Summary
Questo protocollo descrive l'induzione di un modello di ischemia-riperfusione (IR) sulla pelle orecchio mouse utilizzando magnete di bloccaggio. Utilizzando un modello di imaging intravitale custom-built, studiamo in vivo risposte infiammatorie post-riperfusione. La logica alla base dello sviluppo di questa tecnica è quello di estendere la comprensione di come leucociti rispondono al danno IR pelle.
Introduction
danno da ischemia-riperfusione (IRI) si verifica quando vi è una ipossia transitoria causa l'ostruzione del flusso sanguigno (ischemia) seguita da una successiva riossigenazione dei tessuti (riperfusione). Nella pelle, ischemia-riperfusione (IR) è pensato per essere uno dei fattori che contribuiscono alla fisiopatologia delle ulcere da pressione, dove prolungato riposo a letto predispone i pazienti in ospedale a lungo termine per infortunio. In questi pazienti, sia la pelle ed i muscoli sottostanti sono costantemente esposti alla pressione del peso esercitato sulle aree di prominenza ossea, con conseguente lesioni localizzate che, se non trattata, può diventare necrotico 1.
I danni coinvolte in un IRI sono duplici. Durante l'ischemia, l'occlusione di vasi sanguigni porta ad un drastico calo di apporto di ossigeno ai tessuti. Ciò si traduce in una diminuzione di ATP e di pH, che inattiva ATPasi coinvolti nel metabolismo cellulare. A loro volta, i livelli di calcio cellulari picco, e ha sottolineato oc danneggiatiells apoptosi o necrosi 2. Il rilascio di contenuti intracellulari o danni associati modelli molecolari (grezzo), come HMGB1, contribuisce alla risposta infiammatoria 3. Il secondo insulto si verifica durante la riperfusione. Anche se i livelli di ossigeno e pH vengono ripristinati durante la riperfusione, ciò comporta la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che porta alla ossidazione dei lipidi intracellulari, DNA e proteine. Di conseguenza, i mediatori pro-infiammatori sono attivati, che scatena una risposta infiammatoria secondaria che prevede il reclutamento di cellule immunitarie al sito infiammatorio 2. Mentre la cascata di eventi biochimici che portano alla risposta infiammatoria è stata ben descritta, la regolazione spaziale e temporale delle attività delle cellule immunitarie non sono ben compresi.
Qui, descriviamo un modello IR robusta sulla pelle orecchio del mouse utilizzando semplici bloccaggio magnete. Accoppiato con l'imaging intravitale multiphoton (MP-IVM), abbiamostabilito un modello per studiare le risposte infiammatorie in vivo che si verificano dopo riperfusione avviene. La logica dietro lo sviluppo e l'utilizzo di questa tecnica è quello di cercare di capire come sia cellule interstiziali e infiltranti rispondono a infrarossi in tempo reale.
Modelli esistenti di IR utilizzando la tecnica di serraggio sul fianco pelle sono altamente invasiva, in quanto richiedono l'impianto chirurgico di piastre di acciaio a fianco pelle, rendendoli meno che ideale per studi immunologici 4. Una tecnica di fissaggio non invasiva simile è stato descritto nel 5,6 topo pelle fianco. Tuttavia, a causa della incorporazione della componente di imaging intravitale in questo metodo, abbiamo invece scelto la pelle dell'orecchio come sito IR mirato, come elude movimenti dovuti alla respirazione e offre stabilità durante l'imaging 7,8. Inoltre, sottoinsiemi leucociti che abbracciano l'interstizio sono identici tra la pelle orecchio e il fianco pelle, anche se lanumeri e proporzioni possono variare leggermente 9. Così, la pelle dell'orecchio rappresenta un sito di imaging ideale.
Inoltre, la maggior parte dei dati recuperati da questi modelli IRI sono limitati a valutazioni macroscopici (classificazione delle ulcere) e le analisi microscopiche di endpoint indicatori infiammatori 10. Utilizzando questo modello, visualizzazione in tempo reale della risposta cellulare dei neutrofili dopo riperfusione nella pelle di un topo reporter fluorescente è abilitato. Un modello di imaging intravitale orecchio precedentemente pubblicato viene utilizzato 8 con ulteriori modifiche (figure 1, 2).
