Summary
Este protocolo descreve a indução de um modelo de isquemia-reperfusão (IR) em pele de orelha de rato usando íman de fixação. Usando um modelo de imagens intravital custom-built, estudamos nas respostas inflamatórias in vivo pós-reperfusão. A lógica por trás do desenvolvimento desta técnica é ampliar a compreensão de como leucócitos responder a uma lesão IR pele.
Introduction
lesão de isquemia-reperfusão (IRI) ocorre quando há uma hipoxia transitória devido à obstrução do fluxo sanguíneo (isquemia), seguido por uma subsequente re-oxigenação dos tecidos (reperfusão). Na pele, isquemia-reperfusão (IR) é pensado para ser um dos fatores que contribuem para a fisiopatologia das úlceras de pressão, onde repouso prolongado predispõe os pacientes do hospital de longo prazo para a lesão. Nesses pacientes, a pele e os músculos subjacentes são constantemente expostos a pressão do peso exercido sobre áreas de proeminência óssea, resultando em lesões localizadas que, se não tratada, pode tornar-se necrótica 1.
Os danos envolvidos em um IRI são duas. Durante a isquemia, a oclusão de vasos sanguíneos conduz a uma redução drástica da entrega de oxigénio aos tecidos. Isto resulta numa diminuição de ATP e pH, que inactiva ATPases envolvidas no metabolismo celular. Por sua vez, os níveis de cálcio celular pico, e salientou ou danificado cells sofrem apoptose ou necrose 2. A liberação de conteúdo intracelular ou padrões moleculares danos associados (DAMP), como HMGB1, contribui para a resposta inflamatória 3. O segundo insulto ocorre durante a reperfusão. Embora os níveis de oxigénio e de pH são restaurados durante a reperfusão, isto resulta na geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS), o que leva à oxidação de lípidos intracelulares, DNA e proteínas. Por conseguinte, os mediadores pró-inflamatórios são activados, o que desencadeia uma resposta inflamatória secundária que envolve o recrutamento das células imunes para o local inflamatório 2. Enquanto a cascata de acontecimentos bioquímicos que conduzem à resposta inflamatória tem sido bem descrito, a regulação espacial e temporal das actividades celulares imunitárias não são bem compreendidos.
Aqui, descrevemos um modelo IR robusta na pele de orelha de rato usando simples aperto ímã. Juntamente com a imagem multiphoton intravital (MP-IVM), nósestabeleceu um modelo para estudar as respostas inflamatórias in vivo que ocorrem após a reperfusão ocorre. A lógica por trás do desenvolvimento e uso desta técnica é tentar entender como ambas as células intersticiais e infiltrando responder a IR em tempo real.
Modelos existentes de IR utilizando a técnica de fixação na lateral da pele são altamente invasivo, uma vez que exigem a implantação cirúrgica de placas de aço no flanco da pele, tornando-os menos do que o ideal para estudos imunológicos 4. Uma técnica de fixação não-invasiva semelhante foi descrito na pele do rato 5,6 flanco. No entanto, devido à incorporação da componente de imagem intravital neste método, que em vez escolheu a pele da orelha como o local de IR alvo, uma vez que contorna os movimentos devidos à respiração e oferece estabilidade durante a imagiologia de 7,8. Além disso, subconjuntos de leucócitos que se estendem por o interstício são idênticos entre a pele da orelha e o flanco da pele, embora onúmeros e proporções podem variar ligeiramente 9. Assim, a pele da orelha representa um local de imagem ideal.
Além disso, a maioria dos dados obtidos a partir destes modelos IRI são limitadas a avaliações macroscópicas (classificação de úlceras) e análises microscópicas de endpoint indicadores inflamatórios 10. Utilizando este modelo, a visualização em tempo real, da resposta celular de neutrófilos após a reperfusão na pele de um rato repórter fluorescente é activado. Um modelo de imagem da orelha intravital publicado anteriormente é utilizado 8 com modificações adicionais (Figuras 1, 2).
