Summary
Bu protokol mıknatıs sıkma kullanarak fare kulak cilt üzerinde bir iskemi-reperfüzyon (İR) modeli indüksiyon açıklar. Özel bir dahili Intravital görüntüleme modeli kullanarak, in vivo inflamatuvar yanıt sonrası reperfüzyon eğitim. Bu tekniğin gelişiminin arkasındaki mantık lökosit cilt IR hasarı nasıl cevap anlayışı yaygınlaştırmaktır.
Introduction
geçici hipoksi nedeniyle dokuların (reperfüzyon) bir sonraki yeniden oksijenlenme ardından kan akışının (iskemi) tıkanması olduğunda iskemi reperfüzyon hasarı (IRI) oluşur. Deride, iskemi-reperfüzyon (İR) uzun süreli yatak istirahati yaralanma uzun vadeli hastane hasta yatkınlık basınç ülserlerinin patofizyolojisi, katkıda bulunan faktörlerden biri olduğu düşünülmektedir. Bu hastalarda, deri ve alttaki kaslar hem sürekli, tedavi edilmediği takdirde, nekrotik 1 olabilir lokalize yaralanmalarla sonuçlanan, kemikli öne alanları üzerine uygulanan ağırlık basınca maruz kalmaktadır.
Bir IRI katılan zarar iki yönlüdür. iskemi sırasında kan damarlarının tıkanması dokulara oksijen dağılımının ciddi bir düşüşe yol açar. Bu hücre metabolizmasında rol oynayan ATPazlar inaktive ATP ve pH, bir azalma ile sonuçlanır. Buna karşılık, hücresel kalsiyum düzeyleri başak ve stresli veya c hasarlıarşın apoptosisi ve nekrosisi 2 geçer. Hücre içi içeriğinin veya hasar ilişkili moleküler desenleri (DAMP) serbest bırakılması, HMGB1 gibi, inflamatuar yanıt 3 katkıda bulunur. İkinci hakaret reperfüzyon sırasında oluşur. oksijen ve pH düzeyleri reperfüzyon sırasında geri edilir olsa da, bu, hücre içi lipidlerin, DNA ve protein oksidasyonuna neden reaktif oksijen türlerinin üretimi (ROS) ile sonuçlanır. Sonuç olarak, pro-enflamatuar medyatörler enflamatuar bölge 2 bağışıklık hücrelerinin alınmasını içeren ikinci bir enflamatuvar yanıtı tetikler olan aktif hale gelir. enflamatuvar yanıta yol açan biyokimyasal olay zincirinin de tarif edilmiş olmakla birlikte, immün hücre faaliyetlerinin uzamsal ve geçici ayarı iyi anlaşılmış değildir.
Burada, basit mıknatıs sıkma kullanarak fare kulak cilt üzerinde sağlam bir kızılötesi modeli açıklanmaktadır. multiphoton intravital görüntüleme (MP-IVM) ile birleştiğinde, bizreperfüzyon gerçekleşir sonrasında meydana in vivo enflamatuar yanıtları incelemek için bir model oluşturdu. Bu tekniğin geliştirilmesi ve kullanımı arkasındaki mantığı interstisyel ve infiltre hücreler hem gerçek zamanlı IR nasıl tepki anlamaya çalışmaktır.
Onlar immünolojik çalışmalar 4 için az daha ideal hale getirerek, cilt kanadını çelik levha cerrahi implantasyon gerektiren cilt kanadında sıkıştırma tekniğini kullanarak IR mevcut modeller, son derece invaziv. Benzer bir invasif olmayan sıkıştırma tekniği fare deri dış yan yüz 5,6 tarif edilmiştir. O nefes nedeniyle hareketlerini circumvents ve 7,8 görüntüleme sırasında istikrar sunuyor Ancak, bu yöntemde intravital görüntüleme bileşeninin birleşmesinin, bunun yerine, hedeflenen IR sitesi olarak kulak cildi seçti. Ayrıca, interstisyuma kapsayan lökosit alt-gruplar da, kulak, deri ve deri kanadı arasındaki özdeşsayılar ve oranlar biraz 9 değişebilir. Böylece, kulak cilt ideal bir görüntüleme bölgesini temsil eder.
