Summary
פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של מודל איסכמיה-רה-פרפוזיה (IR) על עור אוזן עכבר באמצעות הידוק מגנט. באמצעות מודל הדמיה intravital שהותקן, אנחנו לומדים בתגובות דלקתיות vivo-רה-פרפוזיה פוסט. הרציונל מאחורי הפיתוח של טכניקה זו היא להרחיב את ההבנה של איך לויקוציטים להגיב פגיעה בעור IR.
Introduction
איסכמיה reperfusion פציעה (IRI) מתרחשת כאשר יש היפוקסיה חלף עקב החסימה של זרימת דם (איסכמיה) ואחריו מחדש חמצון הבא של הרקמות (רה-פרפוזיה). בעור, איסכמיה-רה-פרפוזיה (IR) הוא חשב להיות אחד הגורמים התורמים בפתופיזיולוגיה של פצעי לחץ, שם מנוחה במיטה ממושכת גוזר מאושפזים בבתי חולים לטווח ארוך על פשע. בחולים אלה, הוא את העור ואת השרירים הבסיסיים חשופים כל זמן בלחץ משקל המופעל על פני שטחים של בליטה גרמית, שגרמו לפציעה מקומית כי, אם אינו מטופל, עלול להפוך נימק 1.
הנזקים המעורבים IRI הם שתיים. במהלך איסכמיה, על חסימת כלי דם מובילה לירידה דרסטית של אספקת חמצן לרקמות. התוצאה היא ירידה של ATP ו- pH, אשר מנטרל ATPases מעורב חילוף חומרים תאיים. בתורו, רמות סידן הסלולר ספייק, והדגישו או פגום גאמות עוברים אפופטוזיס או נמק 2. שחרור תוכן תאי או דפוסים מולקולריים הקשורים ניזק (לח), כמו HMGB1, תורם את התגובה הדלקתית 3. העלבון השני מתרחש במהלך רה-פרפוזיה. למרות שרמות החמצן pH משוחזרים במהלך רה-פרפוזיה, זו התוצאה בדור של מינים חמצן תגובתי (ROS), אשר מוביל חמצון של שומנים תאיים, DNA וחלבונים. כתוצאה מכך, מתווכים פרו-דלקתיים מופעלים, אשר מגדירה את תגובה דלקתית משני המערבת את הגיוס של תאים חיסוניים לאתר הדלקתי 2. בעוד מפל של אירועים ביוכימיים שהובילו את התגובה הדלקתית תוארה היטב, הסדרת במרחב ובזמן של פעילות התא החיסון אינם מובנים היטב.
כאן אנו מתארים מודל IR חזק על עור עכבר אוזן באמצעות הידוק פשוט מגנט. יחד עם הדמיה intravital multiphoton (MP-IVM), אנוהוקם מודל ללמוד את התגובות הדלקתיות vivo ב המתרחשות לאחר רה-פרפוזיה מתרחש. הרציונל מאחורי פיתוח השימוש בטכניקה זו הוא לנסות להבין איך היא ביניים שחדר לתאים להגיב IR בזמן אמת.
מודלים קיימים של IR באמצעות טכניקת ההידוק בכנף העור הם פולשני מאוד, כפי שהם דורשים ההשתלה כירורגית של לוחות פלדה ב בכנף העור, מה שהופך אותם פחות מ-אידיאלי עבור מחקרים אימונולוגית 4. טכניקת הידוק דומה פולשני תוארה ב 5,6 אגף עור עכבר. עם זאת, בשל השילוב של מרכיב הדמית intravital בשיטה זו, אנו בחרנו ב- עור האוזן כאתר IR הממוקד, כפי שהוא עוקף תנועות עקב נשימה מציע יציבות במהלך הדמית 7,8. יתר על כן, תת לויקוציטים כי היקף interstitium זהים בין עור האוזן ואת אגף העור, אם כימספרים ופרופורציות עשויים להשתנות מעט 9. לכן, עור האוזן ייצג אתר הדמיה אידיאלי.