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Protocol
Todos os experimentos que lidam com animais vivos foram conduzidos de acordo com todo uso de animais relevantes e diretrizes e regulamentos de cuidados.
1. Escolha do Mice repórter fluorescentes
- Use de 6 a 12 semanas de idade LysM-eGFP 11 ratos (sem preferências para machos ou fêmeas).
Nota: O uso de vários ratinhos repórter fluorescente específico de células permite a visualização de diferentes células imunitárias in vivo. Nesta estirpe, os neutrófilos (células GFP hi) circulante, monócitos (células GFP LO), e os macrófagos dérmicos (células GFP LO) circulante pode ser visualizado. Com os parâmetros de imagiologia usado, apenas os sinais luminosos de neutrófilos GFP-positiva será detectado.
Nota: Uma lista de estirpes de rato fluorescente repórter-imune específica de células adequadas para este tipo de estudo de imagem da pele pode ser encontrado na referência 8.
Nota: É altamente recomendável que os ratos albino ser usado para geração de imagens, como pigmencamundongos ted são mais propensas a photodamage. Isto é porque a pele da orelha pigmentada é muito mais sensível a salpicar induzida por laser (indicativo de queima de tecido). Como resultado, o recrutamento dos neutrófilos e acumulação pode ser observado, mesmo durante o estado estacionário 8,12. - Mantenha os ratos (SPF) condições específicas isentos de agentes patogénicos com ciclos de luz-escuro de 12 h.
2. Rato Anestesia
- Anestesiar o rato com uma injecção intra-peritoneal de cetamina-xilazina (8 mL g -1 de peso corporal), composto por uma mistura de 15 mg mL -1 de cetamina e 1 mg mL -1 de xilazina dissolvido em água estéril.
- Colocar o rato sobre uma almofada de aquecimento para manter a sua temperatura do corpo a 37 ° C durante todo o procedimento de preparação. Verifique para anestesia suficientes observando a ausência de um reflexo toe pitada.
Nota: Após a primeira hora, as doses subsequentes trimestre de anestésico terá de ser administrado por via subcutânea umad terá a duração de aproximadamente 0,5 h cada um. O movimento das vibrissas ou a cauda também pode indicar que a anestesia é esgotando e que a top-up é necessário. - Use lubrificante oftálmica nos olhos para evitar a secura e sob anestesia.
3. Depilação
- Cuidadosamente aplicar creme depilatório para os dois terços superiores da orelha de rato dorsal utilizando aplicadores de algodão de ponta.
- Espere por 2-3 min antes de remover o creme usando aplicadores de algodão-tip molhadas de uma forma profunda mas gentil.
Nota: Não permita que creme de depilação para permanecer na orelha de rato por muito tempo, pois pode induzir a inflamação 13,14.
4. indução de isquemia e reperfusão
- Use banhados a ouro, N42-grade imãs de neodímio, 12 mm de diâmetro x 2 mm de espessura e com uma classificação Gauss de aproximadamente 3.000 para induzir isquemia na pele de orelha de rato.
Nota: Neste caso, a face de covinhas dos imans denotes seu pólo norte. - Encaixar os ímãs em suas guias de plástico individuais.
Nota: O guia de plástico serve para facilitar a colocação e a separação dos imans de alta resistência. Devido à sua forte força magnética ainda uma baixa resistência à ruptura, não coloque imans individuais em estreita proximidade uns com os outros ou com outros metais. Sucata e fragmentação pode ocorrer se eles puxam para o outro. - Posicionar o primeiro (dorsal) imã de tal forma que apenas a borda está em contacto com o segundo (ventral) ímã (Figura 3a)
Nota: Isto evita que os ímãs de encaixe juntos antes de terem sido devidamente posicionado. - Posicione os dois ímãs de tal modo que o íman ventral está acomodada na orelha (Figura 3a).
Nota: Antes de isquemia é induzida, garantir que o mouse é mantida a 37 ° C e que a anestesia suficiente é mantida (veja o passo 2.2). - Depois de pronto, cuidadosamente deixar os ímãs vêm juntos (Figura 3a Nota: Para fins de imagiologia, clamp apenas metade da orelha de modo que pode ser observada uma IR e região não-IR.