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Protocol
Tutti gli esperimenti che si occupano di animali vivi sono stati condotti in conformità a tutte le uso animale pertinente e linee guida e regolamenti per la cura.
1. Scelta di topi reporter fluorescente
- Utilizzare da 6 a 12 settimane di età LysM-eGFP 11 topi (senza preferenza per maschi o femmine).
Nota: L'uso di vari topi reporter fluorescente specifiche delle celle consente la visualizzazione di diverse cellule immunitarie in vivo. In questo ceppo, neutrofili (cellule GFP HI) circolanti, monociti (cellule GFP LO) e macrofagi dermici (cellule GFP LO) circolanti possono essere visualizzati. Con i parametri di imaging utilizzati, verranno rilevati solo i segnali luminosi da neutrofili GFP-positive.
Nota: un elenco di ceppi fluorescente reporter di topo specifico per cellule immunitarie adatte per questo tipo di studio di imaging pelle può essere trovato in riferimento 8.
Nota: E 'altamente raccomandato che i topi albini essere utilizzato per l'imaging, come pigmentopi ted sono più inclini a fotodanneggiamento. Questo è perché la pelle dell'orecchio pigmentata è molto più sensibile alla pezzatura indotta da laser (indicativa della combustione del tessuto). Come risultato, il reclutamento di neutrofili e accumulo possono essere osservati anche durante lo stato stazionario 8,12. - Mantenere i topi in specifici (SPF) condizioni esenti da organismi patogeni con cicli di luce-buio di 12 h.
2. mouse Anestesia
- Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina-xylazina (8 microlitri g -1 di peso corporeo), composto da una miscela di 15 mg mL -1 ketamina e 1 mg mL -1 xilazina disciolto in acqua sterile.
- Posizionare il mouse su una piastra elettrica per mantenere la sua temperatura corporea a 37 ° C durante tutta la procedura di preparazione. Verificare la presenza di anestesia sufficienti osservando l'assenza di un riflesso punta pizzico.
Nota: Dopo la prima ora, dosi successive quarti di anestetico dovranno essere somministrato per via sottocutanea unad avrà una durata di circa 0,5 ore ciascuna. La contrazione di baffi o la coda può anche indicare che l'anestesia indossa fuori e che è necessario un top-up. - Utilizzare lubrificante oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
3. Depilazione
- Applicare con attenzione crema depilatoria per i due terzi superiori del padiglione auricolare dorsale del mouse utilizzando applicatori di cotone-punta.
- Attendere 2 - 3 minuti prima di togliere la crema utilizzando bagnato applicatori di cotone punta in maniera approfondita ma gentile.
Nota: Non permettere crema depilatoria per rimanere sull'orecchio del mouse per troppo tempo, in quanto potrebbe indurre l'infiammazione 13,14.
4. L'induzione di ischemia e riperfusione
- Utilizzare dorati, N42-grade magneti al neodimio spessi, diametro di 12 mm x 2 mm, e con un rating Gauss di circa 3.000 per indurre ischemia nella pelle dell'orecchio mouse.
Nota: In questo caso, la faccia fossette dei magneti Denotes suo polo nord. - Slot i magneti nelle loro singole guide in plastica.
Nota: La guida di plastica serve per facilitare il posizionamento e la separazione dei magneti ad alta resistenza. Grazie alla loro forza magnetica ancora bassa resistenza alla rottura, non posizionare singoli magneti in stretta vicinanza l'uno all'altro o altri metalli. Rottura e frammentazione può verificarsi se la tirano verso l'altro. - Posizionare la prima (dorsale) magnete tale che solo il bordo è a contatto con il secondo (ventrale) magnete (Figura 3a)
Nota: Questo impedisce i magneti da scattare insieme prima che siano stati posizionati correttamente. - Posizionare entrambi i magneti in modo tale che il magnete ventrale adagiata su un orecchio (Figura 3a).
