Summary
Denne protokollen beskriver induksjon av en ischemi-reperfusjon (IR) modell på museøre huden ved hjelp av magnet fastspenning. Ved hjelp av en spesialbygd intra bildebehandling modell, studerer vi in vivo inflammatoriske responser etter reperfusjon. Begrunnelsen bak utviklingen av denne teknikken er å utvide forståelsen av hvordan leukocytter svare på huden IR skade.
Introduction
Iskemi-reperfusjonsskade (IRI) oppstår når det er en forbigående hypoksi på grunn av obstruksjon av blodstrømmen (iskemi), etterfulgt av en etterfølgende ny oksygenering av vev (reperfusjon). I huden, er iskemi-reperfusjon (IR) antas å være en av de medvirkende faktorer til patofysiologien av trykksår, hvor langvarig sengeleie predisponerer langtidssykehuspasienter til skade. Hos disse pasientene er både hud og underliggende muskler stadig utsatt for vekt press over områder av bendel, som resulterer i lokaliserte skader som, hvis venstre ubehandlet, kan bli nekrotisk en.
De som er involvert i en IRI skader er todelt. Under ischemi, okklusjon av blodkar fører til en drastisk nedgang av oksygentilførsel til vev. Dette resulterer i en reduksjon av ATP og pH, som inaktiverer ATPaser som er involvert i cellulær metabolisme. I sin tur, cellular kalsium nivåer pigg, og stresset eller skadet calen gjennomgå apoptose eller nekrose to. Utgivelsen av intracellulære innhold eller skader forbundet molekylære mønstre (damp), som HMGB1, bidrar til den inflammatoriske respons tre. Den andre fornærmelse oppstår under reperfusjon. Selv om oksygen og pH-verdier er gjenopprettet i løpet av reperfusjon, dette resulterer i dannelsen av reaktive oksygenarter (ROS), som fører til oksidasjon av intracellulære lipider, DNA og proteiner. Følgelig er pro-inflammatoriske mediatorer aktivert, noe som utløser en sekundær betennelsesreaksjon som innebærer rekruttering av immunceller til provoserende for 2.. Mens kaskade av biokjemiske hendelser som fører opp til den inflammatoriske responsen har vært godt beskrevet er den romlige og tidsmessige regulering av immuncelle aktiviteter ikke godt forstått.
Her beskriver vi en robust IR-modellen på mus øret huden ved hjelp av enkel magnet klem. Sammen med multiphoton intra imaging (MP-IVM), vietablert en modell for å studere in vivo inflammatoriske responser som oppstår etter reperfusjon finner sted. Bakgrunnen for utvikling og bruk av denne teknikken er å prøve å forstå hvordan både interstitiell og infiltrere celler svare på IR i sanntid.
Eksisterende modeller av IR hjelp av klem teknikk på huden flanke er meget invasiv, da de krever kirurgisk implantering av stålplater i huden flanke, noe som gjør dem mindre enn ideelle for immunologiske studier 4. En tilsvarende ikke-invasiv klem teknikken har blitt beskrevet i musehud flanke 5,6. Men på grunn av inkorporering av den intravital avbildning komponent i denne metoden, vi i stedet valgte øret huden som det målrettede IR-området, da den omgår bevegelser på grunn av pusting og gir stabilitet under avbilding 7,8. Videre leukocytter undergrupper som strekker interstitium er identiske mellom øret hud og hud flanke, selv omantall og andelen kan variere noe 9. Dermed representerer øret huden en ideell avbildning nettstedet.
I tillegg har de fleste data som hentes fra disse IRI modellene er begrenset til makroskopiske evalueringer (gradering av magesår) og mikroskopiske analyser av endepunkt inflammatoriske indikatorer 10. Ved å bruke denne modellen, er sanntids visualisering av den cellulære responsen av neutrofiler etter reperfusjon i huden av et fluorescerende reporter mus aktivert. En tidligere utgitt intra øre bildeinformasjonen blir benyttet til 8 med ytterligere modifikasjoner (figurene 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter som arbeider med levende dyr ble utført i henhold til alle relevante dyr bruk og retningslinjer og regelverk vesenet.
1. Valg av Fluorescent Reporter Mus
- Bruk 6- til 12 uker gamle LysM-EGFP 11 mus (ingen preferanse for enten menn eller kvinner).