- Após 1,5 h de isquemia, remover os imans rodando os imans de distância umas das outras utilizando as guias de plástico, permitindo a reperfusão a ter lugar.
Nota: É preciso ter cuidado para evitar que as orelhas fiquem enrugados quando os ímãs são colocados. Isquemia incompleta é evidente se os vasos sanguíneos major macroscopicamente visíveis re-orvalhar imediatamente (ou seja, o sangue enche os vasos imediatamente) depois que os ímãs são removidos. Embora a reperfusão não ocorre imediatamente após a remoção dos ímans, oclusão de vasos sanguíneos é de apenas transitória. Como tal, é imperativo para preparar a orelha de rato para geração de imagens tão rapidamente quanto possível.
5. A injeção de agentes de marcação do navio de sangue
- Imediatamente após a remoção ímã, administrar por via intravenosa (via retro-orbital ou injeção na veia da cauda) azul de Evans (10 mg mL -1em PBS ou solução salina; 1 mL g -1 de peso corporal) ou outro agente de rotulagem vaso sanguíneo de escolha.
Nota: Antes da injecção, certifique-se que a anestesia suficiente ainda é mantida através da realização de beliscar toe suave.
6. Colocação da orelha sobre a plataforma de imagem
- Corte 2 pedaços de fita adesiva com 1,5 cm de comprimento e 1,8 cm de largura.
- Permitir que os lados adesivas para ficar juntos mesmo tempo que deixa cerca de 1 mm de adesivo ao longo da sua largura.
- Cortar a fita adesiva em duas partes, no sentido do comprimento, para acomodar a sua colocação no interior da fenda na plataforma orelha.
- Inserir esta fita adesiva sobre a meio caminho através da fenda, de modo que o lado adesivo virado para cima.
- Posicione o mouse sobre a almofada de aquecimento, de modo que o ouvido a ser trabalhada fica ao lado da tira de fita adesiva.
- O uso de dois aplicadores de algodão-tip PBS-umedecidos, pressione suavemente o ouvido contra a fita adesiva.
- Utilizando a tira de guia, trazer a orelha de ratoatravés da fenda enquanto ajusta simultaneamente o mouse para mais perto do palco.
- Para remover a fita adesiva, o primeiro adicionar uma gota de PBS para reduzir a aderência da fita.
- Separe a orelha de rato a partir da fita adesiva o mais suavemente possível usando um pincel fino.
- Achatar a orelha contra a plataforma de ouvido rolando delicadamente um aplicador de algodão-ponta úmida sobre a orelha.
- Colocar uma gota de PBS por baixo da lamela (que é mantido em posição no suporte da lamela utilizando massa lubrificante; Figura 2) e colocá-lo suavemente sobre a orelha. Complete com mais PBS, se necessário.
Nota: O titular lamela aumenta a estabilidade durante o exame. - Inserir a sonda de temperatura rectal e ligar os fios para o sistema de aquecimento de acordo com as instruções do fabricante.
Nota: Ajustar a temperatura da almofada de aquecimento do corpo a 37 ° C e a plataforma fase orelha a 35 ° C.
7. Multiphoton Microscópio Sete parâmetros de imagem
Nota: Este protocolo usa um único feixe, multiphoton microscópio com um ajustável (680 - 1080 nm) Ti: Sa laser (3,3 W a 800 nm; comprimento de pulso de 140 fs; taxa de repetição de 80 MHz) com um objetivo 20X água (NA = 1.0) para estudos de imagem intravital.
- Abra o software de imagem.
- Alinhar a laser de acordo com as instruções do fabricante.
- Ajustar o comprimento de onda de excitação a 950 nm.
Nota: GFP e azul Evans pode ser ao mesmo tempo animado em 950 nm. - Para visualização, use as seguintes configurações: 500 mm 2 scanfield, pixel de resolução 505 x 505, e uma frequência de varredura de 800 Hz em uma única varredura de linha. Clique em "Preview".