Ayrıca, bu IRI modellerden alınan çoğu veri makroskopik değerlendirmeler (ülserlerin derecelendirme) ve son nokta inflamatuar göstergelerin 10 mikroskopik analizler sınırlıdır. Bu modeli kullanarak, bir flüoresan raportör fare deri reperfüzyon sonrası nötrofillerin hücre tepkisinin gerçek zamanlı görsel etkindir. Önceden yayınlanmış intravital kulak görüntüleme modeli ek modifikasyon (Şekil 1, 2) ile 8 kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
canlı hayvan ile ilgili tüm deneyler ilgili tüm hayvan kullanımı ve bakımı kurallarına ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmıştır.
Floresan Muhabir 1. Farelerin Choice
- 6- 12 haftalık LysM-eGFP 11 fare (erkek ya da kadın ya hiçbir tercih) kullanın.
Not: Çeşitli hücreye spesifik flüoresan raportör farelerin kullanılması in vivo olarak farklı bağışıklık hücrelerinin görselleştirme sağlar. Bu soyda, görselleştirilebilir monositler (GFP lo hücreleri), ve dermal makrofajlar (GFP lo hücreleri) dolaşan nötrofiller (GFP yüksek hücreler) dolaşımdaki. görüntüleme parametreleri kullanılan ile, GFP pozitif nötrofillerden sadece parlak sinyaller tespit edilecektir.
Not: Cilt görüntüleme bu tip çalışmalar için uygun olan immün hücreye spesifik raportör fare suşlarının bir listesi Referans 8 bulunabilir.
Not: son derece pigmen gibi, albino fareleri görüntüleme için kullanılması önerilirted fareler fotohasar daha yatkındır. pigmentli kulak derisi (doku yakma gösterir) lazer kaynaklı speckling çok daha hassas olmasıdır. Bunun bir sonucu olarak, nötrofil çoğalması ve biriktirme daha kararlı durum 8,12 sırasında görülebilir. - 12 saatlik aydınlık ve karanlık döngüsü ile belirli bir patojen içermeyen (SPF) koşullarda fareler tutun.
2. Fare Anestezi
- Steril su içinde çözülmüş 15 mg mL karışımı -1 ketamin ve 1 mg ml -1 ksilazin oluşan ketamin-ksilazin (8 uL g-1 vücut ağırlığı) bir intra-peritonal enjeksiyon, ile fare anestezisi.
- Hazırlık işlem boyunca 37 ° C de vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerinde fare yerleştirin. Bir ayak tutam refleks yokluğu gözlemleyerek yeterli anestezi olup olmadığını kontrol edin.
Not: ilk bir saat sonra, anestezi sonraki çeyrek dozları deri altından uygulanan bir gerekecektird yaklaşık 0,5 saat her sürecek. bıyık ya da kuyruk seğirmesi de anestezi kapalı giyiyor olduğunu ve bir kontör gerekli olduğunu gösterebilir. - anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri oftalmik yağ kullanın.
3. Depilasyon
- Dikkatle pamuk uçlu aplikatör kullanarak dorsal fare kulağın üst üçte ikisi tüy dökücü krem uygulayın.
- kapsamlı ama nazik bir şekilde ıslak pamuk uçlu aplikatör kullanarak krem çıkarmadan önce 3 dakika - 2 bekleyin.
Not: inflamasyonu 13,14 neden olabilir tüy dökücü krem, çok uzun süre fare kulağı kalmak için izin vermeyin.
İskemi ve Reperfüzyon Hasarı 4. İndüksiyon
- fare kulak deride iskemi ikna etmek için, 12 mm çap x 2 mm kalınlığında altın kaplama, N42 dereceli neodimyum mıknatıs kullanın ve yaklaşık 3.000 Gauss derece ile.
Not: Bu durumda, mıknatısların gamzeli yüzü Denotes kuzey kutbu. - bireysel plastik kılavuzlara mıknatıslar yuvası.
Not: plastik kılavuz yüksek mukavemetli mıknatısların yerleştirilmesini ve ayrılmasını kolaylaştırmak için hizmet vermektedir. Nedeniyle güçlü bir manyetik kuvvet kırılması henüz düşük direnç için, birbirleriyle ya da diğer metallere yakın bireysel mıknatıslar koymayın. Birbirlerine doğru çekin eğer hurda ve dağılma oluşabilir. - Sadece kenar, ikinci (alt) mıknatıs (Şekil 3a) ile temas içinde olduğu şekilde, ilk (dorsal) mıknatıs yerleştirin
Not: Bu düzgün yerleştirilmiş önce birlikte yakalamaya gelen mıknatıslar engeller. - Ventral mıknatıs kulak (Şekil 3a) düz yatıyor öyle ki her iki mıknatıslar yerleştirin.
