Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Induktion einer Ischämie-Reperfusion (IR) Modell auf Mausohrhaut mit Magnetspann. Mit Hilfe eines speziell angefertigten intravital Bildgebung Modell untersuchen wir in vivo Entzündungsreaktionen post-Reperfusion. Das Grundprinzip hinter der Entwicklung dieser Technik besteht darin, das Verständnis zu verlängern, wie Leukozyten Haut IR Verletzung reagieren.
Introduction
Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) tritt auf, wenn eine vorübergehende Hypoxie aufgrund der Behinderung des Blutflusses (Ischämie) durch eine nachfolgende Wiedersauerstoffversorgung der Gewebe (Reperfusion) gefolgt ist. In der Haut, Ischämie-Reperfusion (IR) gilt als einer der Faktoren für die Pathophysiologie von Dekubitus zu sein, wo längere Bettruhe langfristige Krankenhauspatienten zu Verletzungen prädisponiert. Bei diesen Patienten sowohl die Haut und die darunter liegenden Muskeln sind ständig Gewichtsdruck ausgesetzt über Bereiche der Knochenvorsprung ausgeübt wird, in lokalisierten Verletzungen führt , die, wenn sie unbehandelt, nekrotischen 1 werden kann.
Die Schäden in einer IRI beteiligt sind zweifach. Während der Ischämie führt die Okklusion von Blutgefäßen zu einem drastischen Abfall der Sauerstoffzufuhr zu den Geweben. Dies führt zu einer Abnahme von ATP und pH, die ATPasen involviert in den Zellstoffwechsel inaktiviert. Im Gegenzug Spike zellulären Kalziumspiegel und gestresst oder c beschädigtells Apoptose oder Nekrose 2. Die Freisetzung von intrazellulären Inhalte oder Schäden associated molecular patterns (DAMP), wie HMGB1, trägt zu der entzündlichen Reaktion 3. Die zweite Beleidigung tritt während der Reperfusion. Obwohl Sauerstoff und pH-Werte während der Reperfusion wiederhergestellt werden, führt dies zu der Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die auf die Oxidation von intrazellulären Lipiden führt, DNA und Proteinen. Folglich werden pro-inflammatorischen Mediatoren aktiviert, die aus setzt eine sekundäre Entzündungsreaktion, die die Rekrutierung von Immunzellen zur Entzündungsstelle 2 umfasst. Während die Kaskade biochemischer Ereignisse bis zu der Entzündungsreaktion führen gut beschrieben worden ist, sind die räumliche und zeitliche Regulierung der Immunzellaktivitäten nicht gut verstanden.
Hier beschreiben wir eine robuste IR-Modell auf Mausohrhaut mit einfachen Magnetspann. In Verbindung mit Multiintravital Bildgebung (MP-IVM), werden wirwurde ein Modell , um die in - vivo - Entzündungsreaktionen zu untersuchen , die auftreten , nach der Reperfusion stattfindet. Der Grund für die Entwicklung und Anwendung dieser Technik ist, um zu versuchen, zu verstehen, wie sowohl interstitielle und infiltrierenden Zellen IR in Echtzeit zu antworten.
Bestehenden Modellen von IR die Spanntechnik auf der Haut Flanke verwenden , sind sehr invasiv, da sie die chirurgische Implantation von Stahlplatten in der Haut Flanke erfordern, so dass sie weniger als ideal für immunologische Studien 4. Eine ähnliche nicht-invasive Spanntechnik ist in der Maushaut Flanke 5,6 beschrieben. Da jedoch der Einbau der intravitalAbbildungsKomponente in diesem Verfahren haben wir stattdessen die Ohrhaut als IR Stelle gezielt, da sie Bewegungen aufgrund von Atem umgeht und bietet Stabilität 7,8 während der Bildgebung. Außerdem Leukozytenuntergruppen, die das Interstitium umspannen identisch sind zwischen dem Ohrhaut und der Haut flankieren, obwohl dieZahlen und Proportionen können geringfügig 9 variieren. Somit stellt die Ohrhaut eine ideale Abbildungsstelle.