בנוסף, רוב הנתונים שנמצאו ממודלי IRI אלה מוגבלים הערכות מקרוסקופית (לדירוג של כיבים) וניתוחים מיקרוסקופים של אינדיקטורים דלקתיים סיום 10. באמצעות מודל זה, ויזואליזציה בזמן אמת של התגובה התאית של נויטרופילים לאחר רה-פרפוזיה בעור של עכבר כתב ניאון מופעלת. מודל הדמית אוזן intravital שפורסם בעבר מנוצל 8 עם שינויים נוספים (איורים 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים העוסקים בבעלי החיים נערכו בהתאם לכל שימוש בבעלי החיים הרלוונטי והנחיות טיפול ותקנות.
1. בחירה של עכברי כתב ניאון
- השתמש 6 ל- 12 שבועות בן LysM-eGFP 11 עכברים (לא העדפה או זכרים או נקבות).
הערה: שימוש עכברי כתב ניאון תא ספציפי שונים מאפשר ההדמיה של תאים חיסוניים שונים in vivo. בנימה זו, במחזור נויטרופילים (תאי היי GFP), במחזור מונוציטים (תאי lo GFP), ו מקרופאגים עורי (תאים lo GFP) ניתן דמיינו. עם משמשים את הפרמטרים הדמיה, רק את האותות וצחים נויטרופילים GFP חיובי יזוהו.
הערה: רשימה של זני עכבר כתב ניאון חיסוני תאים ספציפיים מתאימים לסוג כזה של מחקר הדמית עור ניתן למצוא סימוכי 8.
הערה: מומלץ מאוד כי עכברים לבקנים לשמש הדמיה, כמו חזירעכברי טד נוטים יותר ניזקים. הסיבה לכך היא כי עור אוזן פיגמנט הוא הרבה יותר רגיש שנקר ליזר מושרה (שמעיד על שריפת רקמות). כתוצאה מכך, גיוס נויטרופילים וצבירה אפשר לראות גם במהלך המצב היציב 8,12. - שמור על העכברים ספציפיים הפתוגן ללא (SPF) תנאים עם מחזורי אור כהה 12 שעות.
2. עכבר הרדמה
- להרדים את העכבר עם זריקה תוך הצפק של xylazine קטמין (8 μL g -1 משקל גוף), מורכב מתערובת של 15 מ"ג מ"ל -1 קטמין ו 1 מ"ג מ"ל -1 xylazine מומס במים סטריליים.
- מניחים את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה ב 37 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך הכנה. בדוק הרדמה מספיק ידי התבוננות היעדר רפלקס קמצוץ הבוהן.
הערה: אחרי השעה הראשונה, מינונים ברבעון הבאים של הרדמה יהיו צורך תת-עוריתד יימשך כ 0.5 שעות כל אחד. עווית שפם או הזנב עשויה גם להצביע על כך ההרדמה מתפוגגת וכי נדרש למעלה למעלה. - השתמש סיכת עיניים על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
3. אפילציה
- בזהירות להחיל קרם מקריח לשני השלישים העליונים של אוזן עכבר הגבה באמצעות applicators כותנה-טיפ.
- חכה 2 - 3 דקות לפני הסרת הקרם באמצעות applicators כותנה-טיפ רטוב באופן יסודי אך עדין.
הערה: אל תאפשרו הסרת שיער קרם להישאר על אוזן העכבר במשך זמן רב מדי, מכיוון שהוא עלול לגרום דלקת 13,14.
אינדוקציה 4. של איסכמיה ו reperfusion פגיעה
- השתמש מגנטים ניאודימיום מצופה זהב, N42 כיתה, 12 מ"מ קוטר x 2 מ"מ עובי, ועם דירוג גאוס של כ -3,000 לגרום איסכמיה בעור העכבר האוזן.
הערה: במקרה זה, לנוכח הגומות של המגנטים denotes הקוטב הצפוני שלה. - חריץ המגנטים לתוך מדריכי הפלסטיק האישיים שלהם.