Merk: bruk av ulike celle-spesifikke fluoriserende reporter mus muliggjør visualisering av forskjellige immunceller in vivo. I denne belastningen, sirkulerende nøytrofile (GFP hi celler), sirkulerende monocytter (GFP lo celler), og dermal makrofager (GFP lo celler) kan visualiseres. Med bildeparametre brukes, vil bare lyse signaler fra GFP-positive nøytrofile bli oppdaget.
Merk: En liste over immun-celle-spesifikke fluorescerende reporter musestammer som er egnet for denne type hud bildebehandling studien finnes i referanse 8.
Merk: Det anbefales sterkt at albino mus brukes til bildebehandling, som pigmented mus er mer utsatt for photodamage. Dette er fordi den pigmenterte øret huden er mye mer følsom for laser-indusert speckling (indikativ for vev brenning). Som et resultat av dette kan neutrofil rekruttering og akkumulering holdes selv under likevekt-8,12. - Hold mus i patogenfrie (SPF) forhold med 12-timers lys-mørk sykluser.
2. Mouse Anestesi
- Bedøve mus med en intra-peritoneal injeksjon av ketamin-xylazin (8 mL g -1 kroppsvekt), som består av en blanding av 15 mg ml -1 ketamin og 1 mg ml -1 xylazin oppløses i sterilt vann.
- Plasser musen på en varmepute for å opprettholde sin kroppstemperaturen på 37 ° C gjennom hele fremstillingsmetode. Sjekk for tilstrekkelig anestesi ved å observere et fravær av en tå klype refleks.
Merk: Etter den første timen, vil påfølgende kvartal doser av bedøvelse må gis subkutant end vil vare i ca 0,5 time hver. Den rykninger av værhår eller halen kan også indikere at bedøvelsen har på seg av og at en topp-up er nødvendig. - Bruk oftalmisk smøremiddel på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
3. Hårfjerning
- gjelder Hårfjerningskrem nøye til de øvre to tredjedeler av rygg musen øret ved hjelp av bomull-tip applikatorer.
- Vent i 2-3 minutter før du fjerner kremen bruker våt bomull-tip applikatorer på en grundig men mild måte.
Merk: Ikke la hårfjerning krem for å holde på musa øre for lenge, da det kan forårsake betennelse 13,14.
4. Induksjon av iskemi og reperfusjon Injury
- Bruk gullbelagte, N42-grade neodymmagneter, 12 mm diameter x 2 mm tykk, og med en Gauss rating på ca 3000 å indusere iskemi i mus øret huden.
Merk: I dette tilfellet er det fordypninger flate av magnetene Denotes sin nordpol. - Slot magnetene i sine enkelte plastskinnene.
Merk: plastføringen tjener til å lette plassering og separasjon av høy styrke magneter. På grunn av sin sterke magnetiske kraft ennå lav motstand mot brudd, ikke plassere individuelle magneter i umiddelbar nærhet til hverandre eller til andre metaller. Skrap og splint kan oppstå hvis de trekker mot hverandre. - Plasser den første (dorsal) magnet, slik at bare kanten er i kontakt med den andre (ventrale) magnet (figur 3a)
Merk: Dette hindrer at magnetene fra snapping sammen før de er forsvarlig plassert. - Plasser begge magneter slik at den ventrale magnet ligger flatt på øret (figur 3a).
Merk: Før iskemi er indusert, sikre at musen holdes på 37 ° C og at tilstrekkelig anestesi opprettholdes (se trinn 2.2). - Når det er klart, nøye la magnetene kommer sammen (figur 3a Merk: For bildedannende formål, klemme bare halvparten av øret slik at en IR og ikke-IR-området kan observeres.
- Etter 1,5 timer med iskemi, fjerne magnetene ved å vri magnetene vekk fra hverandre ved hjelp av plaststyringer, slik at reperfusjon å finne sted.
Merk: Det må tas for å hindre at ørene krøller seg når magnetene er plassert. Ufullstendig ischemi er tydelig hvis de makroskopisk synlige store blodkar gjen perfuse umiddelbart (dvs. fyller blodet fartøyene umiddelbart) etter at magnetene er fjernet. Selv om reperfusjon ikke skjer umiddelbart etter fjerning av magneter, er blodkar okklusjon bare forbigående. Som sådan, er det viktig å fremstille det museøre for avbilding så raskt som mulig.
5. Injeksjon av blodkar merking Agents
- Umiddelbart etter magnet fjerning administrere intravenøst (via retro-orbital eller hale vene injeksjon) Evans blue (10 mg ml -1i PBS eller saltvann; 1 mL g -1 kroppsvekt) eller en annen blodåre merking agent av valget.