Darüber hinaus abgerufen die meisten Daten aus diesen IRI Modelle sind begrenzt auf makroskopische Auswertungen (Einstufung von Geschwüren) und mikroskopische Analysen von Endpunktentzündungsindikatoren 10. Unter Verwendung dieses Modells Echtzeit-Visualisierung der zellulären Antwort von Neutrophilen nach der Reperfusion in der Haut eines fluoreszierenden Reporter Maus aktiviert. Eine zuvor veröffentlichte intravital Ohr Abbildungsmodell 8 mit zusätzlichen Modifikationen verwendet (1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Experimente mit lebenden Tieren zu tun wurden in Übereinstimmung mit allen relevanten Tier Verwendung und Pflege Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.
1. Wahl des fluoreszierenden Reporter-Mäuse
- Verwenden 6- bis 12-Wochen alten LysM-eGFP 11 Mäuse (keine Präferenz entweder für Männer oder Frauen).
Anmerkung: Die Verwendung verschiedener zellspezifischen fluoreszierenden Reportermäusen ermöglicht die Visualisierung von verschiedenen Immunzellen in vivo. In diesem Stamm zirkulierenden Neutrophile (GFP Hallo - Zellen), können Monozyten (GFP lo Zellen) und Makrophagen dermal (GFP lo Zellen) zirkulierende visualisiert werden. Mit der Abbildungsparameter verwendet wird, nur die hellen Signale von GFP-positive Neutrophile erkannt.
Hinweis: Eine Liste von immunzellspezifischen fluoreszierenden Reportermausstämme geeignet für diese Art von Hautabbildungs Studie kann in Referenz 8 gefunden werden.
Hinweis: Es wird dringend empfohlen, dass Albino-Mäuse für die Bildgebung verwendet werden, wie pigmented Mäuse sind anfälliger für Lichtschäden. Dies liegt daran, dass die pigmentierte Ohrhaut zu laserinduzierten Sprenkelung (indikativ Gewebe Brennen) viel empfindlicher ist. Als Ergebnis neutrophilen Rekrutierung und Akkumulation kann sogar 8,12 während des stationären Zustands beobachtet werden. - Halten Sie die Mäuse in spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen mit 12-h-Hell-Dunkel-Zyklen.
2. Maus Anesthesia
- Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin (8 & mgr; l g -1 Körpergewicht), bestehend aus einer Mischung von 15 mg ml -1 Ketamin und 1 mg ml -1 Xylazin in sterilem Wasser gelöst.
- Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen auf seine Körpertemperatur auf 37 ° C während des gesamten Herstellungsverfahrens aufrechtzuerhalten. Achten Sie auf ausreichende Anästhesie durch ein Fehlen einer Zehe Prise Reflex zu beobachten.
Hinweis: Nach der ersten Stunde, anschließende Quartal Dosen von Narkose müssen subkutan eine zu verabreichended wird jeder für etwa 0,5 Stunden dauern. Das Zucken der Whisker oder der Schwanz kann auch bedeuten, dass die Betäubung ausgeschaltet trägt und dass ein Top-up ist nicht erforderlich. - Verwenden Sie ophthalmische Schmiermittel auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
3. Depilation
- Anwendung sorgfältig Enthaarungscreme auf die oberen zwei Drittel des Ohres dorsalen Maus mit Baumwolle-Spitze Applikatoren.
- Warten Sie 2 - 3 Minuten vor der Sahne nassen Baumwollspitze Applikatoren in einer gründlichen, aber schonend zu entfernen.
Hinweis: Nicht Enthaarungscreme erlauben zu lange auf der Maus Ohr zu bleiben, da es 13,14 Entzündung auslösen können.
4. Induktion von Ischämie und Reperfusion Injury
- Verwenden vergoldet, N42-Grade-Neodym-Magneten, 12 mm Durchmesser x 2 mm dick und mit einem Gauß-Rating von etwa 3000 Ischämie im Mausohr Haut zu induzieren.
Anmerkung: In diesem Fall wird die genoppte Fläche der Magneten DeNOtes sein Nordpol. - Slot die Magnete in ihre einzelnen Kunststoffführungen.
