Summary
このプロトコルは、磁石クランプを使用して、マウスの耳の皮膚上の虚血再灌流（IR）モデルの誘導を説明します。カスタム構築された生体イメージングモデルを使用して、我々は、in vivo炎症反応後の再灌流に留学します。この技術の開発の背後にある理論的根拠は、白血球が皮膚のIR傷害に応答する方法の理解を拡張することです。
Introduction
虚血再灌流障害（IRI）一過性低酸素症が原因で組織（再灌流）のその後の再酸素化に続いて血流（虚血）の障害物に存在する場合に発生します。皮膚では、虚血再灌流（IR）は、長時間の安静が負傷で長期入院患者を素因褥瘡の病態生理に貢献する要因の一つであると考えられています。これらの患者では、皮膚およびその下の筋肉の両方が絶えず、放置すれば、壊死1になることがあり、ローカライズ負傷で、その結果、骨隆起の領域の上に加わる重量圧力にさらされています。
IRIに関係する被害が2つある。虚血の間、血管の閉塞は、組織への酸素供給の大幅な低下をもたらします。これは、細胞の代謝に関与するATPアーゼを不活性化ATPおよびpHの低下をもたらします。ターンでは、細胞内カルシウムレベルは、スパイク、と強調またはcを損傷しましたellsは、アポトーシスまたは壊死2を受けます。細胞内の内容や損傷関連分子パターン（DAMP）のリリースは、HMGB1のように、炎症反応3に貢献しています。第二の侮辱は、再灌流の間に発生します。酸素およびpHレベルは、再灌流時に復元されているが、これは、細胞内の脂質、DNA、及びタンパク質の酸化をもたらす、反応性酸素種（ROS）の生成をもたらします。その結果、前炎症性メディエーターは、炎症部位2への免疫細胞の動員を伴う二次的炎症反応をオフ設定する、活性化されます。炎症反応に至る生化学的事象のカスケードが十分に説明されたが、免疫細胞の活動の空間的及び時間的調節は、十分に理解されていません。
ここでは、簡単なマグネットクランプを使用して、マウスの耳の皮膚に堅牢なIRモデルについて説明します。我々は、多光子生体イメージング（MP-IVM）と相まって再灌流が行われた後に発生するin vivoでの炎症反応を研究するためのモデルを確立しました。この技術の開発と利用の背後にある論理的根拠は、間質および浸潤細胞の両方をリアルタイムでIRへの対応方法を理解しようとすることです。
彼らはそれらをより少なくより理想的な免疫学的研究4のための作り、皮膚の側腹部に鋼板の外科的移植を必要とする皮膚の脇腹にクランプ技術を用いて、IRの既存のモデルは、非常に侵襲的です。同様の非侵襲的なクランプ技術は、マウス皮膚フランク5,6に記載されています。それは、呼吸による動きを回避し、7,8を画像化する時の安定性を提供していますようにしかし、この方法では生体イメージングコンポーネントを組み込むのは、代わりに、対象となるIRサイトとして耳の皮膚を選びました。また、間質にまたがる白血球サブセットはあるが、耳の皮膚と皮膚フランク間で同一であります数字と割合はわずか9を異なる場合があります。したがって、耳の皮膚は、理想的な撮像部位を表します。
また、これらのIRIモデルから取り出され、ほとんどのデータは、巨視的評価（潰瘍のグレーディング）とエンドポイントの炎症の指標10の顕微鏡分析に限定されています。このモデルを用いて、蛍光レポーターマウスの皮膚における再灌流後の好中球の細胞応答のリアルタイム可視化が有効になっています。以前に公開された生体内耳イメージングモデルは、追加の修飾（ 図1、図2）を用いて8に使用されます。
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Protocol
生きた動物を扱うすべての実験は、関連するすべての動物の使用およびケアガイドラインと規則に基づいて行われました。
蛍光レポーターマウスの1選択
- 6〜12週齢のLysM-EGFP 11マウス（男性または女性のいずれかについて問わない）を使用します。
注：様々な細胞特異的蛍光レポーターマウスの使用は、in vivoで異なる免疫細胞の可視化を可能にします。この株は、単球（GFPのLO細胞 ）、および皮膚のマクロファージ（GFPのLO細胞 ）を可視化することができる、循環好中球（GFP hi細胞）を循環します。撮像パラメータを使用すると、GFP陽性好中球からの唯一の明るい信号が検出されます。
注：皮膚イメージング研究のこのタイプに適した免疫細胞特異的蛍光レポーターマウス株のリストは文献8に見出すことができます。