- Alternar o poder atenuador (laser). Assegurar que todos os sinais essenciais são apanhados, sem expor o campo de imagem a quantidades excessivas de potência do laser, o que pode induzir danos provocados pelo calor.
Nota: Comece com uma potência baixa atenuador e aumentar se o signal é fraca. Como neutrófilos estará ausente do interstício no início do tempo de pós-reperfusão aponta, os macrófagos podem ser utilizadas como um indicador para determinar a potência mínima exigida, já que são mais escuro do que os neutrófilos.
Nota: Se essa etapa é para ser feito, pela primeira vez, ajuste as configurações na zona de não-isquêmica, onde se espera que a integridade vascular intacta e facilitará a definição do poder atenuador. Em experiências posteriores, estas definições não exigem muita modificação, a menos que a potência do laser é instável. - Ajustar as configurações PMT.
Nota: Verifique com o fabricante para a tensão de ganho ideal máxima para o PMT. Ajustando a tensão PMT para além do limite recomendado vai resultar em uma maior proporção de sinal-para-ruído. A recomendação geral é para definir a tensão de ganho de PMT para o limite recomendado e para aumentar o poder atenuador conforme necessário, caso o sinal seja muito fraca. - Selecione uma região de imagem que está em estreita proximidade coma borda da isquemia, caracterizado por o vazamento de azul de Evans em massa.
- Recolha GFP e os sinais azuis Evans utilizando 525/50 passa banda (PA) e 655/40 filtros BP, respectivamente. Para sinais de geração de segundo harmônico (SHG) de fibras de colágeno dentro do compartimento dérmico, use um filtro 475/42 BP.
- Crie uma pasta para guardar as imagens em um formato que seja compatível para o software de análise de imagem disponível.
- Para adquirir, utilizar as seguintes definições: 500 mm 2 scanfield, 505 x 505 pixels de resolução e uma varredura de frequência de 400 Hz em uma única varredura de linha.
- A 100 ^ M-Z-pilha com um tamanho de passo de 4 mm pode ser adquirida repetidamente ao longo do tempo, em intervalos de 1 min, para controlar a infiltração de neutrófilos.
Nota: Especialmente para leucócitos (por exemplo, neutrófilos) com uma velocidade de migração mais elevada, um intervalo que é maior do que 1 min pode resultar em dificuldades na análise de seguimento célula. Neste caso, o utilizador pode reduzir a espessura da ACaqui- empilhar ou aumentar a frequência de varredura.
Nota: Embora a pilha de aquisição necessária da zona de isquemia pode parecer menor como resultado da compressão (caracterizado, alternativamente, por uma intensidade mais elevada SHG), reperfusão subsequente resultará na inflamação maciça que faz com que a orelha para inchar. desvios significativos na direcção Z são esperados. Como tal, a aquisição de um grande Z-pilha é necessária para acomodar a deriva. - Durante toda a imagem, completar o PBS e água regularmente para manter a orelha úmida e a lente objetiva imersa em água.
Nota: Uma experiência típica geralmente dura por 2-4 h. Dependendo do desenho experimental, e juntamente com um regime de anestesia bem controlado, prolongar a duração das imagens é possível.
8. concluir o experimento
- Euthanize o mouse por asfixia com dióxido de carbono de acordo com a instituição Comitê Animal Care Institucional e Uso (IACUC) procedures.
Nota: Sempre eutanásia o mouse por métodos aprovados conforme determinado por regras, regulamentos e diretrizes da instituição. Se imaging repetido é necessário, manter o mouse sobre a almofada de aquecimento até que a anestesia desgasta fora. Uma vez que o rato recuperou a consciência suficiente e é móvel, devolver o mouse para sua gaiola.
Análise 9. Imagem
Nota: Os dados gerados a partir do experimento de imagem podem ser visualizados por diferentes pacotes de software.
- Abra o software de análise de imagem.