Not: iskeminin neden olduğu önce, fare, 37 ° C 'de tutulur ve bu yeterli anestezi (adım 2.2) muhafaza edilmesini sağlar. - Hazır kez dikkatlice (Şekil 3a mıknatıslar bir araya gelsin Not: Görüntüleme amaçları doğrultusunda, bir IR olmayan IR bölgesi görülmektedir, böylece kulak sadece yarısını kelepçe.
- iskemi 1.5 saat sonra, reperfüzyon gerçekleşecek sağlayan, mıknatıslar birbirinden uzağa büküm plastik kılavuzları kullanarak mıknatıslar kaldırın.
Not: Bakım mıknatıslar konulduğunda kırışmasını kulakları önlemek için alınmalıdır. Mıknatıslar kaldırıldıktan sonra makroskopik olarak görülebilen büyük kan damarları (yani, kan derhal damarları doldurur) hemen-perfuse re eksik iskemi açıktır. reperfüzyon mıknatıslar çıkarılmasından hemen sonra meydana gelmez, ancak, damar tıkanıklığı, sadece geçicidir. nedenle, mümkün olduğunca hızlı görüntüleme fare kulak hazırlamak için zorunludur.
Kan Gemi Etiketleme Ajanlar 5. Enjeksiyon
- Hemen mıknatıs çıkarılmasından sonra, Evans mavisi (10 mg mL (retroorbital veya kuyruk ven enjeksiyon yoluyla) intravenöz yönetmek -1PBS veya tuzlu su içinde; 1 uL g -1 vücut ağırlığı) ya da seçtiğiniz başka bir kan damarı etiketleme ajanı.
Not: Enjeksiyon öncesinde yeterli anestezi hala yumuşak ayak sıkıştırma fonksiyonunu gerçekleştirerek tutulmasını sağlar.
Görüntüleme Platformunda Kulak 6. Yerleştirme
- bantlamayın uzunluğunda 1.5 cm genişliğinde 1.8 cm maskeleme 2 adet kesin.
- Yapışkan kenarları genişliği boyunca yapıştırıcı yaklaşık 1 mm terk ederken birbirine yapışmasına izin verin.
- Kulak platformda yarık içindeki yerleşimi karşılamak için, boylamasına ikiye maskeleme bandı kesti.
- yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde, yarıktan hakkında yarım bu maskeleme bandı takın.
- ısıtma yastığı fare yerleştirin yansıması kulak maskeleme bandı şeridi yanında böyle olduğunu.
- İki PBS nemlendirilmiş pamuk uçlu aplikatör kullanarak, yavaşça yapışkan bant karşı kulağını basın.
- Bir kılavuz olarak şeridi kullanarak, fare kulağı getirmekyarıktan aynı anda yakın sahnede doğru fareyi ayarlarken.
- yapışkan bant kaldırmak için, öncelikle bant yapışkanlığını azaltmak için PBS bir damla ekleyin.
- ince bir fırça kullanarak yavaşça mümkün olduğu kadar maskeleme bandı fare kulağı ayırın.
- hafifçe kulak üzerinde nemli pamuk uçlu aplikatör yuvarlayarak kulak platformu karşı kulak düzleştirin.
- (Gres ile lamel tutucu pozisyonda tutulur; Şekil 2) lamel altına PBS bir damla koyun ve yavaşça kulağına üzerine yerleştirin. Gerekirse daha fazla PBS ile kontör.
Not: lamel tutucu görüntüleme sırasında stabiliteyi arttırır. - rektal sıcaklık probu yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre ısıtma sistemine telleri bağlamak.
Not: 37 ° C vücut ısıtma yastığı sıcaklığı ve 35 ° C, kulak sahne platformundan ayarlayın.
7. multiphoton Mikroskop Setiyukarı ve Görüntüleme Parametreleri
Not: Bu protokol tunable ile multiphoton mikroskobu tek bir ışın kullanır (680 - 1080 nm) Ti: Sa lazer (3.3 W nm 800; 140 fs darbe uzunluğu; 80 MHz tekrarlama oranı) 20X su amacı ile (NA = 1.0) intravital görüntüleme çalışmaları için.
- görüntüleme yazılımı açın.
- üreticinin talimatlarına göre lazer hizalama.
- 950 nm dalgaboyu ayarlayın.