Hinweis: Die Kunststoff-Führung die Platzierung und die Trennung der hochfesten Magneten zu erleichtern dient. Aufgrund ihrer starken Magnetkraft noch geringe Bruchfestigkeit, außerdem nicht mit Einzelmagneten in enger Nähe zueinander oder zu anderen Metallen. Bruch und Splittern kann auftreten, wenn sie aufeinander zu ziehen. - Positionieren Sie den ersten (dorsale) Magneten , so dass nur der Rand ist in Kontakt mit dem zweiten (ventralen) Magneten (3a)
Hinweis: Dies verhindert, dass die Magnete aus schnappen zusammen, bevor sie richtig positioniert ist. - Positionieren Sie die beiden Magneten , so dass der ventralen Magnet liegt flach auf dem Ohr (Abbildung 3a).
Hinweis: Vor dem Ischämie induziert wird, gewährleisten, dass die Maus auf 37 ° C gehalten wird und daß eine ausreichende Anästhesie aufrechterhalten wird (siehe Schritt 2.2). - Einmal fertig, lassen Sie sorgfältig die Magnete zusammen kommen (3a Anmerkung: Für Abbildungszwecke klemmen nur die Hälfte des Ohrs, so dass ein IR und nicht-IR-Bereich beobachtet werden kann.
- Nach 1,5 h von Ischämie, entfernen Sie die Magnete durch die Magnete voneinander entfernt Verdrehen der Kunststoffführungen verwenden, so dass der Reperfusion stattfinden soll.
Hinweis: Es muss die Ohren von Falten, wenn die Magnete angeordnet sind, zu verhindern. Unvollständige Ischämie ist offensichtlich , wenn die makroskopisch sichtbaren großen Blutgefäße wieder perfuse sofort (dh Blut füllt die Gefäße sofort) , nachdem die Magnete entfernt werden. Obwohl Reperfusion nur transient tritt nicht unmittelbar nach dem Entfernen des Magneten ist Blutgefäßverschluss. Als solches ist es zwingend notwendig, die Maus Ohr für die Abbildung so schnell wie möglich vorzubereiten.
5. Die Injektion von Blutgefäß Markierungsmittel
- Unmittelbar nach dem Magnetentfernung, verabreichen intravenös (über retro-orbitale oder Schwanzveneninjektion) Evans - Blau (10 mg mL -1in PBS oder Kochsalzlösung; 1 & mgr; l g -1 Körpergewicht) oder ein anderes Blutgefäß Markierungsmittel der Wahl.
Hinweis: Vor der Injektion sicherzustellen, dass eine ausreichende Anästhesie noch, indem sanfte Zehen Einklemmen gehalten wird.
6. Platzierung des Ohres auf dem Imaging-Plattform
- Schneiden 2 Stück Abdeckband 1,5 cm lang und 1,8 cm in der Breite.
- Lassen Sie die Klebeseiten zusammenkleben, während etwa 1 mm von Klebstoff entlang ihrer Breite zu verlassen.
- Schneiden Sie das Abdeckband in zwei, in Längsrichtung, seine Platzierung innerhalb des Schlitzes am Ohr Plattform aufzunehmen.
- Einfügen dieses Abdeckband etwa auf halbem Weg durch den Schlitz, so dass die Klebeseite nach oben zeigt.
- Bewegen Sie die Maus auf dem Heizkissen, so dass das Ohr abgebildet werden soll, neben dem Kreppband-Streifen.
- Durch die Verwendung von zwei PBS-angefeuchteten Wattespitze Applikatoren, drücken Sie vorsichtig das Ohr gegen den Klebestreifen.
- Mit dem Streifen als Führer, bringen Sie die Mausohrdurch den Schlitz einstellen, während gleichzeitig die Maus näher an der Bühne.
- Um das Klebeband entfernen, fügen Sie zuerst einen Tropfen PBS die Haftung des Bandes zu reduzieren.
- Trennen Sie die Mausohr vom Abdeckband so schonend wie möglich einen feinen Pinsel.