- Sob Ultrapasse Mode, importar o arquivo (Open → selecionar qualquer arquivo na pasta desejada → clique em "Abrir").
- cores Editar pseudo se as cores padrão não se aplicam (ajuste Editar → Visor → Sob a guia de canais, selecione a cor desejada na paleta de cores).
- Ajustar o brilho, o contraste e fundo (Edit → visualização de ajuste → Alternar Max e valores min). Certifique-se de que as dimensões do arquivo estão corretos (propriedades Editar → Imagem → Na guia geometria, verificar o tamanho do voxel. Neste protocolo, X = 0,99, Y = 0,99 e Z = 4).
Nota: Derive X e Y, dividindo a dimensão scanfield pela resolução de pixel. Z é a espessura entre cada fatia.
Nota: A produção destes conjuntos de dados podem ser apresentados como filmes máximos de projecção.
Nota: análise de rastreamento é necessário para caracterizar completamente as atividades celulares e interações a fim de compreender a sua função in vivo. As instruções detalhadas de acompanhamento de célula usando a função local disponível no software pode ser encontrado no protocolo em 15 de Referência.
Nota: Há muitas formas de quantificar a migração de leucócitos, cujos detalhes podem ser encontrados no artigo de revisão em 16 de Referência.
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Representative Results
Esse protocolo utiliza uma pele de orelha de plataforma de imagem-construído sob encomenda, como se mostra na Figura 1. Várias características desta plataforma são projetados especificamente para facilitar a imagem, mantendo as configurações fisiológicas. Colocar a orelha na plataforma de bronze aquecida não só mantém a orelha a uma temperatura fisiológica de 35 ° C, mas também a partir de isolados do ouvido movimentos inevitáveis devidas à respiração. A adição de um clipe de metal de bronze na plataforma cria uma abertura para evitar o titular da lamela de exercer peso sobre a orelha, mantendo assim o fluxo sanguíneo ininterrupto. A plataforma de fase também está concebido para acomodar uma almofada de aquecimento de forma a manter o rato a 37 ° C durante todo o procedimento de imagiologia.
O titular da lamela (Figura 2) é concebido para permitir que a lamela para ser anexado no suporte de metal com a ajuda de vácuo excelenSE. O titular da lamela está ligado a um suporte que permite o ajuste flexível nos eixos verticais e horizontais com a ajuda do adaptador. Desta forma, o utilizador pode ajustar primeiro com precisão a posição da lamela sobre a orelha e, posteriormente, fixar nessa posição, apertando os parafusos no adaptador.
Neste protocolo, que descrevem a utilização de magnetos para simular isquemia e reperfusão. Figura 3B exibe vistas representativas dos ouvidos antes e imediatamente após a isquemia. Sob condições fisiológicas, os grandes vasos sanguíneos pode ser visualizada macroscopicamente. O efeito de beliscar dos imans hastes temporariamente o fluxo de sangue, o que pode ser observado por um efeito de branqueamento transiente (seta preta), quando os ímanes são removidos.
Nesta demonstração nomeadamente, imagem está focada na borda da zona de isquemia (Figura 3c (Figura 3d). Isso cria marcos importantes para estudos de imagem intravital e ajuda a manter a consistência entre os experimentos independentes.
Os dados mostram que, em resposta a um insulto IR, infiltração de neutrófilos para o interstício de saída a partir de vasos sanguíneos intactas que reveste a borda da zona de isquemia e migram para o local da lesão (Figura 3D e Filme 1). Espera-se uma resposta retardada de neutrófilos que migram para o interstício, em comparação com outros modelos de inflamação devido a uma falta de vasos sanguíneos viáveis perfusão em pontos de tempo anteriores de pós-reperfusão. Para caracterizar completamente estes celularactividades especificas, análise de rastreamento de células podem ser utilizados para compreender a sua função in vivo. Velocidade, deslocamento médio e índice quimiotático são alguns dos potenciais de leitura-outs que podem ser obtidos a partir da análise de rastreamento de pilha.