注：非常pigmenとして、アルビノマウスはイメージングのために使用することをお勧めしますテッドマウスは、光損傷になりやすいです。着色された耳の皮膚が（組織の燃焼を示す）レーザ誘起スペックルにはるかに敏感であるためです。結果として、好中球の動員および蓄積も定常状態8,12の間に観察されてもよいです。 - 12時間の明暗サイクルの特定の病原体を含まない（SPF）条件下でマウスを保管してください。
2.マウスの麻酔
- 15 mgのmLの-1ケタミンおよび1mg ml -1の滅菌水に溶解したキシラジンの混合物からなるケタミン-キシラジン（8μLのグラム-1体重）の腹腔内注射でマウスを麻酔。
- 調製手順全体で、37℃でその体温を維持するために加熱パッド上にマウスを置きます。つま先ピンチ反射の欠如を観察することにより、十分な麻酔のために確認してください。
注：最初の一時間後、麻酔薬のその後の四半期の用量を皮下投与する必要がありますdは約0.5時間ごとに続きます。ウィスカーのけいれんや尾も麻酔がオフに着用し、トップアップが必要であるとされていることを示すことができます。 - 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に眼科潤滑剤を使用してください。
3.脱毛
- 綿チップアプリケーターを使用して、背側のマウスの耳の上部の三分の二に脱毛クリームを慎重に適用されます。
- 徹底したが、穏やかな方法で湿った綿チップアプリケーターを使用してクリームを削除する前に3分 - 2のを待ちます。
注：それは炎症13,14を誘導することができるように、脱毛クリームが長すぎるために、マウスの耳に滞在しないようにしてください。
虚血および再灌流障害の4誘導
- マウスの耳皮膚における虚血を誘導するために、直径12mm×2ミリ厚の金メッキ、N42グレードのネオジム磁石を使用し、約3,000のガウス定格。
注：この場合、磁石のディンプル顔が電王TESそのN極。 - 個々のプラスチックガイドに磁石をスロット。
注意：プラスチック製ガイドは、高強度の磁石の配置および分離を容易にするのに役立ちます。それらの強力な磁力破損し、まだ低抵抗のために、相互に、または他の金属に近接して個々の磁石を配置しないでください。彼らは互いの方向に引っ張った場合に破損や分裂が発生することがあります。 - 唯一のエッジが第二（腹側）の磁石（ 図3a）に接触するように第1（背側）の磁石を配置
注：これは、彼らが適切に配置されている前に一緒にスナップから磁石を防ぐことができます。 - 腹側の磁石が耳（ 図3a）に平らになるように両方の磁石を配置します。
注：虚血が誘導される前に、マウスを37℃に維持され、その十分な麻酔が（ステップ2.2参照）が維持されていることを確認してください。 - 準備ができたら、慎重に（ 図3a磁石が一緒に来てみましょう注：IR及び非IR領域を観察できるように、画像化目的のために、耳の半分だけをクランプ。
- 虚血の1.5時間後、再灌流が行わできるように、プラスチック製のガイドを使用して互いに離れる磁石をねじることによって磁石を削除します。
注意：注意は、磁石が配置されたときにしわから耳を防ぐために注意しなければなりません。肉眼で見える主要な血管が直ちに再灌流場合不完全虚血は明らかである磁石が除去された後（ すなわち、血液は直ちに血管を埋めます）。再灌流は、磁石を除去した直後に発生していないが、血管閉塞は、一過性です。このように、迅速に、可能な画像化するためのマウスの耳を調製することが不可欠です。
血管標識剤の5インジェクション
- すぐに磁石を除去した後、エバンスブルー（10mgのミリリットル（眼窩後または尾静脈注射を介して）を静脈内投与し-1PBSまたは生理食塩水で。 1μLのグラム-1体重）または選択した別の血管標識剤。
注：注射する前に、十分な麻酔がまだピンチ穏やかなつま先を実行することによって維持されていることを確認してください。
イメージングプラットフォーム上で耳の6配置
- テープに長さ1.5センチ、幅1.8センチマスキングの2枚をカット。
- 接着剤の側面は、その幅に沿って接着剤の約1ミリメートルを残しながら、一緒に固執することができます。
- 耳のプラットフォーム上のスリット内にその配置に対応するために、長さ方向、二つにマスキングテープをカットします。
- 接着面が上を向くように、スリットの途中については、このマスキングテープを挿入します。