Merk: Før injeksjon, sikre at tilstrekkelig bedøvelse er fortsatt opprettholdt ved å utføre milde tå knipe.
6. Plassering av øret på Imaging Platform
- Klipp 2 deler av maskeringstape 1,5 cm i lengde og 1,8 cm i bredden.
- La limet sidene for å holde sammen mens forlate ca 1 mm av lim langs bredden.
- Skjær maskeringstape i to, på langs, for å imøtekomme sin plassering i slissen på øret plattformen.
- Sett denne maskeringstape omtrent halvveis gjennom sporet, slik at limet siden vender opp.
- Plasser musen på varmepute, slik at øret som skal avbildes er ved siden av maskeringstape.
- Ved å bruke to PBS-fuktet bomull-tip applikatorer, trykk forsiktig øret mot den selvklebende stripen.
- Bruke stripen som en guide, ta musen øretgjennom spalten og samtidig justerer mus nærmere mot scenen.
- For å fjerne tape, først legge en dråpe PBS å redusere klebrighet båndet.
- Separer musen øret fra maskeringstape så skånsomt som mulig med en fin pensel.
- Flate øre mot øret plattform av bølgende en fuktig bomulls-tip applikator over øret.
- Sett en dråpe PBS under dekkglass (som holdes på plass på dekkholderen med fett, figur 2) og forsiktig plassere den over øret. Fyll opp med mer PBS om nødvendig.
Merk: dekkglass holder øker stabilitet under bildebehandling. - Sett rektal temperaturføler og ledningene kobles til varmesystemet i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: Sett temperaturen i kroppen varmeputen til 37 ° C og øret scenen plattformen til 35 ° C.
7. multiphoton mikroskop Setopp og Imaging Parametere
Merk: Denne protokollen bruker en enkelt bjelke, multiphoton mikroskop med en fleksibel (680 - 1080 nm) Ti: Sa laser (3,3 W ved 800 nm, pulslengde på 140 fs; 80 MHz repetisjon rate) med en 20X vann objektiv (NA = 1.0) for intra imaging studier.
- Åpne bildebehandlingsprogrammer.
- Juster laser i henhold til produsentens instruksjoner.
- Juster eksitasjonsbølgelengde på 950 nm.
Merk: GFP og Evans blått kan være samtidig spent på 950 nm. - Å forhåndsvisning, kan du bruke følgende innstillinger: 500 mikrometer 2 scanfield, 505 x 505 pikslers oppløsning, og en skanning frekvens på 800 Hz i en enkelt linje skanning. Klikk "Preview".
- Veksle attenuator (laser) makt. Sørg for at alle viktige signaler blir plukket opp uten å utsette på bildefeltet til store mengder laser makt, som kan forårsake varmeskader.
Merk: Start med en lav attenuator strøm og øke dersom signal er svak. Som nøytrofiler vil være fraværende fra interstitium ved tidlige tidspunkter etter reperfusjon, kan makrofager anvendes som en måler for å bestemme den minimale kraft som er nødvendig, da de førstnevnte er svakere enn neutrofiler.
Merk: Hvis dette trinnet skal gjøres for første gang, må du justere innstillingene i den ikke-iskemisk sone, hvor intakt vaskulær integritet er forventet og vil legge til rette innstillingen av demperen makt. I etterfølgende eksperimenter, disse innstillingene ikke krever mye modifikasjon mindre laser makt er ustabil. - Juster PMT innstillingene.
Merk: Sjekk med produsenten for maksimal optimal gevinst spenning for PMT. Innstilling av PMT spenningen utover det anbefalte terskelen vil resultere i et høyere signal-til-støy-forhold. Den generelle anbefalingen er å sette PMT forsterkningen spenning til den anbefalte terskel og for å øke attenuator kraft som er nødvendig må signalet være for svak. - Velge en avbildning region som er i nærhetenkanten av iskemi, karakterisert ved massiv Evans blå lekkasje.
- Samle GFP og Evans blå signaler ved hjelp 525/50 båndpass (BP) og 655/40 BP filtre, henholdsvis. For andre signaler harmonisk generasjon (SHG) av kollagenfibre innenfor dermal rommet, kan du bruke en 475/42 BP filter.
- Lag en mappe for å lagre bildene i et format som er kompatibelt for de tilgjengelige bildeanalyse programvare.
