode पर संचालित है हो जाएगा; आमतौर पर ~ 1 / InvOLS एक आयताकार ब्रैकट के लिए कदम 5.2 में मापा के 3।

तकनीक का मुख्य सीमा है कि यह नमूना की सतह पर एक स्थिर solvation परिदृश्य की आवश्यकता है। नमूना काफी मजबूत नमूना खुद की महत्वपूर्ण विरूपण उत्प्रेरण बिना इंटरफेसियल तरल perturbing अनुमति देने के लिए किया जाना चाहिए। यह बहुत नरम और अस्थिर नमूने इतनी बड़ी biomolecules पर चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अतिरिक्त, छोटे आयाम AFM यहाँ वर्णित के रूप में पी के बारे में यांत्रिक जानकारी प्राप्त नहीं कर सकताएक नमूने के roperties, के रूप में ब्रैकट टिप इंटरफेसियल तरल पदार्थ में अपने समय के बहुमत खर्च करता है। इस के लिए, यह इस तरह के मात्रात्मक Nanomechanical मानचित्रण 80 के रूप में अन्य तरीकों का उपयोग करें या ब्रैकट गति की उच्च harmonics का उपयोग करने के लिए फायदेमंद हो सकता है। उच्चतर हार्मोनिका आम तौर पर बढ़ा रहे हैं जब (कम गुणवत्ता कारकों के साथ) तरल पदार्थ में इमेजिंग 29,81 - 83 और एक साथ स्थलाकृति और नमूने 25,81 की कठोरता प्रदान कर सकते हैं - 84 लेकिन वे आम तौर पर उच्च संकल्प के लिए हानिकारक हैं। अन्य सभी स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी तकनीक के लिए निहित सीमाओं अभी भी मान्य यहां विशेष रूप से तथ्य यह है कि अनिवार्य रूप से परिणामों को मापने टिप के बारे में जानकारी शामिल हैं। छोटे आयाम का उपयोग भी बड़ी ऊंचाई बदलाव के साथ नमूने के लिए आदर्श नहीं है; जब ऊंचाई रूपों इमेजिंग आयाम से बड़े होते हैं प्रतिक्रिया पाश अनिवार्य रूप से अधिक धीरे धीरे प्रतिक्रिया होगी, इसलिए नमूना और टिप नुकसान खतरे में डाल। उपयोग ओएफ नरम ब्रैकट एक निश्चित सीमा तक इस समस्या mitigates।

यहाँ प्रस्तुत विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह प्रदान की मशीन के शोर का स्तर काफी कम कर रहे हैं कि तरल में उच्चतम छवि संकल्प AFM के साथ संभव प्रदान करता है, लेकिन किसी भी व्यावसायिक AFM पर लागू किया जा सकता है। वाणिज्यिक उपकरणों पर तुलनीय संकल्प आमतौर पर कड़ा cantilevers के साथ एफएम-AFM में संपर्क मोड में हासिल की है, या कभी कभी होता है। AM-मोड में है और अपेक्षाकृत नरम cantilevers के साथ कार्य करना नमूनों की एक व्यापक पसंद के लिए अनुमति देता है, और सबसे सिस्टम पर एफएम AFM से लागू करने के लिए आसान है। दृष्टिकोण संकल्प को बढ़ाने और स्थानीय रासायनिक जानकारी हासिल करने के लिए कोई ठोस और तरल के बीच इंटरफेस में मौजूदा solvation बलों शोषण पर निर्भर करता है। यह सिद्धांत रूप में परिवेश की स्थिति में इस्तेमाल किया जा सकता है, केवल पानी परतों (आम तौर पर कई नैनोमीटर मोटी) सबसे हवा की नमी के कारण सतहों पर निर्माण पर निर्भर है। सिद्धांतों अंतर्निहितउच्च संकल्प रणनीति अपरिवर्तित रहते हैं लेकिन टिप के अधिकांश, हवा में है टिप एपेक्स और नमूना 85 के बीच केवल एक केशिका पुल के साथ। उच्च संकल्प इन शर्तों 86,87 में कड़ी नमूनों पर प्रदर्शन किया गया है। इमेजिंग शर्तों ब्रैकट के दोलन की एक उच्च क्यू कारक के कारण हालांकि डूबे तरल के उन लोगों की तुलना में अलग हैं। व्यावहारिक रूप से, हम यह मुश्किल शायद केशिका पुल के अस्थायी परिवर्तन की वजह से मुलायम या अनियमित नमूने पर स्थिर आपरेशन प्राप्त पाया और एक दिया ब्रैकट कठोरता के लिए वृद्धि की क्यू कारकों।

प्रोटोकॉल यहाँ बताया सबसे आधुनिक वाणिज्यिक AM-सशस्त्र बल चिकित्सा सेवा के साथ तरल में नमूनों की आणविक स्तर संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए एक पद्धति प्रदान करता है। हम इमेजिंग मानकों की हमारी पसंद के पीछे वैज्ञानिक तर्क प्रदान करते हैं और solvation बलों की भूमिका पर जोर। हम भी आम समस्याओं और विशेष रूप से संदूषण में चर्चा की। विशिष्ट टिप नमूना बातचीत सीएn नाटकीय रूप से इमेजिंग समाधान, ब्रैकट ज्यामिति और सामग्री, और नमूना रसायन विज्ञान की सामग्री पर निर्भर करता है। स्कैनिंग के दौरान उपस्थित प्रमुख बलों की प्रकृति का एक व्यावहारिक समझ नई प्रणाली के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल है और विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने के लिए इसलिए आवश्यक है। जब अनुकूलित किया है, प्रयोगात्मक दृष्टिकोण समाधान में नमूनों की स्थानीय आणविक स्तर अंतर्दृष्टि में सीटू हासिल करने के लिए शक्तिशाली है।

Acknowledgments

इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद से अनुदान (अनुदान 1452230 और ईपी / M023915 / 1), जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद (अनुदान बी बी / M024830 / 1) और यूरोपीय परिषद (FP7 CIG 631186) आभार स्वीकार कर रहे हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multimode IIIA AFM Brucker NA One of the machine used
Cypher ES AFM Asylum Resarch NA One of the machine used
AFM cantilever/tip Nanoworld Arrow UHF-AUD best for high frequency
AFM cantilever/tip Olympus RC800-PSA versatile and cheap
ultrapure water Milipore NA lab filtering systems can induce contamination
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aaldrich 200-664-3  standard chemical, no further purification
Monovalent salts Sigma-Aaldrich standard chemical, no further purification
Lipids Avanti Polar Lipids lipid bilayers formed using stadard protocols
Crystals MTI polished crystals
Scotch tape 3M Scotch Magic Tape Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly

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References

  1. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
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Miller, E. J., Trewby, W., Farokh Payam, A., Piantanida, L., Cafolla, C., Voïtchovsky, K. Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid. J. Vis. Exp. (118), e54924, doi:10.3791/54924 (2016).

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