Not: GFP ve Evans mavisi 950 nm aynı anda heyecanlı olabilir. - 500 mikron 2 scanfield, 505 x 505 piksel çözünürlük, ve tek bir satır tarama 800 Hz tarama frekansı: önizleme için aşağıdaki ayarları kullanın. "Önizleme" ı tıklayın.
- zayıflatıcı (lazer) güç değiştirir. tüm temel sinyaller ısı hasarına neden olabilir lazer gücü aşırı miktarda, Görüntüleme alanını maruz kalmadan aldı emin olun.
Not: Düşük zayıflatıcı güç başlayın ve signa eğer artışl loş. Erken zamanda interstisyum sonrası reperfüzyon işaret gelen nötrofiller yok olacak gibi eski nötrofiller daha sönük olduğu gibi, makrofajlar, gerekli minimum güç belirlemek için bir gösterge olarak kullanılabilir.
Not: Bu adım, ilk kez yapılması gereken ise, bozulmamış vasküler bütünlüğü beklenen olmayan iskemik bölgesi, ayarları ve zayıflatıcı güç ayarı kolaylaştıracaktır. lazer gücü kararsız değilse, bir sonraki deneylerde, bu ayarlar kadar değişiklik gerektirmez. - PMT ayarlarını yapın.
Not: PMT için maksimum optimum kazanç gerilimi üreticisine başvurun. Tavsiye eşiğin ötesinde PMT gerilimi ayarı daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı neden olacaktır. genel tavsiye tavsiye eşik PMT kazanç gerilimini ayarlamak ve sinyal çok loş olmalıdır gerektiği gibi zayıflatıcı gücünü arttırmaktır. - yakın bir görüntüleme bölge seçinmasif Evans mavisi sızıntı ile karakterize iskemi kenarı.
- GFP ve sırasıyla 525/50 bant geçiren (BP) ve 655/40 BP filtrelerini kullanarak Evans mavisi sinyalleri toplayın. dermal bölmesi içinde kollajen liflerinin ikinci harmonik üretimi (SHG) sinyalleri için, bir 475/42 BP filtresi kullanın.
- Mevcut görüntü analiz yazılımı uyumlu bir formatta görüntü kaydetmek için bir klasör oluşturun.
- 500 mikron 2 scanfield, 505 x 505 piksel çözünürlük, ve tek satır tarama tarama frekansı 400 Hz: elde etmek için, aşağıdaki ayarları kullanın.
- 4 um'lik bir adım büyüklüğü 100 mikron z yığın nötrofil infiltrasyonu izlemek için, 1 dakika aralıklarla, zaman içinde tekrar tekrar elde edilebilir.
Not: Özellikle yüksek bir göç hızı, hücre izleme analizi sırasında zorluklara neden olabilir en fazla 1 dakika olan bir aralık ile lökosit (örneğin, nötrofil) dir. Bu durumda, kullanıcı, AC kalınlığını azaltmakedinirken yığını veya tarama sıklığını artırmak.
Not: iskemik bölgenin gerekli alıcı yığını (alternatif olarak bir üst SHG yoğunluğuna sahip) sıkıştırmanın bir sonucu olarak küçük görünse de, daha sonra reperfüzyon kulak şişmesine yol açar büyük iltihaplanma ile sonuçlanacaktır. Z-yönünde önemli kaymalar beklenmektedir. Bu nedenle, büyük bir z-yığın elde edilmesi kaymalara gereklidir. - görüntüleme boyunca nemli ve suya batırılır objektif lens kulak tutmak için düzenli olarak PBS ve su kontör.
Not: Tipik bir deney genellikle 2 sürer - 4 saat. Deneysel tasarım bağlı ve görüntüleme süresini uzatılması mümkündür, iyi kontrollü anestezi rejimi ile birleştiğinde.
8. Deneme Sonlandırma
- pr kurumun Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) göre Karbondioksit boğulma fare Euthanizeocedures.
Not: Kurumun kuralları, yönetmelik ve yönergeler ile belirlenen Daima onaylanmış yöntemlerle fare euthanize. Tekrarlanan görüntüleme gerekiyorsa anestezi kapalı giyer kadar ısıtma yastığı fare tutmak. Fare yeterli bilinci yerine ve hareketli sonra, kendi kafesine fare dönün.
9. Görüntü Analizi
Not: Görüntüleme deneyden üretilen veriler farklı yazılım paketleri tarafından görüntülenmiştir olabilir.