Nota: Prima di ischemia è indotto, assicurarsi che il mouse viene mantenuta a 37 ° C e che l'anestesia sufficiente è mantenuta (vedi passo 2.2). - Una volta pronto, lasciate accuratamente i magneti si incontrano (Figura 3a Nota: Per scopi di imaging, morsetto solo la metà dell'orecchio in modo che si possono osservare un IR e non IR regione.
- Dopo 1,5 h di ischemia, rimuovere i magneti ruotando i magneti distanti utilizzando le guide di plastica, permettendo riperfusione avvenire.
Nota: Si deve prestare attenzione per evitare che le orecchie formazione di pieghe quando i magneti sono posti. Ischemia incompleta è evidente se i vasi sanguigni principali macroscopicamente visibili ri-nei profumi immediatamente (cioè, il sangue riempie i vasi immediatamente) dopo i magneti sono stati rimossi. Sebbene riperfusione non avviene immediatamente dopo la rimozione di magneti, occlusione del vaso sanguigno è solo transitoria. Come tale, è indispensabile per preparare l'orecchio del mouse per l'imaging più rapidamente possibile.
5. L'iniezione di Vaso sanguigno Etichettatura Agents
- Subito dopo la rimozione del magnete, somministrare per via endovenosa (via retro-orbitale o iniezione vena della coda) blu Evans (10 mg mL -1in PBS o soluzione fisiologica; 1 ml g -1 di peso corporeo) o un altro agente etichettatura dei vasi sanguigni di scelta.
Nota: Prima dell'iniezione, assicurarsi che l'anestesia sufficiente è ancora mantenuto effettuando dolce pizzicare punta.
6. Il posizionamento del orecchio sulla piattaforma di imaging
- Tagliare 2 pezzi di nastro adesivo 1,5 cm di lunghezza e 1,8 cm di larghezza.
- Lasciare le parti adesive per stare insieme pur lasciando circa 1 mm di adesivo lungo la sua larghezza.
- Tagliare il nastro adesivo in due, longitudinalmente, per accogliere il suo posizionamento all'interno della fessura sulla piattaforma orecchio.
- Inserire il nastro adesivo a metà attraverso la fessura, in modo che il lato adesivo rivolto verso l'alto.
- Posizionare il mouse sul tappetino di riscaldamento, in modo tale che l'orecchio per essere ripreso è vicino alla striscia di nastro adesivo.
- Utilizzando due PBS-inumidite applicatori di cotone punta, premere delicatamente l'orecchio contro la striscia adesiva.
- Utilizzando la striscia come una guida, portare l'orecchio del mouseattraverso la fenditura e contemporaneamente regolare il mouse più stretta verso il palco.
- Per rimuovere il nastro adesivo, prima aggiungere una goccia di PBS per ridurre l'adesività del nastro.
- Separare l'orecchio mouse dal nastro adesivo il più delicatamente possibile utilizzare un pennello fine.
- Appiattire l'orecchio contro la piattaforma orecchio da dolci un umido applicatore di cotone-punta sopra l'orecchio.
- Mettere una goccia di PBS sotto il coprioggetto (che è tenuta in posizione sul supporto coprioggetto con grasso; figura 2) e delicatamente posizionarlo sopra l'orecchio. Top con più PBS, se necessario.
Nota: Il supporto coprioggetto aumenta la stabilità durante l'imaging. - Inserire la sonda temperatura rettale e collegare i fili al sistema di riscaldamento in base alle istruzioni del produttore.
Nota: impostare la temperatura della piastrina riscaldamento del corpo a 37 ° C e la piattaforma fase orecchio a 35 ° C.
7. Multiphoton Microscopio Sete imaging Parametri
Nota: Questo protocollo utilizza un singolo fascio, multiphoton microscopio con un sintonizzabile (680 - 1.080 nm) laser Ti: Sa (3,3 W a 800 nm; lunghezza di impulso di 140 fs; 80 MHz frequenza di ripetizione) con un obiettivo 20X acqua (NA = 1.0) per studi di imaging intravitale.
- Aprire il software di imaging.
- Allineare il laser secondo le istruzioni del produttore.
- Regolare la lunghezza d'onda di eccitazione di 950 nm.