הערה: מדריך הפלסטיק משמש כדי להקל על המיקום ופרדה של מגנטי חוזק הגבוה. בשל הכח המגנטי החזק שלהם עדיין התנגדות נמוכה שביר, אל תניחו מגנטים בודדים בסמיכות זה לזה או מתכות אחרות. גרוטאות לשבבים עלולות להתרחש אם הם מושכים אחד כלפי שניים. - מקם את המגנט הראשון (הגבה) כגון רק שהקצה נמצא בקשר עם המגנט השני (הגחון) (איור 3 א)
הערה: פעולה זו מונעת מגנטים מ snapping יחד לפני שהם הוצבו כראוי. - מקם שני המגנטים כך מגנט הגחון שוכב על (איור 3 א) האוזן.
הערה: לפני איסכמיה מושרת, להבטיח כי העכבר נשמר על 37 מעלות צלזיוס, כי ההרדמה מספיק נשמרה (ראה שלב 2.2). - ברגע מוכן, בזהירות ולתת מגנטים מתאחדים (איור 3 א הערה: למטרות הדמיה, מהדק רק מחצית האוזן כך אזור IR והלא-IR ניתן לצפות.
- לאחר 1.5 שעות של איסכמיה, להסיר את המגנטים על ידי סיבוב משם המגנטים זה מזה באמצעות מדריכים פלסטיק, המאפשר רה-פרפוזיה להתקיים.
הערה: יש להקפיד על מנת למנוע את האוזניים מן הקמטים כאשר ממוקמים המגנטים. איסכמיה Incomplete ניכרה אם כלי דם גדול הגלויים macroscopically מחדש Perfuse מייד (כלומר, דם ממלא את הכולים מייד) לאחר המגנטים יוסרו. למרות רה-פרפוזיה אינה מתרחשת מיד לאחר הסרת מגנטים, חסימה של כלי דם הוא רק חולף. ככזה, הוא הכרחי כדי להכין את אוזן עכבר הדמיה מהר ככל האפשר.
5. הזרקה של סוכני תיוג כלי הדם
- מיד לאחר הסרת מגנט, לנהל לווריד (באמצעות הזרקה לווריד רטרו מסלולית או זנב) אוונס כחול (10 מ"ג מ"ל -1ב PBS או תמיסת מלח; 1 μL g -1 משקל גוף) או סוכן אחר תיוג כלי דם של בחירה.
הערה: לפני הזריקה, להבטיח כי ההרדמה מספיק עדיין נשמרה על ידי ביצוע צביטת בוהן עדינה.
6. מיקום של האוזן על פלטפורמת ההדמיה
- חותכים 2 חתיכות של נייר דבק 1.5 ס"מ אורך ו -1.8 ס"מ רוחב.
- אפשר הצדדים הדבקים להיצמד זו לזו תוך השארה על 1 מ"מ של דבק לאורך רוחבו.
- חותכים את קלטת מסוך לשניים, לאורך, כדי להתאים את מיקומה בתוך החריץ על פלטפורמת האוזן.
- הכנס קלטת מסוך זה בערך באמצע החריץ, כגון שהצד הדבק פונה כלפי מעלה.
- מקם את העכבר על כרית חימום, כך האוזן להיות צילמו נמצא ליד רצועת בסרט הדבקה.
- באמצעות שני אפליקטורים כותנה-טיפ-טבולה PBS, לחץ בעדינות על האוזן נגד פס הדבקה.
- באמצעות הרצועה כמדריך, להביא את אוזן העכברדרך החריץ תוך התאמה והעכבר לקראת השלב בו זמנית.
- כדי להסיר את הסרט הדביק, ראשון להוסיף טיפה של PBS להפחתת הדביקות של הקלטת.
- הפרד את אוזן העכבר מהקלטת המיסוך בעדינות ככל האפשר באמצעות מכחול בסדר.