- Glätten Sie das Ohr an Ohr Plattform vorsichtig mit einem feuchten Baumwollspitze Applikator über dem Ohr rollen.
- Geben Sie einen Tropfen PBS unter dem Deckglas (die in ihrer Position auf dem Deckglas Halter gehalten wird unter Verwendung von Fett; Abbildung 2) und sanft über das Ohr auf . Top mit mehr PBS, falls erforderlich.
Hinweis: Der Deck Halter erhöht die Stabilität während der Bildgebung. - Legen Sie die Sonde Rektaltemperatur und schließen Sie die Kabel an das Heizungssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Hinweis: Stellen Sie die Temperatur des Körpers Heizkissen auf 37 ° C und das Ohr Bühnenplattform bis 35 ° C.
7. Multiphotonenionisation Mikroskop Setund Imaging-Parameter
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet einen einzigen Strahl, Multi Mikroskop mit einem abstimmbaren (680 - 1.080 nm) Ti: Sa-Laser (3,3 W bei 800 nm, Pulslänge von 140 fs, 80 MHz Repetitionsrate) mit einem 20x Wasser Objektiv (NA = 1.0) für intravital Bildgebungsstudien.
- Öffnen Sie die Imaging-Software.
- Richten der Laser gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 950 nm.
Hinweis: GFP und Evans blau bei 950 nm gleichzeitig angeregt werden können. - Zur Vorschau, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 500 & mgr; m 2 Scanfeld, 505 x 505 Pixel Auflösung und eine Abtastfrequenz von 800 Hz in einer einzigen Zeile Scan. Klicken Sie auf "Vorschau".
- Schalten Sie den Dämpfer (Laser) Leistung. Stellen Sie sicher, dass alle wesentlichen Signale ohne Aussetzen des Abbildungsfeldes zu übermäßigen Mengen an Laserleistung aufgenommen, die Hitzeschäden hervorrufen kann.
Hinweis: Beginnen Sie mit einer niedrigen Dämpfungsglied Leistung und erhöhen, wenn der Signal dim. Als Neutrophilen fehlen wird aus dem Interstitium zu frühen Zeitpunkten nach der Reperfusion, können Makrophagen als Maß verwendet werden, um die minimale Leistung erforderlich, um zu bestimmen, wie der ehemalige Dimmer als Neutrophile sind.
Hinweis: Wenn dieser Schritt zum ersten Mal zu tun ist, passen Sie die Einstellungen in den nicht-ischämische Zone, wo intakte Gefäß Integrität erwartet wird, und wird die Einstellung der Dämpfungsleistung zu erleichtern. In nachfolgenden Experimenten, diese Einstellungen nicht viel geändert werden müssen, es sei denn die Laserleistung instabil ist. - Passen Sie die PMT-Einstellungen.
Hinweis: Prüfen Sie mit dem Hersteller für die maximale optimale Verstärkung Spannung für die PMT. Einstellen der PMT-Spannung über den empfohlenen Schwellwert wird in einem höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis führen. Die allgemeine Empfehlung ist die PMT-Verstärkung Spannung auf den empfohlenen Grenzwert zu setzen und die Dämpfung Leistung wie nötig zu erhöhen, sollte zu schwach das Signal sein. - Wählen Sie eine Abbildungsregion, die in unmittelbarer Nähe zuder Rand der Ischämie, gekennzeichnet durch massive Evans Blau Leckage.
- Sammeln GFP und Evans Blau-Signale mit 525/50 Bandpass (BP) und 655/40 BP-Filter sind. Für Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) Signale von Kollagenfasern in der Haut Fach, verwenden Sie ein 475/42 BP-Filter.
- Erstellen Sie einen Ordner, um die Bilder in einem Format zu speichern, die für die verfügbare Bildanalyse-Software kompatibel ist.
- Zum Erwerb, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 500 & mgr; m 2 Scanfeld, 505 x 505 Pixel Auflösung und eine Abtastfrequenz von 400 Hz in einer einzigen Zeile Scan.