Nota: GFP e blu Evans può essere contemporaneamente eccitati a 950 nm. - Per anteprima, utilizzare le seguenti impostazioni: 500 micron 2 scanfield, risoluzione 505 x 505 pixel, e una frequenza di scansione di 800 Hz in una singola scansione di linea. Fai clic su "Anteprima".
- Alterna l'attenuatore (laser) di potenza. Assicurarsi che tutti i segnali necessari vengono prelevati senza esporre il campo di imaging a quantità eccessive di potenza del laser, che possono indurre danni dovuti al calore.
Nota: Iniziare a bassa potenza attenuatore e aumentare se la signal è scarsa. Come neutrofili saranno assenti dalla interstizio in fase precoce rileva post-riperfusione, macrofagi possono essere utilizzati come un misuratore per determinare la potenza minima necessaria, in quanto i primi sono dimmer di neutrofili.
Nota: Se questa fase deve essere fatto per la prima volta, regolare le impostazioni nella zona non-ischemica, in cui si prevede l'integrità vascolare intatto e faciliterà l'impostazione della potenza attenuatore. In esperimenti successivi, queste impostazioni non richiedono modifiche molto meno che la potenza del laser è instabile. - Regolare le impostazioni PMT.
Nota: Verificare con il produttore per la massima tensione di guadagno ottimale per la PMT. Impostazione della tensione PMT oltre la soglia raccomandata si tradurrà in un più alto rapporto segnale-rumore. La raccomandazione generale è di impostare il guadagno di tensione PMT alla soglia raccomandata e di aumentare la potenza attenuatore necessaria se il segnale è troppo debole. - Selezionare una regione di imaging che è in prossimità diil bordo della ischemia, caratterizzata da una massiccia fuoriuscita blu Evans.
- Raccogliere GFP e Evans segnali blu utilizzando 525/50 passa-banda (BP) e 655/40 filtri BP, rispettivamente. Per generazione di seconda armonica (SHG) segnali di fibre di collagene all'interno del compartimento dermico, utilizzare un filtro di BP 475/42.
- Creare una cartella in cui salvare le immagini in un formato compatibile per il software di analisi delle immagini disponibili.
- Per acquisire, utilizzare le seguenti impostazioni: 500 micron 2 scanfield, risoluzione 505 x 505 pixel, e una scansione di frequenza 400 Hz in una singola scansione di linea.
- Un 100-micron z-stack con un passo di 4 micron può essere acquisita più volte nel corso del tempo, ad intervalli di 1 minuto, per il monitoraggio dei neutrofili infiltrazione.
Nota: Soprattutto per leucociti (ad esempio, neutrofili) con una velocità migratoria superiore, un intervallo che è più lungo di 1 min possono provocare difficoltà durante l'analisi di inseguimento cellulare. In questo caso, l'utente può ridurre lo spessore del acquisizione pila o aumentare la frequenza di scansione.
Nota: Mentre la pila acquisizione desiderata della zona ischemica può apparire più piccole a causa della compressione (alternativamente caratterizzato da un'intensità SHG superiore), la successiva riperfusione provocherà infiammazione massiccia che causa l'orecchio a gonfiarsi. Si prevede derive significativi nella direzione Z. Come tale, l'acquisizione di un gran z-stack è necessaria per accogliere la deriva. - Durante la formazione immagine, rabboccare il PBS e acqua regolarmente per mantenere l'orecchio umido e la lente obiettivo immerso in acqua.
Nota: un tipico esperimento di solito dura 2-4 ore. A seconda del disegno sperimentale, ed accoppiato con un regime di anestesia ben controllato, estendendo la durata di imaging è possibile.
8. Terminare l'esperimento
- Eutanasia il mouse da anidride carbonica per asfissia secondo l'dell'istituzione Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC) procedures.
Nota: eutanasia sempre il mouse con metodi approvati come determinato da norme, regolamenti e linee guida dell'istituzione. Se è necessario ripetere l'imaging, tenere il mouse sul tappetino di riscaldamento fino a quando l'anestesia svanisce. Una volta che il mouse ha ripreso conoscenza sufficiente ed è mobile, riportare il mouse per la sua gabbia.
Analisi 9. Immagine
Nota: I dati generati dal esperimento di imaging possono essere visualizzati da diversi pacchetti software.