- שטח את האוזן כנגד במת האוזן על ידי גלגול מוליך כותנת טיפ לח בעדינות מעל האוזן.
- שים טיפת PBS מתחת coverslip (אשר נשמר בעמדה על בעל coverslip באמצעות גריז; איור 2) בעדינות ולהניח אותה על האוזן. הוספת הכספים עם PBS יותר במידת הצורך.
הערה: בעל coverslip מגביר את היציבות במהלך הדמיה. - הכנס את בדיקת הטמפרטורה רקטלית לחבר את החוטים אל מערכת החימום פי הוראות היצרן.
הערה: הגדר את הטמפרטורה של כרית חימום גוף ל -37 מעלות צלזיוס ואת פלטפורמת במת האוזן עד 35 ° C.
7. multiphoton מיקרוסקופ הגדרמעלה פרמטרי הדמיה
הערה: פרוטוקול זה משתמש קרן אחת, מיקרוסקופ multiphoton עם מתכונן (680 - 1,080 ננומטר) Ti: ליזר Sa (3.3 W ב 800 ננומטר; אורך הפולס של 140 fs; שיעור החזרה 80 MHz) עם מטרת מים 20X (NA = 1.0) עבור בדיקות הדמיה intravital.
- פתח את תוכנת ההדמיה.
- יישר את הלייזר על פי הוראות היצרן.
- להתאים את אורך הגל עירור על 950 ננומטר.
הערה: GFP וכחול אוונס יכול להיות נרגש בו זמנית ב 950 ננומטר. - כדי לצפות בתצוגה מקדימה, השתמש את ההגדרות הבאות: 500 מיקרומטר 2 scanfield, 505 x 505 פיקסלים ברזולוציה, ואת תדר סריקה של 800 רץ ב סריקת שורה אחת. לחץ על "תצוגה מקדימה".
- למתג את הכוח מחליש (לייזר). ודא שכל אותות חיוניים נאספות בלי לחשוף בתחום ההדמיה כדי כמויות עודפות של כוח לייזר, אשר עשוי לגרום נזק חום.
הערה: התחל בהספק מחליש נמוך ולהגדיל אם סייגl מעומעמת. כפי נויטרופילים ייעדר מן interstitium בשלב מוקדם מצביע שלאחר reperfusion, מקרופאגים יכול לשמש מד כדי לקבוע את הכוח המינימלי הנדרש, כמו לשעבר הם דימר מאשר נויטרופילים.
הערה: אם צעד זה צריך להיעשות בפעם הראשונה, להתאים את הגדרות באזור שאינו איסכמי, שם שלמות כלי דם ללא פגע צפויה ויאפשר את ההגדרה של הכח המחליש. בניסויים הבאים, הגדרות אלו אינן מחייבות שינוי הרבה אלא אם כוח לייזר אינו יציב. - התאם את הגדרות PMT.
הערה: בדוק עם היצרן עבור מתח רווח המקסימאלי האופטימלי עבור PMT. הגדרת מתח PMT מעבר לסף המומלץ תגרום יחס אות לרעש גבוה. ההמלצה הכללית היא לקבוע את מתח רווח PMT אל הסף המומלץ להגדיל את הכח מחליש לפי צורך צריכה את האות להיות כהה מדי. - בחר אזור הדמיה כי הוא בסמיכותקצה איסכמיה, המאופיינת דליפה כחולה מסיבי אוונס.
- אסוף GFP אותות אוונס כחול באמצעות bandpass 525/50 (BP) ומסננים BP 655/40, בהתאמה. עבור דור הרמוני שניים (SHG) אותות של סיבי קולגן בתוך תא עורי, להשתמש במסנן 475/42 BP.
- צור תיקייה לשמור את התמונות בפורמט תואם עבור תוכנת ניתוח תמונה הזמינה.
- לרכוש, להשתמש בהגדרות הבאות: 500 מיקרומטר 2 scanfield, 505 x 505 פיקסלים ברזולוציה, וכן רץ סריקה בתדר 400 סריקת שורה אחת.