- Ein 100 & mgr; m z-Stapel mit einer Schrittweite von 4 um kann wiederholt über die Zeit in 1 min Intervallen erfasst werden, Neutrophilen-Infiltration zu überwachen.
Hinweis: Vor allem für Leukozyten (zB Neutrophile) mit einer höheren Wanderungsgeschwindigkeit, ein Intervall , das länger als 1 min ist , kann in Schwierigkeiten bei der Zellverfolgungsanalyse führen. In diesem Fall kann der Benutzer entweder die Dicke der ac reduzierenwerb stapeln oder die Scan-Frequenz erhöhen.
Anmerkung: Während der erforderliche Akquisitionsstapel der ischämischen Zone kann kleiner als Folge der Kompression erscheinen (alternativ durch eine höhere SHG Intensitäts gekennzeichnet), führt anschließende Reperfusion in massiven Entzündung, die das Ohr verursacht, quellen. Signifikante Drifts in der Z-Richtung gerechnet. Als solches ist der Erwerb eines großen z-Stack notwendig, um die Drift zu berücksichtigen. - Während der gesamten Imaging, ganz oben auf der PBS und Wasser regelmäßig auf die Ohr feucht und die Objektivlinse in Wasser getaucht zu halten.
Hinweis: Ein typisches Experiment in der Regel für 2 dauert - h 4. Je nach Versuchsanordnung, und in Verbindung mit einer gut gesteuerten Anästhesie Regime ist die Dauer der bildgebenden Verlängerung möglich.
8. Terminieren des Experiment
- Euthanize die Maus durch Erstickung mit Kohlendioxid nach der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Institution procedures.
Hinweis: einschläfern immer die Maus nach anerkannten Methoden bestimmt, wie von den Regeln der Institution, Vorschriften und Richtlinien. Wenn wiederholte Abbildung benötigt wird, halten Sie die Maus auf dem Heizkissen, bis die Betäubung nachlässt. Sobald die Maus genügend Bewusstsein wiedererlangt hat und mobil ist, kehren Sie mit der Maus in seinen Käfig.
9. Bildanalyse
Anmerkung: Die Daten von der Bildgebungsexperiment erzeugt wird, durch verschiedene Softwarepakete visualisiert werden.
- Öffnen Sie die Bildanalyse-Software.
- Surpass-Modus Under, importieren Sie die Datei (Open → wählen Sie eine beliebige Datei in den gewünschten Ordner → Klicken Sie auf "Öffnen").
- Bearbeiten Pseudofarben, wenn die Standardfarben gelten nicht (Edit → Displayeinstellungen → Unter der Registerkarte Kanal, wählen Sie die gewünschte Farbe aus der Farbpalette).
- Stellen Sie die Helligkeit, den Kontrast und Hintergrund (Bearbeiten → Anzeige Einstellung → Toggle Max und Min-Werte). Stellen Sie sicher, dass die Datei Dimensionen korrekt sind (Bearbeiten → Bildeigenschaften → Unter der Registerkarte Geometrie, überprüfen Sie die Voxelgröße. In diesem Protokoll X = 0,99, Y = 0,99, und Z = 4).
Hinweis: Man leite X und Y durch die Scanfeld Dimension durch die Pixelauflösung geteilt wird. Z ist die Dicke zwischen jeder Scheibe.
Hinweis: Die Ausgabe dieser Datensätze können als maximale Projektion Filme präsentiert werden.
Hinweis: Tracking - Analyse erforderlich ist , um vollständig die zellulären Aktivitäten und Interaktionen , um charakterisieren ihre Funktion in vivo zu verstehen. Detaillierte Anweisungen von Zellverfolgung der Punktfunktion in der Software kann in dem Protokoll in Referenz 15 zu finden.