- Å tilegne seg, bruke følgende innstillinger: 500 mikrometer 2 scanfield, 505 x 505 pikslers oppløsning, og en skanning frekvens 400 Hz i en enkelt linje skanning.
- En 100-um z-stabel med en trinnstørrelse på 4 um kan skaffes gjentatte ganger over tid, ved 1 minutts intervaller, for å overvåke nøytrofil infiltrasjon.
Merk: Spesielt for leukocytter (f.eks nøytrofiler) med en høyere vandrende hastighet, et intervall som er lengre enn 1 min kan føre til problemer under celle sporing analyse. I dette tilfelle kan brukeren enten redusere tykkelsen av actakelse stable eller øke frekvensen.
Merk: Når den nødvendige anskaffelse stabelen av den ischemiske sonen kan være mindre som et resultat av kompresjons (alternativt kjennetegnet ved en høyere SHG intensitet), vil påfølgende reperfusjon resultere i massiv inflammasjon som fører til at øret til å svelle. Vesentlige driver i Z-retningen er forventet. Som sådan, er oppkjøpet av et stort z-stack er nødvendig for å få plass til drift. - Gjennom bildebehandling, fylle opp PBS og vann regelmessig for å holde øret fuktig og objektiv nedsenket i vann.
Merk: En typisk eksperiment varer vanligvis 2-4 timer. Avhengig av eksperimentell design, og kombinert med en godt kontrollert anestesi regime, å utvide varigheten av bilde er mulig.
8. Avslutte Experiment
- Avlive musen ved karbondioksid kvelning i henhold til institusjonens Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) procedures.
Merk: avlive alltid musen ved godkjente metoder som bestemmes av institusjonens regler, forskrifter og retningslinjer. Hvis gjentatt bildebehandling er nødvendig, holde musen på varmeputen før anestesi slites av. Når musen har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet og er mobile, tilbake musen til buret sitt.
9. Bildeanalyse
Merk: Data som genereres fra bildebehandlings eksperimentet kan visualiseres ved forskjellige programvarepakker.
- Åpne bildeanalyse programvare.
- Under overgå Mode, importere filen (Open → velge hvilken som helst fil i ønsket mappe → Klikk "Åpne").
- Rediger pseudo farger hvis standardfargene ikke gjelder (Rediger → Display justering → Under fanen kanal, velger du ønsket farge fra fargepaletten).
- Juster lysstyrke, kontrast og bakgrunn (Rediger → Skjerm Justering → Toggle maks- og minverdier). Kontroller at filen dimensjonene er korrekte (Rediger → Bildeegenskaper → Under fanen geometri, sjekk voxel størrelse. I denne protokollen, X = 0,99, Y = 0,99, og Z = 4).
Merk: Utled X og Y ved å dele scanfield dimensjon ved pikslers oppløsning. Z er tykkelsen mellom hver skive.
Merk: Utgangen av disse datasettene kan bli presentert som maksimal projeksjon filmer.
Merk: Det kreves Sporing analyse for å fullt karakterisere cellulære aktiviteter og interaksjoner for å forstå deres funksjon in vivo. Detaljerte instruksjoner for celle sporing ved hjelp av spot funksjonen tilgjengelig i programvaren kan bli funnet i protokollen i referanse 15.
Merk: Det er mange måter å kvantifisere levkocyttmigrasjonen, detaljer som kan bli funnet i artikkel i Reference 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen bruker en spesialbygd ear hud bildeplattform, slik som vist i figur 1. Flere funksjoner i denne plattformen er spesielt designet for å forenkle bildebehandling og samtidig opprettholde fysiologiske innstillinger. Plassering av øret på den oppvarmede messing plattformen ikke bare opprettholder øret på en fysiologisk temperatur på 35 ° C, men det isolerer også øret fra uunngåelige bevegelser på grunn av puste. Tilsetningen av et metallklips på messing plattformen danner et gap for å hindre at dekkholderen fra å utøve vekt på øret, for derved å opprettholde uavbrutt blodstrøm. Scenen plattformen er også designet for å huse en varmepute som vil opprettholde musen ved 37 ° C i hele bilde prosedyren.
Dekkholderen (figur 2) er utformet slik at dekkglass som skal festes på metallholderen ved hjelp av vakuum flotse. Dekkglass holderen er forbundet med et stativ som gir mulighet for fleksibel tilpasning i de vertikale og horisontale akser ved hjelp av adapteren. På denne måten kan brukeren først nøyaktig justere plasseringen av dekkglass over øret og deretter fikse den posisjonen ved å stramme skruene på adapteren.