- 100 מיקרומטר Z- מחסנית עם גודל צעד של 4 מיקרומטר ניתן לרכוש שוב ושוב לאורך זמן, ב 1 במרווחים דקות, כדי לפקח חדירת נויטרופילים.
הערה: במיוחד עבור לויקוציטים (למשל, נויטרופילים) עם מהירות נדידה גבוהה, מרווח ארוך יותר מזה של 1 דק 'עלול לגרום קשיים במהלך ניתוח מעקב תא. במקרה זה, המשתמש יכול גם להפחית את העובי של acquisition מחסנית או להגדיל את תדירות הסריקה.
ההערה: כאשר מחסנית הרכישה הנדרשת של אזור איסכמי עשויה להופיע קטנה כתוצאה של הדחיסה (המאופיינת לחלופין על ידי עוצמת SHG גבוהה), רה-פרפוזיה עוקבת תגרום לדלקת מסיבית שגורמת לאוזן להתנפח. מרחף מהותי-בכיוון Z צפוי. ככזה, רכישת z-ערימה גדולה יש צורך להתאים את הסחף. - במהלך ההדמיה, הדף את PBS ומים באופן קבוע כדי לשמור על האוזן לחה העדשה האובייקטיבית השקועה במים.
הערה: ניסוי טיפוסי בדרך כלל נמשך 2 - 4 h. בהתאם לעיצוב ניסיוני, בשילוב עם משטר הרדמה מבוקר היטב, הארכת משך ההדמיה אפשרית.
8. סיום הניסוי
- להרדים את העכבר על ידי מחנק פחמן דו חמצני על פי טיפול בבעלי החיים המוסדי של מוסד ועדת שימוש (IACUC) יחסי ציבורocedures.
הערה: תמיד להרדים את העכבר על ידי שיטות אשרו כפי שנקבע על ידי הכללים של המוסד, תקנות והנחיות. אם הדמיה חוזרת ונשנית נדרשת, לשמור את העכבר על כרית החימום עד ההרדמה פגה. לאחר העכבר שב להכרתו הנאותה והנו גורם נייד, להחזיר את העכבר לכלוב שלה.
ניתוח תמונה 9.
הערה: נתונים שנוצרו מניסוי ההדמיה ניתן דמיינו ידי חבילות תוכנה שונות.
- פתח את תוכנת ניתוח הדמיה.
- לעלות מצב תחת, לייבא את הקובץ (פתוח → לבחור כל קובץ בתיקייה הרצויה → לחץ "לפתוח").
- צבעים פסאודו ערוך אם מצבעי ברירת מחדל אינו חלים (לכיוון תצוגה → ערוך → בכרטיסיית הערוץ, בחרו את הצבע הרצוי מתוך לוח הצבעים).
- התאם את הבהירות, הניגודיות, ורקע (Edit → לכיוון תצוגת → מקס Toggle וערכי מינ '). ודא כי ממדי הקובץ נכון (Edit → מאפייני תמונה → בכרטיסיית הגיאומטריה, לבדוק את גודל voxel. בפרוטוקול זה, X = 0.99, Y = 0.99, ו- Z = 4).
הערה: לגזור X ו- Y על ידי חלוקת מימד scanfield ידי פיקסל ברזולוציה. Z הוא העובי בין כל פרוסה.
הערה: תפוקת ערכות נתונים אלה ניתן להציג סרטי הקרנת מקסימלית.
הערה: ניתוח מעקב נדרש לאפיין את פעילות הסלולר מלא ואינטראקציות על מנת להבין את תפקידם in vivo. הוראות מפורטות של מעקב תאים באמצעות פונקצית המקום הפנויה בתוכנה ניתן למצוא בפרוטוקול סימוכין 15.