Hinweis: Es gibt viele Möglichkeiten zur Quantifizierung von Leukozyten-Migration, deren Einzelheiten können 16 in dem Übersichtsartikel in Reference.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieses Protokoll verwendet einen speziell angefertigten Ohrhaut Imaging - Plattform, wie in Abbildung 1 dargestellt. Einige Merkmale dieser Plattform sind speziell Bildgebung zu erleichtern konzipiert, während physiologische Einstellungen beibehalten. Platzieren des Ohres auf der beheizten Messing Plattform nicht hält nur das Ohr bei einer physiologischen Temperatur von 35 ° C, aber es Isolate auch das Ohr von unvermeidlichen Bewegungen durch Atmung. Die Zugabe eines Metallclip auf der Messing Plattform entsteht eine Lücke von der Deck Halter zu verhindern Gewicht auf das Ohr ausgeübt wird, wodurch die Aufrechterhaltung ununterbrochenen Blutfluss. Die Bühnenplattform ist auch ein Heizkissen unterzubringen, dass die Maus auf 37 ° C während des gesamten Bildgebungsverfahrens beibehält.
Die Deckträger (2) ausgebildet ist , das Deckglas zu ermöglichen , mit Hilfe der Vakuum grea angebracht auf der Metallhalter werdense. Der Deckhalter ist an einem Ständer verbunden, der in den vertikalen und horizontalen Achsen mit Hilfe des Adapters für flexible Einstellung ermöglicht. Auf diese Weise kann der Benutzer zunächst genau die Position des Deckglases über das Ohr anpassen und befestigen anschließend diese Position durch die Schrauben am Adapter befestigen.
In diesem Protokoll haben wir die Verwendung von Magneten zu simulieren Ischämie und Reperfusion beschrieben. 3b zeigt repräsentative Blick auf die Ohren vor und unmittelbar nach der Ischämie. Unter physiologischen Bedingungen können großen Blutgefäße makroskopisch sichtbar gemacht werden. Die Klemmwirkung der Magnete Stielen vorübergehend den Blutfluss, der durch einen vorübergehenden Effekt Blanchierung (schwarzer Pfeil), wenn die Magnete werden entfernt beobachtet werden können.
In diesem besonderen Demonstration wird Abbildung auf dem Rand der ischämischen Zone (3c fokussiert (Abbildung 3d). Dies schafft eine wichtige Orientierungs für intravital Imaging-Studien und hilft Konsistenz zwischen unabhängigen Experimenten zu halten.
Die Daten zeigen , dass in Reaktion auf eine IR - Beleidigung, Neutrophile Ausfahrt in das Interstitium aus intakten Blutgefäße auskleiden den Rand der ischämischen Zone und wandern in Richtung der Verletzungsstelle (Abbildung 3d und Film 1) zu infiltrieren. Wir rechnen mit einer verzögerten Reaktion von Neutrophilen in das Interstitium zu anderen Entzündungsmodellen durch einen Mangel an lebensfähigen Perfusion Blutgefäße zu früheren Zeitpunkten post-Reperfusion im Vergleich zu migrieren. Zur Charakterisierung vollständig diese Zelledere Aktivitäten, können Zell Tracking - Analyse verwendet werden , um ihre Funktion in vivo zu verstehen. Geschwindigkeit, mittlere Verschiebung und chemotaktische Index sind einige der möglichen Auslesungen, die aus der Zelle Tracking-Analyse erhalten werden können.