- görüntü analiz yazılımı açın.
- Altında dosyayı içe, Mode Aşmak (Açık → "açık" Click istediğiniz klasöre → herhangi bir dosyayı seçin).
- Düzenleme sözde renkleri varsayılan renkler geçerli değilse (kanal sekmesinde Düzen → Ekran ayarı →, renk paletinden istediğiniz rengi seçin).
- parlaklık, kontrast ve arka plan (Değiştir Max ve Min değerleri → Düzenle → Ekran Ayarı) ayarlayın. Dosya boyutları doğru olduğundan emin olun (Düzenle → Görüntü özelliklerini → geometri sekmesi altında, voksel boyutunu kontrol edin. Bu protokolde, X = 0.99, Y = 0.99 ve Z = 4).
Not: piksel çözünürlüğe göre scanfield boyutu bölerek X ve Y türevi. Z'nin her dilim arasında kalınlığıdır.
Not: Bu veri setleri çıkış maksimum projeksiyon film olarak sunulabilir.
Not: Takip analizi tam in vivo fonksiyonlarını anlamak için hücresel faaliyetler ve etkileşimleri tanımlamak için gereklidir. yazılım mevcuttur nokta işlevini kullanarak hücre izleme ayrıntılı talimatlar Referans 15 protokol bulunabilir.
Not: Referans 16 derlemede bulunabilir olan birçok nicel lökosit göç yolları, ayrıntılar vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de gösterildiği gibi bu protokol, özel bir dahili kulak cilt görüntüleme platformu kullanıyor. Bu platformun çeşitli özellikler, özellikle fizyolojik ayarları koruyarak görüntüleme kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. ısıtmalı pirinç platformda kulak yerleştirilmesi sadece 35 ° C'lik bir fizyolojik sıcaklıkta kulağı tutar, ama aynı zamanda nefes nedeniyle kaçınılmaz hareketlerinden kulak izole eder. pirinç platformunda bir metal klibin eklenmesi ve böylece kesintisiz kan akışını sürdürmek, kulak ağırlık uygulayarak gelen lamel tutucu önlemek için bir boşluk oluşturur. sahne platformu da görüntüleme işlem boyunca 37 ° C'de fareyi koruyacak bir ısıtma yastığı karşılamak için tasarlanmıştır.
Lamel tutucu (Şekil 2) lamel vakum AYI yardımıyla metal tutucu üzerine bağlanmasına olanak verir şekilde tasarlanmıştırse. lamel sapı adaptörünün yardımı ile yatay ve düşey eksenlerde esnek uyum sağlayan bir stand bağlanır. Bu şekilde, kullanıcının ilk doğru kulağın üzerine lamel konumunu ayarlamak ve daha sonra bağdaştırıcı üzerindeki vidaları sıkarak o pozisyon düzeltebilirsiniz.
Bu protokol, biz iskemi ve reperfüzyon simüle etmek için mıknatıslar kullanımını tarif etmişlerdir. Şekil 3b görüntüler temsilcisi önce kulak görüş ve hemen iskemi sonrası. Fizyolojik koşullar altında, büyük kan damarları makroskopik görülebilir. mıknatıslar sıkıştığı etkisi geçici mıknatıslar kaldırılır geçici haşlama etkisi (siyah ok) tarafından görülebilir kan akışını kaynaklanıyor.
Bu özel gösteri, görüntüleme iskemik bölge (Şekil 3c kenarında odaklanmıştır (Şekil 3D). Bu intravital görüntüleme çalışmaları için önemli işaretlerini oluşturur ve bağımsız deneyler arasındaki tutarlılığı korumak için yardımcı olur.
Veri gösteriyor ki, bir IR hakaret yanıt, iskemik bölgenin kenar kaplama ve yaralanma sitesi (Şekil 3d ve Film 1) doğru göç sağlam kan damarlarından interstisyuma nötrofil çıkış infiltre içinde. nedeniyle erken zaman noktalarında sonrası reperfüzyon de uygulanabilir perfüze kan damarlarının eksikliği diğer inflamasyon modelleri ile karşılaştırıldığında gibi interstisyuma göç nötrofil gecikmiş bir yanıt bekliyoruz. Tam bu hücreyi karakterize etmeknitlerin aktiviteleri, hücre izleme analizleri, in vivo olarak fonksiyonlarını anlamak için kullanılabilir. Hız, deplasman ortalama ve kemotaktik indeksi hücre izleme analizinden elde edilebilir potansiyel okuma-çıkışları bazılarıdır.