I denne protokoll har vi beskrevet bruken av magneter for å simulere iskemi og reperfusjon. Figur 3b viser representative utsikt over ørene før og umiddelbart etter iskemi. Under fysiologiske betingelser, kan store blodkar bli visualisert makroskopisk. Den klemming virkning av magnetene stammer midlertidig blodstrømmen, noe som kan observeres ved en forbigående blanche effekt (sort pil) når magnetene er fjernet.
I denne spesielle demonstrasjonen blir fokusert avbildning på kanten av den ischemiske sonen (figur 3c (Figur 3d). Dette skaper viktige landemerker for intra imaging studier og bidrar til å opprettholde konsistens mellom uavhengige forsøk.
Dataene viser at i respons til en IR fornærmelse, infiltrere nøytrofile avkjøring inn interstitium fra intakte blodkar fôr kanten av iskemisk sonen og migrere mot skadestedet (Figur 3d og Movie 1). Vi forventer en forsinket reaksjon av nøytrofile migrere inn i interstitium i forhold til andre betennelser modeller på grunn av mangel av levedyktige perfusert blodkar på tidligere tidspunkter etter reperfusjon. For å få fullt karakterisere disse celleUlar aktiviteter, kan celle sporing analyse brukes for å forstå deres funksjon in vivo. Speed, mener fortrengning, og kjemotaktisk indeksen er noen av de potensielle lese-outs som kan oppnås fra cellen sporing analyse.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av en skreddersydd Ear Skin Stage for intra multiphoton Imaging. (a) ovenfra øret bildebehandling scenen med sine dimensjoner. (b) forfra og dimensjoner. Legg merke til at messingplate er tykkere på sidene, for å gi stabilitet til plattformen, og tynnere på midten, for å minimere kontaktarealet med huden, noe som sikrer uavbrutt blodstrøm når øret er brettet over kanten av slissen og hvilte på plattformen. (c) fra siden av den buede holderen at pinnene ned tilbakekoblingssonden. Varmeputen kan værefast på plattformen ved hjelp av maskeringstape (ikke vist). Modifisert fra Li et al., Nat Protoc 2012 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Design av dekk Holder; Side og ovenfra. Dekkglass holderen holder dekkglass i en fast stilling og dermed reduserer z-drift. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. IR-modell. (A) Skjematisk diagram som viser plasseringen av magnetene. (B) (C) Skjematisk av øret som viser regionen avbildes med hensyn til hvor magneten hadde blitt plassert. (D) Maksimal intensitet z anslått snapshots fra en time-lapse sekvens som viser nøytrofile infiltrasjon post-reperfusjon i et LysM-EGFP mus. Tiden som er brukt i hh: mm format. Scale Bar: 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Movie 1. nøytrofile Rekruttering i IR Injury. En time-lapse sekvens av maksimal projeksjon viser nøytrofile (grønn) infiltrasjon i respons til reperfusjon i LysM-EGFP albino mus øret huden etter 1,5 timer med iskemi. På tidligere tidspunkter, den manglendeEvans blue signal (rød) indikerer midlertidig kar okklusjon etter iskemi. Kollagen (blå, andre harmoniske generasjon). Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydning
IR er en av de viktigste årsakene til hud trykksår. De tidlige stadier (I og II) av trykksår beskrive tilstanden av den menneskelige hud (i forhold til de underliggende subkutane vev og muskler). Imidlertid er en forståelse av den immunologiske etiologi fortsatt mangler. Her presenterer vi en enkel og robust IR-modellen på mus øret huden for å løse dette gapet. Vi simulerer iskemi ved å klemme på musen øret mellom to magneter og senere studere nedstrøms immunresponser etter magnet fjerning (reperfusjon). Ved hjelp av magneter til å generere et konstant press på hvert øre for et bestemt tidsrom, å indusere ischemi, er vi i stand til å sikre reproduserbarhet og konsistens mellom eksperimenter.
Styrken av denne ikke-invasiv IR modell ligger også i sin evne til å vise, i sann tid, in vivo immunresponser ved å benytte en veletablert modell for intravital imaging av øret huden, noe som gir bedre stabilitet under avbildning i forhold til huden flanke prosedyren. Noen av dagens huden flanke modeller involvere kirurgiske prosedyrer som kan endre immun landskapet i huden 4. I tillegg bildebehandling huden flanke selv presenterer en teknisk utfordring, som respiratoriske bevegelser kan bidra til bevegelsesrelaterte gjenstander under bildebehandling 5,6. Vår nåværende modell omgår disse problemene.