Abbildung 1. Schematische Darstellung eines Custom-made Ohrhaut Bühne für Intra Multiphotonenionisation Imaging. (a) Draufsicht des Ohres Abbildungsstufe ist mit seinen Maßen. (b) Frontalansicht und Abmessungen. Man beachte, daß die Messingplatte an den Seiten dicker ist, um die Stabilität der Plattform zu liefern, und dünner in der Mitte Kontaktfläche mit der Haut zu minimieren, ohne Unterbrechung des Blutflusses zu gewährleisten, wenn das Ohr über den Rand des Schlitzes gefaltet ist und auf der Plattform lag. (c) Seitenansicht des gekrümmten Halter, die das Feedback Prüfkopfstifte nach unten. Das Heizkissen kannder Plattform fixiert auf das Band unter Verwendung von Maskierung (nicht gezeigt). Geändert von Li et al., Nat Protoc 2012 8. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Entwurf des Deckglases Halter; Seitenansicht und Aufsicht. Der Deckhalter hält das Deckglas in einer festen Position und reduziert somit z-Drift. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die IR - Modell. (A) Schematische Darstellung zeigt die Positionierung der Magneten. (B) (C) Schematische Darstellung des Ohres , welche die in Bezug abgebildeten Bereich, wo der Magnet gelegt worden war. (D) Maximale Intensität z-projizierten Momentaufnahmen aus einem Zeitraffer-Sequenz neutrophile Infiltration mit post Reperfusion in einem LysM-eGFP Maus. mm Format: Abgelaufene Zeit in hh gezeigt. Maßstabsbalken: 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1. Neutrophilen Recruitment in IR Verletzungen. Ein Zeitraffer-Sequenz von maximalen Projektion zeigt Neutrophilen (grün) Infiltration in Reaktion auf Reperfusion in LysM-eGFP Albino-Maus Ohrhaut nach 1,5 h Ischämie. Zu früheren Zeitpunkten, die fehlendeEvans Blau-Signal (rot) zeigt temporäre Gefäßverschluss nach Ischämie. Collagen (blau, Erzeugung der zweiten Harmonischen). Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bedeutung
IR ist eine der führenden Ursachen von Haut Dekubitus. Die frühen Stadien (I und II) von Dekubitus beschreiben den Zustand der menschlichen Haut (wie auf die zugrunde liegenden subkutanen Gewebe und Muskeln im Vergleich). Allerdings fehlt ein Verständnis für die immunologische Ätiologie noch. Hier präsentieren wir eine einfache und robuste IR-Modell auf Mausohrhaut, um diese Lücke zu schließen. Wir simulieren Ischämie mit der Maus Ohr zwischen zwei Magneten Spann- und anschließend studieren die nachgeschaltete Immunreaktionen nach Magnet Entfernung (Reperfusion). Durch die mit Hilfe von Magneten einen konstanten Druck auf jedem Ohr für einen festgelegten Zeitraum zu erzeugen, zu induzieren Ischämie, sind wir in der Lage Reproduzierbarkeit und Konsistenz zwischen den Experimenten zu gewährleisten.
Die Stärke dieses nicht-invasive IR - Modell liegt auch in seiner Fähigkeit, in Echtzeit, In - vivo - Immunantworten zu demonstrieren , indem ein gut etabliertes Modell der intravital imagin Verwendungg der Ohrhaut, die mehr Stabilität während der Bildgebung bietet wie auf die Haut flankieren Verfahren verglichen. Einige der aktuellen Haut flankieren Modelle beinhalten chirurgische Eingriffe, die die Immun Landschaft der Haut 4 verändern können. Darüber hinaus Abbildung der Haut Flanke selbst stellt eine technische Herausforderung, da Atembewegungen zu bewegungsbezogene Artefakte beitragen 5,6 während der Bildgebung. Unser aktuelles Modell umgeht diese Probleme.
Zusätzlich zu den physiologischen Reaktionen von Immunzellen zu IR studieren, kann dieses Modell auch auf pathophysiologische Einstellungen wie Diabetes mellitus anwendbar sein, in denen Diabetes IR Verletzungen durch erhöhten oxidativen Stress verschlimmern kann. die Immunantworten Das Verständnis für das Verständnis der Wundheilung beitragen.
Kritische Schritte
Sobald die Maus unter Narkose ist, wird die Thermoregulation beeinträchtigt wird und die Körperkerntemperatur sinkt drastisch. Um zu verhindern, hypothermia, externer Heizung ist wichtig, die Kernkörpertemperatur bei 37 ° C zu halten. Das Ohr, befindet sich distal zu dem Körperkern, ist physiologisch Kühler durch 1 bis 2 ° C und muss bei 35 ° C gehalten werden. Diese Konsistenz in Heizung wird auch reproduzierbar Auslesen der Zelldynamik gewährleisten. Zur gleichen Zeit muss das Heizungssystem überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Maus nicht ein Überhitzen über die gesamte Länge der Anästhesie.