- 加熱パッド上にマウスを置き、画像化されるの耳はマスキングテープストリップの隣ようなものであること。
- 2 PBSで湿らせたコットンチップアプリケーターを使用して、静かに接着剤ストリップに対して耳を押してください。
- ガイドとしてストリップを使用して、マウスの耳をもたらしますスリットから同時に近いステージに向かってマウスを調整しながら。
- 粘着テープを削除するには、最初のテープの接着性を減少させるためにPBSのドロップを追加します。
- 細かい絵筆を使ってできるだけ穏やかマスキングテープからのマウスの耳を区切ります。
- そっと耳の上に湿った綿チップアプリケーターを圧延することによって耳のプラットフォームに対して耳を平らに。
- （グリースを使用して、カバースリップホルダーの位置に保持されている; 図2）カバースリップの下にPBSのドロップを入れて、そっと耳の上に置きます。必要に応じて、より多くのPBSでトップアップ。
注意：カバースリップホルダーは、撮影時の安定性を高めます。 - 直腸温度プローブを挿入し、製造元の指示に従って加熱システムに配線を接続します。
注：37°Cにボディ加熱パッドの温度と35℃に耳ステージプラットフォームを設定します。
7.多光子顕微鏡セットアップおよびイメージングパラメータ
注：このプロトコルは調整可能で、多光子顕微鏡を単一のビームを使用しています（680 - 1080 nm）でのTi：サレーザー（3.3 W nmの800で、140フェムト秒のパルス長、80 MHzの繰り返し率）20X水目的とした数（NA = 1.0）生体内イメージング研究のために。
- イメージングソフトウェアを開きます。
- 製造元の指示に従ってレーザーを合わせます。
- 950 nmの励起波長を調整します。
注：GFPとエバンスブルーは、950 nmで同時に励起することができます。 - 500μmの2 scanfield、505 X 505ピクセルの解像度、および単一ラインスキャンで800ヘルツの走査周波数：プレビューするには、次の設定を使用します。 「プレビュー」をクリックします。
- 減衰器（レーザー）の電源を切り替えます。熱損傷を引き起こす可能性がある、すべての重要な信号はレーザパワーの過剰な量に撮像視野を公開せずにピックアップされることを確認してください。
注：場合は、低減衰器の電力で起動し、増加シグナlは薄暗いです。早い時点での間質の再灌流後の点からの好中球が存在しないであろうように、前者は、好中球より調光されているように、マクロファージは、必要最小限の電力を決定するためのゲージとして使用することができます。
注：このステップは、初めて実行する場合は、無傷の血管の完全性が期待されている非虚血性ゾーン、で設定を調整し、減衰力の設定を容易にします。レーザー出力が不安定でない限り、その後の実験では、これらの設定は、多くの変更を必要としません。 - PMTの設定を調整します。
注：PMTのための最大の最適なゲイン電圧については、製造元に確認してください。推奨される閾値を超えてPMT電圧を設定すると、より高い信号対雑音比をもたらすであろう。一般的な推奨事項は、信号があまりにも暗くなるべき推奨閾値にPMTのゲインの電圧を設定するために、必要に応じて減衰力を増大させることです。 - に近接している撮像領域を選択します大規模なエバンスブルー漏出することを特徴と虚血のエッジ、。
- GFPは、それぞれ、50分の525のバンドパス（BP）と655/40 BPフィルターを使用して、エバンス青の信号を収集します。第二高調波発生のための真皮区画内のコラーゲン繊維の（SHG）信号、42分の475 BPフィルターを使用しています。
- 使用可能な画像解析ソフトウェアの互換性のある形式で画像を保存するフォルダを作成します。
- 500μmの2 scanfield、505 X 505ピクセルの解像度、および単一ラインスキャン中の走査周波数は400Hz：取得するには、次の設定を使用します。
- 4ミクロンのステップサイズで100ミクロンのzスタックは、好中球浸潤をモニターするために、1分間隔で、時間をかけて繰り返して取得することができます。
注：特に高い遊走速度、細胞トラッキング分析中に困難をもたらす可能性がより長く1分である間隔で、白血球（ 例えば、好中球）のために。この場合、ユーザは、いずれかの交流の厚さを減少させることができます走査周波数をquisitionスタックまたは増加。