Intravital multiphoton Görüntüleme için bir Ismarlama Kulak Cilt Sahne 1. şematik diyagramı Şekil. (a) boyutlarıyla kulak görüntüleme aşamasında üstten görünümü. (b) Ön görünüm ve boyutları. pirinç levha kulak yarığın kenarına katlanır kesintisiz kan akışının sağlanması, deri ile temas alanını azaltmak için, orta platforma stabilitesini sağlamak amacıyla, iki daha kalın ve ince olduğunu not edin ve platformda dinlenmiş. geribildirim probu aşağı pimleri kavisli sahibinin (c) Yandan görünüm. ısıtma yastığı olabilirmaskeleme bandı kullanarak platforma sabitlenmiş (gösterilmemiştir). Li ve diğ., Nat Protoc 2012 8'den modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Tasarım Lameli Holder; Yan ve Üst Görünüm. lamel tutucu sabit bir pozisyonda lamel tutar ve böylece z-sürüklenme azaltır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. IR Modeli. (A) şematik mıknatıs konumlandırma gösteren. (B) (C) şematik. (D) LysM-eGFP fare nötrofil infiltrasyonu sonrası reperfüzyon gösteren bir zaman atlamalı dizisi Maksimum yoğunluk z öngörülen anlık. Geçen süre ss gösterilen: mm formatında. Ölçek çizgisi: 100 um. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1. IR Hasarı Nötrofil İşe. iskemi 1,5 saat sonra LysM-eGFP albino fare kulak deride reperfüzyon cevaben nötrofil (yeşil) infiltrasyon gösteren maksimum projeksiyon A time-lapse dizisi. erken zaman noktalarında, eksikliğiEvans mavisi sinyali (kırmızı) iskemi sonrası geçici damar tıkanıklığı gösterir. Kollajen (mavi, ikinci harmonik üretimi). Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
önem
IR cilt bası yarası önde gelen nedenlerinden biridir. (Altta yatan derialtı dokularda ve kaslara kıyasla) Basınç ülserlerinin erken aşamalarında (I ve II) insan derisinin durumunu açıklar. Ancak, immünolojik etiyolojisinde bir anlayış hala yetersizdir. Burada, bu boşluğu gidermek için fare kulak ciltte basit ve sağlam bir IR modeli sunuyoruz. Biz mıknatıs kaldırma (reperfüzyon) sonra aşağı bağışıklık tepkilerini incelemek iki mıknatıs ve daha sonra aralarında fare kulağı sıkma ile iskemi simüle. iskemi uyaran, zaman belirli bir süre için her bir kulak üzerinde sabit bir basınç oluşturmak için mıknatıslar kullanarak, deneyler arasındaki tekrarlanabilirlik ve tutarlılığı sağlamak için edebiliyoruz.
Bu non-invaziv IR modelinin gücü de Intravital IMAGin bir köklü modeli kullanılarak in vivo bağışıklık yanıtı, gerçek zamanlı olarak, göstermek için onun yeteneği yatıyorcilt yan prosedürüne göre görüntüleme sırasında daha fazla istikrar sunmaktadır kulak derisi, g. Geçerli cilt yan modellerin bazıları deri 4 bağışıklık manzara değiştirebilir cerrahi girişimler içerir. Solunum hareketleri 5,6 görüntüleme sırasında hareket ile ilgili eserler katkıda bulunabilir Buna ek olarak, cilt kanadını kendisi görüntüleme, bir teknik meydan okuma sunuyor. Bizim şimdiki model bu sorunları circumvents.
IR bağışıklık hücrelerinin fizyolojik tepkileri çalışmalarının yanı sıra, bu model aynı zamanda diyabet artmış oksidatif stres ile IR yaralanma kötüleştirebilir diabetes mellitus gibi patofizyolojik ayarlara için geçerli olabilir. immün yanıtları anlamak yara iyileşmesi anlaşılmasına katkıda bulunacaktır.
kritik Adımlar
Fare anestezi altına alındıktan sonra, termoregülasyon engelli ve çekirdek vücut ısısının büyük ölçüde düşer edilir. hypot önlemekHermia dış ısıtma 37 ° C de iç vücut ısısını korumak için esastır. Vücut çekirdek distal bulunan kulak, 1 ile fizyolojik olarak soğuk olan - 2 ° C ve 35 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir. ısıtma Bu tutarlılık aynı zamanda hücre dinamikleri tekrarlanabilir okuma-çıkışları sağlayacaktır. Aynı zamanda, ısıtma sistemi, fare anestezi bütün uzunluğu boyunca aşırı ısıtma olmadığından emin olmak için kontrol edilmelidir.