Die Verwendung von Albino - Mäuse (BALB / c und C57BL / 6-C 2j) für alle Hautbildgebungsstudien ist stark pigment induzierte Sprenkelung Verletzungen empfohlen zu vermeiden. Wenn Albino-Mäuse nicht verfügbar sind, die Verringerung der Laserleistung während der Bildaufnahme kann das Problem für pigmentierte Mäuse lindern. Jedoch kann eine weitere Optimierung erforderlich, da eine geringe Tiefe von Gewebepenetration in einem schlechteren Erwerb Ergebnis führen kann.
Die Ohrhaut ist sehr empfindlich; daher muss darauf alle Umstände vermieden werden, dasskann eine Entzündung hervorrufen. Beispiele für falsche Techniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die folgenden: 1) auf der Enthaarungscreme verlässt für eine übermäßige Zeitdauer, über das, was empfohlen; 2) Aufbringen übermßige Reibung auf das Ohr, wenn das Ohr durch den Schlitz des Ohres Abbildungsplattform bringt oder bei Lösen des Ohrs von dem Abdeckband; und 3) eine Überhitzung des Ohres, entweder wegen eines defekten Heizungsanlage oder einer unangebrachten Temperatur-Feedback-Sonde, die Umgebungstemperatur werden die Aufzeichnung kann anstelle der Maus Kerntemperatur.
Technische Änderungen und Fehlerbehebung
Die meisten der Fehlerbehebung an das Ohr Vorbereitungsverfahren im Zusammenhang wurde bereits 8 aufgeführt. Wenn das Ohr zu einem späteren Zeitpunkt nach der Reperfusion abgebildet wird, quillt das Ohr kann über die 0,5-mm - Spalt , der durch den Metallclip geschaffen , um die Dicke des Ohres (Figur 1) aufzunehmen. In diesem Szenario wird die Platzierung des Deckglases über das Ohrkann den Blutfluss behindern, was offensichtlich ist, wenn die makroskopisch sichtbare Blutgefäße aus dem Blickfeld verschwinden. Dies muss durch die Schaffung einer größeren Lücke zwischen dem Deckhalter und der Messing Plattform vermieden werden. Dies kann auf zwei Arten erfolgen, entweder manuell durch die Höhe der Deckträger (2) oder durch die Verwendung eines dickeren Metallklammer eingestellt wird .
Einschränkungen der Technik
In diesem Protokoll verwendeten wir Evans Blau die Position der ischämischen Zone zu ermitteln, da ein Austreten des Evans Blau in das Interstitium zu frühen Zeitpunkten nach der Ischämie die Grenze der ischämischen Zone markiert. Evans-Blau wird allgemein als ein Blutgefäß Markierungsmittel verwendet. Jedoch unter entzündlichen Bedingungen wird vaskulären Integrität stark beeinträchtigt. Daraus ergibt sich die Leckage von Evans Blue in das Interstitium. In diesem Modell beobachten wir einen drastischen Verlust von Kontrast zwischen Blutgefäßen und interstitium bald nach der Reperfusion. Als solche in studies wo Leukozyten-Endothel - Interaktionen beteiligt sind, empfehlen wir das Experimentieren mit anderen Blutgefäß Markierungsmittel in verschiedenen Größen (zB Dextrane, etc.).
Zukünftige Anwendungen
Neben Nutzung der LysM-eGFP Maus zu zeigen, wie Neutrophile Haut IR reagieren kann dieses Modell auch für die Untersuchung anderer Leukozyten-Reaktionen verwendet werden, die beide in infiltrieren (Monozyten) und in resident interstitielle (Makrophagen) Leukozyten. Dieses Modell kann auch auf andere Studien erweitert werden Blut und lymphatischen Integrität prüft sowie Leukozyten-Endothel-Interaktionen nach einer IR Verletzung. Gekoppelt mit der Fähigkeit, Kollagen als SHG-Signale durch MP-IVM sichtbar zu machen, wäre es auch interessant sein, zu Kollagen Integrität nach IR-Monitor oder während der Wundheilung. Zusammengefasst haben wir eine nicht-invasive, robustes Modell der IR für intravital Bildgebung zu untersuchen, um Immunreaktionen im Mausohrhaut eingerichtet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).