- Aprire il software di analisi delle immagini.
- Sotto Surpass Mode, importare il file (Open → selezionare qualsiasi file nella cartella desiderata → Click "open").
- Modifica pseudo colori se i colori di default non si applicano (regolazione Modifica → Display → Sotto la scheda di canale, selezionare il colore desiderato dalla tavolozza dei colori).
- Regolare la luminosità, il contrasto, e lo sfondo (Modifica → Display Regolazione → Toggle valori max e min). Verificare che le dimensioni del file siano corretti (proprietà Modifica → Immagine → Nella scheda geometria, verificare la dimensione voxel. In questo protocollo, X = 0,99, Y = 0,99, e Z = 4).
Nota: Derive X e Y dividendo la dimensione scanfield dal pixel di risoluzione. Z è lo spessore tra ogni fetta.
Nota: L'uscita di questi insiemi di dati può essere presentato come film di proiezione massima.
Nota: l'analisi di monitoraggio è necessario per caratterizzare completamente le attività cellulari e interazioni al fine di comprendere la loro funzione in vivo. Istruzioni dettagliate di monitoraggio cella utilizzando la funzione di posto disponibili nel software possono essere trovati nel protocollo di riferimento 15.
Nota: Ci sono molti modi di migrazione dei leucociti quantificazione, i cui dettagli possono essere trovati nell'articolo revisione in riferimento 16.
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Representative Results
Questo protocollo utilizza una piattaforma di imaging pelle dell'orecchio su misura, come mostrato in Figura 1. Diverse caratteristiche di questa piattaforma sono progettati specificamente per facilitare l'imaging, pur mantenendo le impostazioni fisiologici. Posizionando l'orecchio sulla piattaforma ottone riscaldati non mantiene solo l'orecchio ad una temperatura fisiologica di 35 ° C, ma anche ad isolare l'orecchio da inevitabili movimenti dovuti alla respirazione. L'aggiunta di una clip metallica sulla piattaforma brass crea un vuoto di impedire al titolare coprioggetto da esercitare peso sull'orecchio, mantenendo così il flusso di sangue ininterrotto. La piattaforma di fase è inoltre progettato per ospitare una piastra elettrica che manterrà il mouse a 37 ° C durante tutta la procedura di imaging.
Il titolare coprioggetto (Figura 2) è progettato per consentire il coprioggetto da fissare sul supporto metallico con l'aiuto di grea vuotoSE. Il titolare coprioggetto è collegato ad un supporto che permette di adattamento flessibile negli assi verticali ed orizzontali con l'aiuto dell'adattatore. In questo modo, l'utente può regolare prima con precisione la posizione del vetrino sopra l'orecchio e successivamente fissare tale posizione serrando le viti dell'adattatore.
In questo protocollo, abbiamo descritto l'uso di magneti per simulare ischemia e riperfusione. Figura 3b mostra viste rappresentativi delle orecchie prima e subito dopo l'ischemia. In condizioni fisiologiche, grandi vasi sanguigni possono essere visualizzati macroscopicamente. L'effetto pizzicamento dei magneti steli temporaneamente il flusso di sangue, che può essere osservata da un effetto pallore transitorio (freccia nera) quando si rimuovono i magneti.
In questa particolare manifestazione, imaging è focalizzata sul bordo della zona ischemica (Figura 3c (Figura 3d). Questo crea importanti punti di riferimento per gli studi di imaging intravitale e aiuta a mantenere la coerenza tra esperimenti indipendenti.
I dati mostrano che, in risposta ad un insulto IR, infiltrandosi neutrofili uscita nell'interstizio dai vasi sanguigni intatti allineando ai margini della zona ischemica e migrare verso il luogo di ferita (Figura 3d e film 1). Ci aspettiamo una risposta ritardata di neutrofili migrano nell'interstizio rispetto ad altri modelli di infiammazione a causa della mancanza di valide perfusione vasi sanguigni in precedenti momenti post-riperfusione. Per caratterizzare completamente queste celluleattività Ular, analisi inseguimento cellule possono essere impiegati per capire la loro funzione in vivo. Velocità, media cilindrata, e l'indice chemiotattico sono alcuni dei potenziali read-out che possono essere ottenuti dall'analisi delle cellule di monitoraggio.