注：虚血性ゾーンの必要な取得スタックが（あるいはより高いSHG強度を特徴とする）圧縮の結果として、小さく見えるかもしれないが、その後の再灌流は耳を膨潤させる大規模な炎症になります。 Z方向の大幅なドリフトが期待されています。このように、大zスタックの取得は、ドリフトに適応する必要があります。 - イメージングを通して、しっとりとした水に浸漬対物レンズ耳を保つために定期的にPBSおよび水をトップアップ。
注：典型的な実験は、通常、2続く - 4時間。実験デザインに応じて、十分に制御された麻酔体制と相まって、イメージングの期間を延長することは可能です。
8.実験の終了
- 広報機関の施設内動物管理使用委員会（IACUC）に従って、二酸化炭素窒息によりマウスを安楽死させますocedures。
注：金融機関の規則、規制、ガイドラインによって決定されるように、必ず承認された方法により、マウスを安楽死させます。繰り返しイメージングが必要な場合は、麻酔が切れるまで、加熱パッド上でマウスを保持します。マウスが十分な意識を取り戻し、モバイルになっていたら、そのケージにマウスを返します。
9.画像解析
注：イメージング実験から生成されたデータが別のソフトウェアパッケージで可視化することができます。
- 画像解析ソフトウェアを開きます。
- 下のファイルをインポートし、モードを突破（オープン→は「開く」をクリックし任意のフォルダ→内の任意のファイルを選択します）。
- 編集偽色デフォルトの色が適用されない場合（チャネル]タブで[編集]→ディスプレイの調整→は、カラーパレットから希望の色を選択します）。
- 明るさ、コントラスト、バックグラウンド（トグル最大と最小値→[編集]→[表示調整）を調整します。 ファイルのサイズが正しいことを確認します（[編集]→[画像のプロパティ→ジオメトリ]タブの下で、ボクセルサイズをご確認ください。このプロトコルでは、X = 150、Y = 150、およびZ = 4）。
注：ピクセル解像度によってscanfield寸法を分割することによって、XとYを求めよ。 Zは、各スライスの間の厚さです。
注：これらのデータ・セットの出力が最大値投影動画として提示することができます。
注：トラッキング分析は完全にin vivoでそれらの機能を理解するために、細胞活動との相互作用を特徴づけるために必要とされます。ソフトウェアで利用可能なスポット関数を使用して、細胞トラッキングの詳細な手順については、リファレンス15内のプロトコルに記載されています。
注：リファレンス16でのレビュー記事に記載されています詳細は白血球遊走を定量化する多くの方法があります。
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Representative Results
図1に示すように、このプロトコルは、特注の耳の皮膚画像化プラットフォームを使用します。このプラットフォームのいくつかの特徴は、特に、生理学的設定を維持しながら、撮像を容易にするように設計されています。加熱された真鍮製のプラットフォーム上で耳を配置すると、35℃の生理的温度で耳を維持するが、それはまた、呼吸のために避けられない動きから耳を隔離するだけでなく。真鍮のプラットフォーム上に金属クリップの添加により中断されない血流を維持すること、耳の重量を発揮カバースリップホルダーを防止するためにギャップを作成します。ステージプラットフォームはまた、イメージング手順の間、37℃でマウスを維持し、加熱パッドを収容するように設計されています。
カバースリップホルダー（ 図2）は、カバースリップは、真空のGreAの助けを借りて金属ホルダに取り付けできるように設計されていますSE。カバーガラスホルダは、アダプタの助けを借りて、縦軸、横軸フレキシブル調整を可能にスタンドに接続されています。この方法では、ユーザが最初に正確に耳の上にカバーガラスの位置を調整し、続いて、アダプタのネジを締めて、その位置を修正することができます。
このプロトコルでは、我々は、虚血および再灌流をシミュレートするための磁石の使用を記載しています。 図3bに表示された代表の前に耳の景色とすぐに虚血後。生理的条件下で、主要な血管が巨視的に可視化することができます。磁石のピンチ効果を一時的に磁石が除去される一過性ブランチング効果（黒矢印）で観察することができる血流を生じます。