Figura 1. Diagrama esquemático de um Stage orelha pele sob medida para Intravital Multiphoton Imaging. (a) Vista de cima do palco imagem orelha com suas dimensões. (b) Vista frontal e dimensões. Note-se que a chapa de latão é mais espesso nos lados, a fim de proporcionar estabilidade à plataforma, e mais fino no meio, para minimizar a área de contacto com a pele, assegurando o fluxo sanguíneo ininterrupto quando a orelha é dobrada sobre o bordo da fenda e repousava sobre a plataforma. view (c) Lado do suporte curvo que os pinos para baixo a sonda feedback. A almofada de aquecimento pode serfixo sobre a plataforma usando fita adesiva (não mostrado). Modificado de Li et al., Nat Protoc, 2012 8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Concepção do Titular Coverslip; Lado e Top View. O titular lamela detém a lamela em uma posição fixa e, portanto, reduz z-drift. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. O modelo IR. (A) Diagrama esquemático que mostra o posicionamento de imans. (B) (C) Esquema da orelha mostrando a região de imagem em relação ao local onde o íman tinha sido colocado. (D) de intensidade máxima projetada-z snapshots de uma seqüência de lapso de tempo que mostra a infiltração de neutrófilos pós-reperfusão em um rato LysM-eGFP. tempo decorrido mostrado no formato hh: mm. Barra de escala: 100? M. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1. neutrófilos Recrutamento em Injury IR. Uma sequência de lapso de tempo de projeção máxima mostrando neutrófilos infiltração (verde) em resposta a reperfusão na pele de orelha de rato albino LysM-eGFP após 1,5 h de isquemia. Em pontos de tempo anteriores, a falta deEvans sinal azul (vermelho) indica oclusão do vaso temporária após isquemia. Colágeno (azul, geração de segundo harmônico). Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).
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Discussion
Significado
IR é uma das principais causas de úlceras de pressão pele. Os estágios iniciais (I e II) de úlceras de pressão descrevem a condição da pele humana (em comparação com os tecidos subcutâneos subjacentes e músculos). No entanto, uma compreensão da etiologia imunológica ainda está em falta. Aqui, apresentamos um modelo de IR simples e robusto na pele de orelha de rato, a fim de resolver esta lacuna. Nós simular a isquemia por clampeamento da orelha de rato entre dois ímãs e, posteriormente, estudar as respostas imunes a jusante após a remoção do imã (reperfusão). Usando ímãs para gerar uma pressão constante sobre cada orelha por um período fixo de tempo, induzindo isquemia, somos capazes de garantir a reprodutibilidade e consistência entre os experimentos.
A força deste modelo IR não-invasiva também reside na sua capacidade de demonstrar, em tempo real, em respostas imunes in vivo utilizando um modelo bem estabelecido de Imagin intravitalg de pele da orelha, o que oferece uma maior estabilidade durante a imagem em comparação com o procedimento de flanco pele. Alguns dos modelos de flanco pele atuais envolvem procedimentos cirúrgicos que podem alterar a paisagem imunológico da pele 4. Além disso, a imagem da própria flanco pele apresenta um desafio técnico, como movimentos respiratórios podem contribuir para artefatos relacionados com o movimento durante a imagem 5,6. O nosso modelo atual contorna estes problemas.
Além de estudar as respostas fisiológicas de células do sistema imunológico para IR, este modelo pode também ser aplicada a configurações fisiopatológicos como a diabetes mellitus, em que a diabetes pode agravar a lesão IR por meio de aumento do estresse oxidativo. Compreendendo as respostas imunitárias irão contribuir para uma compreensão da cicatrização de feridas.
Passos críticos
Uma vez que o mouse está sob anestesia, termorregulação é prejudicada e a temperatura corporal cai drasticamente. Para evitar hypotHermia, aquecimento externo é essencial para manter a temperatura corporal a 37 ° C. O ouvido, localizada distalmente em relação ao núcleo do corpo, é fisiologicamente mais frio por 1 - 2 ° C e deve ser mantida a 35 ° C. Essa consistência no aquecimento também irá garantir reprodutíveis leitura dos dinâmica celulares. Ao mesmo tempo, o sistema de aquecimento deve ser verificado para assegurar que o rato não é sobre-aquecimento ao longo de todo o comprimento da anestesia.