Figura 1. Schema di uno Stage orecchio pelle su misura per intravitale Multiphoton Imaging. (a) Vista dall'alto del palco di imaging orecchio con le sue dimensioni. (b) Vista frontale e dimensioni. Si noti che la piastra di ottone è più spessa ai lati, al fine di fornire stabilità alla piattaforma, e più sottile al centro, per ridurre al minimo l'area di contatto con la pelle, garantendo il flusso di sangue continuo quando l'orecchio è piegato sopra il bordo della fessura e riposato sulla piattaforma. Vista (c) laterale del supporto curvo che pin giù la sonda di retroazione. Il rilievo di riscaldamento può esserefissato sulla piattaforma usando nastro adesivo (non mostrato). Modificato da Li et al., Nat ProtoC 2012 8. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Progettazione del titolare Coverslip; Side e Top View. Il titolare coprioggetto detiene il vetrino in una posizione fissa, riducendo così Z-drift. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Il Modello IR. (A) diagramma schematico che mostra il posizionamento dei magneti. (B) (C) Schema dell'orecchio che mostra la regione ripreso rispetto a dove era stato posto il magnete. (D) Intensità massima di z-proiezioni istantanee da una sequenza di time-lapse che mostra neutrofili infiltrazione post-riperfusione in un mouse LysM-eGFP. Il tempo trascorso mostrato in formato hh: mm. Scala Bar: 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film 1. neutrofili Carriera nel IR Injury. Una sequenza time-lapse di massima sporgenza che mostra neutrofili (verde) infiltrazione in risposta alla riperfusione in LysM-eGFP topo albino pelle dell'orecchio dopo 1,5 ore di ischemia. In punti temporali precedenti, la mancanza diEvans segnale blu (rosso) indica l'occlusione nave temporanea dopo l'ischemia. Collagene (blu, generazione di seconda armonica). Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Importanza
IR è una delle principali cause di ulcere da pressione pelle. Le fasi (I e II) di ulcere da pressione descrivono la condizione della pelle umana (rispetto ai tessuti sottocutanei sottostanti e muscoli). Tuttavia, una comprensione della eziologia immunologica è ancora carente. Qui, vi presentiamo un modello IR semplice e robusto sulla pelle orecchio mouse per colmare questa lacuna. Simuliamo ischemia fissando l'orecchio mouse tra due magneti e successivamente studiare le risposte immunitarie a valle dopo la rimozione del magnete (riperfusione). Utilizzando i magneti per generare una pressione costante su ogni orecchio per un determinato periodo di tempo, inducendo ischemia, siamo in grado di garantire la riproducibilità e la coerenza tra gli esperimenti.
La forza di questo modello IR non invasiva sta anche nella sua capacità di dimostrare, in tempo reale, in vivo risposte immunitarie utilizzando un modello ben consolidata di imagin intravitaleg della pelle dell'orecchio, che offre maggiore stabilità durante l'imaging rispetto alla procedura fianco pelle. Alcuni dei modelli fianco pelle correnti coinvolgono procedure chirurgiche che possono alterare il paesaggio immunitario della pelle 4. Inoltre, l'imaging la pelle del fianco si presenta una sfida tecnica, come i movimenti respiratori possono contribuire ad artefatti da movimento legati durante l'imaging 5,6. Il nostro attuale modello elude questi problemi.
Oltre a studiare le risposte fisiologiche delle cellule immunitarie di IR, questo modello può essere applicata anche alle impostazioni patofisiologici come il diabete mellito, in cui il diabete può peggiorare lesioni IR attraverso un aumento dello stress ossidativo. La comprensione delle risposte immunitarie contribuirà a una comprensione di guarigione delle ferite.
fasi critiche
Una volta che il mouse è sotto anestesia, termoregolazione è compromessa e la temperatura corporea scende drasticamente. Per evitare hypotErmia, riscaldamento esterno è essenziale per mantenere la temperatura interna del corpo a 37 ° C. L'orecchio, situato distalmente al nucleo del corpo, è fisiologicamente cooler da 1 - 2 ° C e deve essere mantenuta a 35 ° C. Tale coerenza nel riscaldamento garantirà inoltre la riproducibilità letture dei dinamiche cellulari. Allo stesso tempo, il sistema di riscaldamento deve essere controllato per assicurare che il mouse non è surriscaldamento per tutta la lunghezza di anestesia.