הערה: ישנן דרכים רבות של הגירה לויקוציטים לכימות, שפרטיו ניתן למצוא במאמר ביקורת ההפניה 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה משתמש פלטפורמת הדמית עור שהותקנה אוזן, כפי שמוצג באיור 1. מספר תכונות של פלטפורמה זו נועדו במיוחד כדי להקל הדמיה תוך שמירת הגדרות פיסיולוגיות. הצבת האוזן על פלטפורמת פליז המחוממת לא רק שומרת על האוזן בטמפרטורה פיזיולוגית של 35 מעלות צלזיוס, אבל זה גם מבודד את האוזן מתנועות בלתי נמנעות עקב נשימה. התוספת של קליפ מתכת בפלטפורמת פליז יוצרת פער למנוע בעל coverslip מ הפעלת משקל על האוזן, ובכך לשמר את זרימת דם ללא הפרעה. הפלטפורמה הבמה נועדה גם כדי להכיל כרית חימום המשמרת את העכבר על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הליך ההדמיה.
בעל coverslip (איור 2) נועד לאפשר את coverslip שתצורף על בעל מתכת בעזרת grea ואקוםse. בעל coverslip מחובר עמדה המאפשרת התאמה גמישה של הציר האנכי לאופקי בעזרת המתאם. בדרך זו, המשתמש יכול להתאים את המיקום הראשון במדויק של coverslip מעל האוזן ובהמשך לתקן עמדה על ידי הידוק הברגים על המתאם.
בפרוטוקול זה, שתיארנו את השימוש של מגנטים כדי לדמות איסכמיה ו reperfusion. איור 3 מציג נופים נציג של האוזניים לפני ומיד לאחר איסכמיה. בתנאים פיסיולוגיים, כלי דם גדולים ניתן דמיינו macroscopically. ההשפעה הצובטת של המגנטים באופן זמני נובעת זרימת הדם, אשר יכול להיות שנצפתה על ידי שפעה לבנה חולפת (חץ שחור) כאשר המגנטים יוסרו.
בהפגנה המסוים הזה, הדמיה מתמקדת בשולי אזור איסכמי (איור 3c (איור 3D). זה יוצר ציוני דרך חשובה עבור בדיקות הדמית intravital ומסייע לשמור על עקביות בין ניסויים עצמאיים.
מהנתונים עולה כי, בתגובה עלבון IR, שחדר היציאה נויטרופילים לתוך interstitium מכלי שלמים דם רירית בקצה אזור איסכמי ולהעביר כלפי האתר פציעה (איור 3D ו סרט 1). אנו מצפים תגובה מאוחרת של נויטרופילים נודדים אל interstitium לעומת דגמי דלקת אחרים בשל חוסר כלי דם מרוסס קיימא עליה קודם מועד לפי שעון-רה-פרפוזיה פוסט. כדי לאפיין אלה במלואן תאפעילויות תואר בלבד, ניתוח מעקב תא עשוי להיות מועסקים על מנת להבין פונקצית in vivo שלהם. מהירות, אומרת עקירה, ואינדקס chemotactic הם חלק מן לקריאת פסקי פוטנציאל שהיה יכול להתקבל מניתוח מעקב התא.