この特定のデモでは、イメージングは虚血性ゾーン（ 図3cの端に焦点を当てています図3d）。これは、生体内イメージング研究のための重要なランドマークを作成し、独立した実験の間の一貫性を維持するのに役立ちます。
データは、IR傷害に応答して、虚血領域のエッジの内側を覆う無傷の血管から間質への好中球出口を浸透させることを示し、損傷部位（ 図3d ムービー1）に向かって移動します。原因以前の時点再灌流後に実行可能な灌流血管の不足のために他の炎症モデルに比べて、私たちは、間質への移行の好中球の遅延応答を期待しています。完全にこれらの細胞を特徴づけるために、ウラル活動、細胞追跡分析は、 インビボでそれらの機能を理解するために使用することができます。スピードは、変位を意味し、走化性指数は、細胞追跡分析から得ることができる潜在的なリード・アウトのいくつかです。
図生体内多光子イメージングのためのカスタムメイドの耳の皮膚のステージの1模式図です。 （a）は、その寸法の耳の撮影台の上から見た図。 （b）は正面図と寸法。真鍮プレートは、プラットフォームに安定性を提供するために、両側に厚いことに注意し、中央が薄く、皮膚との接触面積を最小にするために、耳は、スリットのエッジの上に折り畳まれているときに中断されない血流を確保しプラットフォーム上で休みました。フィードバックプローブをダウンピンの湾曲ホルダーの（c）は側面図。加熱パッドをすることができますマスキングテープ（図示せず）を使用してプラットフォーム上に固定しました。リーら 、Nat Protoc、2012 8から修正されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.デザインカバースリップホルダーの。サイドとトップビュー。カバーグラスホルダーが固定位置にカバースリップを保持し、したがって、zのドリフトを低減します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. IRモデル。 （A）の磁石の配置を示す模式図。 （B） （C）磁石が置かれていた場所に対する撮影領域を示す耳の概略図。 （D）のLysM-EGFPマウスにおける好中球の浸潤後の再灌流を示すタイムラプスシーケンスから最大強度のz投影スナップショット。 HHに示す経過時間：mm形式で。スケールバー：100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ムービー1. IR傷害における好中球の募集。虚血の1.5時間後のLysM-EGFPアルビノマウスの耳皮膚における再灌流に応答して、好中球（緑）の浸潤を示す最大突起のタイムラプスシーケンス。以前の時点で、不足エバンスブルー信号（赤）は、虚血後の一時的な血管閉塞を示しています。コラーゲン（青、第二高調波発生）。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 （ダウンロードするには、右クリックします。）
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Discussion
意義
IRは、皮膚褥瘡の主要な原因の一つです。 （下層の皮下組織と筋肉と比較して）褥瘡の初期段階（IおよびII）は、ヒトの皮膚の状態を記述する。しかしながら、免疫学的病因の理解がまだ不足しています。ここでは、このギャップに対処するために、マウスの耳の皮膚上で簡単かつ堅牢なIRモデルを提示します。我々は2つの磁石と、その後磁石の除去（再灌流）の後に下流免疫応答を研究する間、マウスの耳をクランプすることによって虚血をシミュレートします。虚血を誘導する、一定時間毎の耳に一定の圧力を生成するために磁石を使用することによって、我々は、実験間の再現性と一貫性を確保することができます。
この非侵襲IRモデルの強さは、また生体内イマジンの十分に確立されたモデルを利用して、インビボ免疫応答を 、リアルタイムで、実証する能力であります皮膚フランク手順と比較して、撮像中に、より安定性を提供しています耳皮膚のグラム。現在のスキンフランクモデルのいくつかは、皮膚4の免疫風景を変更することができるの外科的処置を必要とします。呼吸運動は5,6を撮像中の動きに関連したアーティファクトに寄与することができるように加えて、皮膚フランク自体を画像化することは、技術的な課題を提示します。私たちの現在のモデルは、これらの問題を回避します。