L'uso di topi albini (BALB / ce C57BL / 6-C 2J) per tutti gli studi di imaging pelle è altamente consigliato per evitare lesioni screziature pigmento-indotta. Se topi albini non sono disponibili, diminuendo la potenza del laser durante l'acquisizione dell'immagine può alleviare il problema per topi pigmentati. Tuttavia, un'ulteriore ottimizzazione può essere necessaria, come una ridotta profondità di penetrazione nel tessuto può causare un esito acquisizione poveri.
La pelle orecchio è molto delicata; di conseguenza, è necessario prestare attenzione al fine di evitare qualsiasi circostanza chepuò causare l'infiammazione. Esempi di tecniche improprie includono, ma non sono limitati a, i seguenti: 1) lasciando la crema depilatoria avanti per una quantità eccessiva di tempo nel quanto raccomandato; 2) l'applicazione di eccessivo attrito sull'orecchio quando portando l'orecchio attraverso la fessura della piattaforma di imaging orecchio o quando staccare l'orecchio dal nastro adesivo; e 3) surriscaldamento l'orecchio, sia a causa di un sistema di riscaldamento difettosa oppure una sonda di retroazione di temperatura fuori luogo eventualmente registrando temperatura ambiente posto della temperatura al cuore del mouse.
Modifiche e risoluzione dei problemi
La maggior parte della risoluzione dei problemi riguardanti la procedura di preparazione orecchio è stato precedentemente elencati 8. Se l'orecchio è ripreso in un secondo punto di tempo di post-riperfusione, l'orecchio può gonfiarsi oltre il gap 0,5 mm creata dalla clip di metallo per accogliere lo spessore dell'orecchio (Figura 1). In questo scenario, il posizionamento del vetrino sopra l'orecchiopuò ostacolare il flusso di sangue, che è evidente quando i vasi sanguigni macroscopicamente visibili scompaiono dalla vista. Questo deve essere evitato creando un divario più ampio tra il titolare coprioggetto e la piattaforma di ottone. Questo può essere fatto in due modi, o regolando manualmente l'altezza del supporto coprioggetto (figura 2) o utilizzando una clip metallica spessa.
LIMITI DELLA TECNICA
In questo protocollo, abbiamo usato Evans blue per determinare la posizione della zona ischemica, poiché la perdita di blu Evans nell'interstizio segna il confine della zona ischemica in punti temporali primi post-ischemia. Evans blu è comunemente usato come agente di etichettatura vaso sanguigno. Tuttavia, in condizioni infiammatorie, integrità vascolare è gravemente compromessa. Ciò provoca la fuoriuscita di Evans blu nell'interstizio. In questo modello, si osserva una drastica perdita di contrasto tra i vasi sanguigni e interstizio subito dopo riperfusione. Come tale, in vudies in cui le interazioni leucociti-endotelio sono coinvolti, si consiglia di sperimentare con altri agenti di etichettatura dei vasi sanguigni di diverse dimensioni (ad esempio, destrani, ecc.).
Applicazioni future
Inoltre utilizzando il mouse LysM-eGFP per dimostrare come neutrofili rispondono IR pelle, questo modello può essere utilizzato anche per studiare altre risposte leucocitarie, sia in infiltranti (monociti) e in interstiziali residente (macrofagi) leucociti. Questo modello può essere esteso anche ad altri studi che esaminano sanguigna e linfatica integrità, nonché le interazioni leucociti-endotelio dopo un infortunio IR. Accoppiato con la capacità di visualizzare il collagene come segnali SHG attraverso MP-IVM, sarebbe anche interessante monitorare l'integrità di collagene dopo IR o durante la guarigione della ferita. In sintesi, abbiamo istituito un non-invasiva, robusto modello di IR per l'imaging intravitale al fine di studiare le risposte immunitarie della pelle orecchio del mouse.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
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