איור 1. סכמטי תרשים של שלב עור האוזן מחוייט עבור Intravital multiphoton הדמיה. (א) להציג לראש במת הדמית האוזן עם ממדיו. (ב) לאור פרונטאלית ומימדים. ראוי לציין, כי צלחת פליז עבה בצדדים, כדי לספק יציבות הפלטפורמה, רזה באמצע, כדי למזער שטח מגע עם העור, על מנת להבטיח את זרימת דם ללא הפרעה כאשר האוזן מקופלת מעבר לקצה החריץ ו נוח על הרציף. (ג) מבט צד של בעל המעוקל שמצמיד את חללית המשוב. כרית החימום יכולה להיותמקובעי הפלטפורמה באמצעות דבק (לא מוצג). שונה מן Li et al., נט Protoc 2012 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. עיצוב של המחזיק Coverslip; לוואי ותגובות עמוד צג. בעל coverslip מחזיק coverslip בתנוחה קבועה ובכך מקטין להיסחף z. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. דגם IR. (א) תרשים סכמטי המציג את המיצוב של מגנטים. (ב) (ג) סכמטי של האוזן מראה האזור צלם ביחס למקום שבו הונח המגנט. (ד) מקסימום עוצמת תמונות-מוקרן z מתוך רצף זמן לשגות מראה חדירת נויטרופילים-רה-פרפוזיה הדואר עכבר LysM-eGFP. זמן שחלף מוצג hh: mm. בר סולם: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1. גיוס נויטרופילים פגיע IR. רצף הזמן לשגות של הקרנת מקסימלית מראה נויטרופילים (ירוק) חדירים בתגובת reperfusion בעור אוזן עכבר לבקן LysM-eGFP לאחר 1.5 שעות של איסכמיה. בנקודות מוקדם יותר זמן, חוסראות אוונס הכחולה (אדום) עולה חסימת כלי רכב זמנית לאחר איסכמיה. קולגן (כחול, דור הרמוני שני). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מַשְׁמָעוּת
IR הוא אחד הגורמים המובילים של פצעי לחץ עור. בשלבים הראשונים (I ו- II) של פצעי לחץ לתאר את מצבו של העור האנושי (לעומת רקמות תת עורית הבסיסית והשרירים). עם זאת, הבנה של האטיולוגיה אימונולוגיים עדיין לוקה בחסר. כאן, אנו מציגים מודל IR פשוט חזק על עור אוזן עכבר על מנת לתת מענה לפער זה. אנו לדמות איסכמיה על ידי כיווץ האוזן העכבר בין שני מגנטים, ובהמשך ללמוד את התגובות החיסוניות במורד הזרם לאחר הסרת מגנט (רה-פרפוזיה). באמצעות מגנטים כדי ליצור לחץ מתמיד על כל אוזן לתקופה קצובה, וכן גרימת איסכמיה, אנו מסוגלים להבטיח שחזור עקבי בין ניסויים.
כוחו של מודל IR לא פולשנית זו גם טמון ביכולתה להפגין, בזמן אמת, בתגובות חיסוניות vivo על ידי ניצול מודל ומבוסס של imagin intravitalגרם של עור האוזן, המציע יותר יציבות במהלך ההדמיה לעומת הליך אגף עור. חלק מן דגמי אגף עור העכשוויים כללו ניתוחים שעשויים לשנות את הנוף החיסוני של העור 4. בנוסף, הדמיה בכנף העור עצמו מציבה אתגר טכני, כתנועות נשימה עשויות לתרום חפצי תנועה קשורה במהלך הדמית 5,6. המודל הנוכחי שלנו עוקף בעיות אלה.
בנוסף ללימוד התגובות הפיזיולוגיות של תאי מערכת החיסון כדי IR, מודל זה עשוי גם הוא להיות מיושם הגדרות pathophysiological כמו סוכרת, שבו סוכרת עלולה להחמיר פגיעה IR דרך סטרס חמצוני מוגבר. הבין את התגובה החיסונית יתרום להבנה של ריפוי פצעים.
קריטי שלבים
לאחר העכבר הוא בהרדמה, thermoregulation נפגעת ואת טמפרטורת הגוף הליבה טיפות באופן דרסטי. כדי למנוע hypotהרמייה, חימום חיצוני חיונית כדי לשמור על טמפרטורת גוף ליבה על 37 מעלות צלזיוס. האוזן, ממוקמת distally עד יסוד הגוף, הוא קריר פיסיולוגי על ידי 1 - 2 מעלות צלזיוס, צריך להישמר אצל 35 ° C. עקביות זו חימום גם תבטיח-outs לקרוא לשחזור של דינמיקת תא. במקביל, מערכת החימום חייב להיבדק על מנת להבטיח כי העכבר הוא לא על חימום לאורך כל אורכו של הרדמה.