I tillegg til å studere fysiologiske responser av immunceller til IR, kan denne modellen også være aktuelt å patofysiologiske innstillinger som diabetes mellitus, der diabetes kan forverre IR skade gjennom økt oksidativt stress. Forstå immunresponser vil bidra til en forståelse av sårheling.
kritiske Steps
Når musen er under narkose, er termoregulering svekket og kjernen kroppstemperaturen synker drastisk. For å hindre hypotHermia, er utvendig oppvarming nødvendig for å opprettholde den kjerne kroppstemperatur ved 37 ° C. Den øre, som ligger distalt til kroppen kjernen, er fysiologisk kjøler med 1 - 2 ° C og må holdes ved 35 ° C. Dette konsistens i oppvarming vil også sikre reproduserbare lese-outs av celle dynamikk. Samtidig skal varmesystemet kontrolleres for å sikre at musen ikke er over-oppvarming gjennom hele lengden av anestesi.
Bruken av albino mus (BALB / c og C57BL / 6-C 2J) for alle hud imaging studier er sterkt anbefalt å unngå pigment-indusert speckling skader. Hvis albino mus ikke er tilgjengelige, kan redusere laser makt under bildet oppkjøpet lindre problemet for pigmenterte mus. Imidlertid kan ytterligere optimalisering være nødvendig, som en redusert dybde av vev gjennomtrengning kan resultere i et dårligere resultat anskaffelse.
Øret huden er veldig delikat; følgelig må man sørge for å unngå forhold somkan forårsake betennelse. Eksempler på uriktig teknikker inkluderer, men er ikke begrenset til, følgende: 1) forlater Hårfjerningskrem på for en overdreven mengde tid over det som er anbefalt; 2) å legge for stort friksjon på øret når bringe øret gjennom spalten i øret bildebehandling plattform eller når løsne øre fra maskeringstapen; og 3) overoppvarming øret, enten på grunn av en defekt varmesystem eller en feilplassert temperaturtilbake sonde som kan være opptak omgivelsestemperatur i stedet for musen kjernetemperatur.
Modifikasjoner og feilsøking
Mesteparten av feilsøking knyttet til øret forberedelse prosedyren er tidligere oppført åtte. Dersom øret avbildes på et senere tidspunkt etter reperfusjon, kan øret svelle ut over gapet 0,5 mm laget av metallklips for å få plass til tykkelsen av øret (figur 1). I dette scenariet, plassering av dekkglass over øretkan hindre blodstrømmen, som er tydelig når makroskopisk synlige blodkar forsvinner ut av syne. Dette må unngås ved å skape et større gap mellom dekkglass holderen og messing plattformen. Dette kan gjøres på to måter, enten ved manuelt å justere høyden av dekkholderen (figur 2) eller ved å bruke en tykkere metallklips.
Begrensninger av teknikken
I denne protokollen, brukte vi Evans blue for å bestemme plasseringen av den ischemiske sonen, ettersom lekkasje av Evans blått i interstitium markerer grensen av den ischemiske sonen ved tidlige tidspunkter etter iskemi. Evans Blue blir ofte brukt som et blodkar merkemiddel. Men under betennelsestilstander, vaskulær integritet er alvorlig kompromittert. Dette resulterer i lekkasje av Evans blå i interstitium. I denne modellen, ser vi et drastisk tap av kontrast mellom blodkar og interstitium snart etter reperfusjon. Som sådan, i studies hvor leukocytter-endothelial interaksjoner er involvert, anbefaler vi å eksperimentere med andre blodkar merking agenter i forskjellige størrelser (f.eks dekstraner, osv.).
fremtidige Applications
I tillegg til å utnytte den LysM-EGFP mus for å demonstrere hvordan nøytrofiler svare på hud IR, kan denne modellen også brukes til å studere andre responser, både når det infiltrerende (monocytter) og i hørende interstitielle (makrofager) leukocytter. Denne modellen kan også bli utvidet til andre studier som undersøker blod og lymfatiske integritet, samt leukocytter-endothelial interaksjoner etter en IR skade. Kombinert med muligheten for å visualisere kollagen som SHG signaler gjennom MP-IVM, ville det også være interessant å overvåke kollagen integritet etter IR- eller under sårheling. I sammendraget, har vi satt opp en ikke-invasiv, robust modell av IR for intra bildebehandling for å studere immunresponser hos mus øret huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J.