Tüm cilt görüntüleme çalışmaları için albino fareler (BALB / c ve C57BL / 6-C 2J) kullanımı son derece pigment kaynaklı beneklenme yaralanmaları önlemek için tavsiye edilir. albino fareler mevcut değilse, görüntü alımı sırasında lazer gücünü azaltarak pigmentli fareler için sorunu hafifletmek olabilir. Doku penetrasyon azaltılmış derinliği zayıf alıcı sonuçlar elde edilebilir Ancak, daha fazla optimizasyon, gerekli olabilir.
Kulak cilt çok hassastır; dolayısıyla bakım herhangi durumları önlemek için alınması gerektiğiniinflamasyona neden olabilir. Uygun olmayan tekniklere örnek olarak, ancak bunlarla sınırlı değildir: 1) önerilmektedir ne üzerinde bir zaman aşırı miktarda ilgili tüy dökücü krem bırakarak; Kulak görüntüleme platformu yarık üzerinden kulak getirilirken veya maskeleme bandı gelen kulak sökerken 2) kulağa aşırı sürtünmeyi uygulanması; ve 3) nedeniyle hatalı ısıtma sistemi veya ortam sıcaklığı yerine fare çekirdek sıcaklığını kayıt olabilir bir yanlış sıcaklık geri besleme probu ya, kulak aşırı ısınma.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
Kulak hazırlama prosedürüne ilişkin sorun giderme çoğu daha önce 8 listelendi. Kulak daha sonraki bir zaman noktası sonrası reperfüzyon görüntülü ise, kulak kulağa (Şekil 1) kalınlığını karşılamak için metal klips tarafından oluşturulan 0,5 mm boşluk ötesinde şişebilir. kulağın üzerine lamel Bu senaryoda, yerleşimmakroskopik olarak görülebilen kan damarları görünümden kaybolur zaman açıktır kan akımını, engelleyebilir. Bu lamel tutucu ve pirinç platformu arasında büyük bir boşluk oluşturarak kaçınılmalıdır. Bu elle Lamel tutucu (Şekil 2) yüksekliğini ayarlayarak ya da kalın bir metal klipsi kullanarak ya da iki şekilde yapılabilir.
Tekniğin Sınırlamalar
interstisyumda Evans mavisi kaçak erken zaman noktalarında sonrası iskemi iskemik bölgenin sınırını işaretleri beri bu protokol, biz, iskemik bölgenin konumunu belirlemek için Evans mavisi kullanılır. Evans Mavisi genellikle kan daman işaretleme maddesi olarak kullanılır. Ancak, inflamatuar koşullar altında, damar bütünlüğü ciddi tehlikeye. Bu interstisyuma Evans Blue sızıntısı sonuçlanır. Bu modelde, yakında reperfüzyon sonrası kan damarları ve interstisyum arasındaki kontrast ciddi zarar görüyoruz. Bunun gibi, stlökosit-endotel etkileşimi söz konusu yerde udies, biz farklı boyutlarda diğer kan damarı etiketleme ajanları ile denemeler yapmanızı öneririz (örn dekstranlar, vb.).
gelecek Uygulamaları
Nötrofiller Cilt IR yanıt göstermek için LysM EGFP fare kullanılarak Bunun yanı sıra, bu model, (monositler) infiltre ve yerleşik geçiş (makrofajlar) lökositler hem de diğer lökosit yanıtları çalışmak için de kullanılabilir. Bu model aynı zamanda, bir IR yaralanma sonrası kan ve lenf bütünlüğü hem de lökosit-endoteliyal etkileşimleri incelemek diğer çalışmalar kadar uzatılabilir. MP-IVM ile SHG sinyalleri olarak kollajen görselleştirmek için yeteneği ile birleştiğinde, aynı zamanda IR sonra veya yara iyileşmesi sırasında kollajen bütünlüğünü izlemek ilginç olacaktır. Özetle, biz fare kulak deride bağışıklık yanıtlarını araştırmak için intravital görüntüleme için IR bir non-invaziv, sağlam bir model kurduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J.