IRへの免疫細胞の生理学的応答を研究することに加えて、このモデルはまた、糖尿病は、酸化ストレスの増加を介してIR傷害を悪化させる場合があり、糖尿病などの病態生理学的設定に適用することができます。免疫応答を理解することは、創傷治癒の理解に貢献していきます。
重要なステップ
マウスは麻酔下になると、温度調節が損なわコア体温が急激に低下します。関数hypotを防止するために、ハーミアは、外部加熱を37℃で中核体温を維持するために不可欠です。 2℃と35℃に保たれなければならない - 体コアに遠位に位置する耳は、生理的に1によってクーラーです。加熱中のこの一貫性はまた、細胞動態の再現性の読み取りアウトを保証します。これと同時に、加熱システムは、マウスが麻酔の全長にわたってにわたって加熱ないことを保証するためにチェックしなければなりません。
すべての肌イメージング研究のためのアルビノマウス（BALB / cおよびC57BL / 6-C 2J）の使用は、高度に顔料に誘導されるスペックルの傷害を避けることをお勧めします。アルビノマウスが使用できない場合、画像取得時のレーザパワーの減少は着色されたマウスのための問題を軽減することができます。組織浸透の減少深さが劣る取得結果をもたらすことができるしかし、さらなる最適化は、必要とされ得ます。
耳の皮膚は非常にデリケートです。したがって、ケアは、どのような状況を避けるようにしなければならないこと炎症を引き起こす可能性があります。不適切な技術の例としては、これらに限定されないが、以下：1）推奨されるものを超える時間の過剰量のために脱毛クリームを残します。耳のイメージングプラットフォームのスリットから耳を持って来るとき、またはマスキングテープから耳を取り外すとき2）耳に過度の摩擦を適用します。および3）のいずれかにより、障害のある加熱システムまたは周囲温度の代わりに、マウスのコア温度を記録することができる見当違いの温度フィードバックプローブに、耳を過熱。
修正およびトラブルシューティング
耳の調製手順に関連するトラブルシューティングの大部分は、以前8にリストされています。耳の後の時点後の再灌流時に結像される場合に、耳は、耳（ 図1）の厚さを収容するために金属クリップによって作成された0.5mmのギャップを超えて膨潤することができます。このシナリオでは、カバーガラスの配置は、耳の上肉眼で見える血管が視界から消えたときに明らかである血流を、妨げることがあります。これは、カバースリップホルダーと真鍮のプラットフォーム間に大きなギャップを作成することによって回避されなければなりません。これは、手動でカバースリップホルダー（ 図2）の高さを調節することによって、または厚い金属クリップを使用することによってのいずれかで、2つの方法で行うことができます。
テクニックの制限事項
間質におけるエバンスブルーの漏洩は初期の時点虚血後に虚血領域の境界をマークするため、このプロトコルでは、我々は、虚血領域の位置を決定するために、エバンスブルーを使用しました。エバンスブルーは、一般的に血管ラベリング剤として使用されます。しかし、炎症状態の下で、血管の整合性がひどく損なわれています。これは、間質へのエバンスブルーの漏洩につながります。このモデルでは、我々はすぐに再灌流後の血管と間質との間のコントラストの大幅な損失を観察します。このように、STの白血球-内皮相互作用が関与しているところudies、我々は、異なるサイズの他の血管標識剤を試してお勧めします（ 例えば、デキストラン、 など 。）。
将来の応用
好中球が皮膚のIRへの対応方法を示すことのLysM-EGFPマウスを利用することに加えて、このモデルは、（単球）の浸潤に常駐間質（マクロファージ）白血球の両方で、他の白血球の応答を研究するために使用することができます。このモデルは、IR傷害後の血液およびリンパの整合性、並びに白血球 - 内皮相互作用を調べる他の研究に拡張することができます。 MP-IVMを通じてSHG信号としてコラーゲンを視覚化する能力と相まって、また、IR後または創傷治癒中のコラーゲンの整合性を監視するために興味深いものになるだろう。要約すると、我々は、マウスの耳の皮膚における免疫応答を研究するために、生体内イメージングのためのIRの非侵襲性、堅牢なモデルを設定しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
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