A utilização de ratinhos albino (estirpe BALB / c e C57BL / 6-C 2J) para todos os estudos de imagens da pele é altamente recomendável para evitar salpicar lesões induzidas pelo pigmento. Se os ratos albinos não estão disponíveis, diminuindo a potência do laser, durante a aquisição de imagem pode aliviar o problema de ratos pigmentados. No entanto, uma maior optimização pode ser necessário, como uma profundidade reduzida de penetração nos tecidos pode resultar em um resultado mais pobre aquisição.
A pele da orelha é muito delicada; portanto, os cuidados devem ser tomados para evitar quaisquer circunstâncias quepodem causar inflamação. Exemplos de técnicas impróprias incluem, mas não estão limitados a, o seguinte: 1) deixando o creme depilatório por uma quantidade excessiva de tempo durante o qual é recomendada; 2) aplicação de fricção excessiva na orelha ao trazer a orelha através da fenda da plataforma de imagem orelha ou ao destacar a orelha da fita adesiva; e 3) o sobreaquecimento do ouvido, quer devido a um sistema de aquecimento defeituoso ou uma sonda de realimentação de temperatura que pode ser deslocada gravação temperatura ambiente em vez de a temperatura do núcleo do rato.
Modificações e resolução de problemas
A maior parte da solução de problemas referentes ao procedimento de preparação da orelha foi previamente listada 8. Se o ouvido é fotografada a um ponto mais tarde o tempo de pós-reperfusão, a orelha pode inchar para além da lacuna 0,5 mm criado pelo clipe de metal para acomodar a espessura da orelha (Figura 1). Neste cenário, a colocação da lamela sobre a orelhapode dificultar o fluxo sanguíneo, o que é evidente quando os vasos sanguíneos visíveis macroscopicamente desaparecer de vista. Isso deve ser evitado através da criação de uma diferença maior entre o suporte e a lamela a plataforma de bronze. Isto pode ser feito de duas maneiras, quer por ajuste manual da altura do suporte da lamela (Figura 2) ou por meio de um clipe de metal mais grossa.
Limitações da técnica
Neste protocolo, foi utilizado azul de Evans para determinar a localização da zona de isquemia, uma vez que a fuga do azul de Evans no interstício marca a fronteira da zona isquémica em pontos de tempo iniciais pós-isquemia. Azul de Evans é vulgarmente usado como um agente de marcação do vaso sanguíneo. No entanto, em condições inflamatórias, a integridade vascular é severamente comprometida. Isto resulta na fuga de Azul de Evans no interstício. Neste modelo, observa-se uma perda drástica de contraste entre os vasos sanguíneos e interstício logo após a reperfusão. Como tal, em rudies onde as interações leucócito-endotélio estão envolvidos, recomendamos experimentar com outros agentes de rotulagem dos vasos sanguíneos de tamanhos diferentes (por exemplo, dextranos, etc.).
Aplicações futuras
Além de utilizar o rato LysM-eGFP para demonstrar como neutrófilos responder aos IR da pele, este modelo pode também ser utilizado para o estudo de outras respostas leucocitárias, tanto na infiltração (monócitos) e em intersticiais residente (macrófagos) leucócitos. Este modelo também pode ser estendido a outros estudos para analisar o sangue e integridade linfático, bem como as interacções leucócito-endotélio depois de uma lesão de IR. Juntamente com a capacidade de visualizar de colagénio como sinais de SHG através MP-IVM, que também seria interessante para monitorizar a integridade de colagénio IV ou depois durante a cicatrização de feridas. Em resumo, temos um conjunto de um não-invasiva modelo robusto de IR para imagiologia intravital, a fim de estudar respostas imunes na pele orelha de rato.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
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