השימוש עכברים לבקנים (BALB / C ו C57BL / 6-C 2J) עבור כל בדיקות הדמיה העור מומלץ מאוד על מנת למנוע פציעות שניקרו הנגרמת פיגמנט. אם עכברים לבקנים אינם זמינים, ומקטין את כוח לייזר במהלך רכישת התמונה עשוי להקל על הבעיה עבור עכברים פיגמנט. עם זאת, אופטימיזציה נוספת עשויה להיות נחוצה, כמו עומק מופחת של חדירה לרקמות עלול לגרום לתוצאת רכישת עניים.
העור הצמוד לאוזן, הוא מאוד עדין; ומכאן, יש להקפיד כדי למנוע כל נסיבותעלול לגרום לדלקת. דוגמאות של טכניקות פסולות כוללות, אך אינם מוגבלות, את הדברים הבאים: 1) להשאיר את הקרם המקריח על בסכום מופרז של זמן על מה מומלץ; 2) החלת חיכוך יתר על האוזן כאשר מביאים לאוזן דרך החריץ של פלטפורמת הדמיה לאוזן, או כשהוא מנתק את האוזן מהקלטת מיסוך; ו -3) התחממות יתר האוזן, אם בגלל מערכת חימום פגומה או בדיקת משוב טמפרטורה במקומה כי ניתן להקליט טמפרטורת סביבה במקום טמפרטורת עכבר הליבה.
שינויים ופתרון בעיות
רוב התקלות הנוגעות הליך הכנת אוזן כבר רשום 8 בעבר. אם האוזן הוא צלם בנקודת הזמן מה לאחר מכן-רה-פרפוזיה פוסט, האוזן יכולה להתנפח מעבר פער 0.5 המ"מ שיצר קליפ המתכת כדי להתאים את העובי של האוזן (איור 1). בתרחיש זה, את המיקום של coverslip על האוזןעלול לעכב את זרימת דם, אשר באה לידי ביטוי כאשר כלי הדם הגלויים macroscopically נעלמים מן העין. זה חייב להימנע על ידי יצירת פער גדול בין בעל coverslip ואת פלטפורמת פליז. ניתן לעשות זאת בשתי דרכים, או על ידי התאמת הגובה ידני של בעל coverslip (איור 2) או באמצעות קליפ מתכת עבה.
מגבלות של הטכניקה
בפרוטוקול זה, השתמשנו אוונס כחול כדי לקבוע את המיקום של אזור איסכמי, מאז דליפה של אוונס כחול ב interstitium מסמן את הגבול של אזור איסכמי בנקודות זמן מוקדם-איסכמיה פוסט. אוונס כחול הוא נפוץ כמו סוכן תיוג כלי דם. עם זאת, בתנאים דלקתיים, שלמות כלי דם נפגעת קשה. זו תוצאה של הדליפה של כחול אוונס לתוך interstitium. במודל זה, אנו צופים פסד דרסטי של ניגוד בין כלי דם interstitium זמן קצר לאחר רה-פרפוזיה. ככזה, ב studies שבו אינטראקציות-אנדותל לויקוציטים מעורבים, אנו ממליצים לנסות סוכני תיוג כלי דם אחרים בגדלים שונים (למשל, dextrans, וכו.).
יישומים עתידיים
מלבד ניצול עכבר LysM-eGFP להדגים כיצד נויטרופילים להגיב IR עור, מודל זה יכול לשמש גם ללימוד תגובות לויקוציטים אחרים, הוא הסתננות (מונוציטים) וב ביניים תושב (מקרופאגים) לויקוציטים. מודל זה יכול להתארך גם למחקרים אחרים בחינת דם ויושרה הלימפה, כמו גם יחסי גומלין-אנדותל לויקוציטים לאחר פציעת IR. אם נוסיף לכך את היכולת לחזות קולגן כאותות SHG דרך MP-IVM, זה גם יהיה מעניין לעקוב אחר שלמות קולגן לאחר IR או במהלך ריפוי הפצע. לסיכום, הקמנו מודל בלתי פולשני, חזק של IR עבור הדמית intravital כדי ללמוד תגובה חיסונית בעור עכבר האוזן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J.
