Summary
Denne protokol beskriver induktionen af en iskæmi-reperfusion (IR) model på museøre huden ved hjælp af magnet fastspænding. Ved hjælp af en specialbygget intravital imaging model, vi studerer in vivo inflammatoriske reaktioner post-reperfusion. Rationalet bag udviklingen af denne teknik er at udvide forståelsen af, hvordan leukocytter reagerer på huden IR skade.
Introduction
Iskæmi-reperfusionsskade (IRI) opstår, når der er en forbigående hypoxi på grund af obstruktion af blodstrøm (iskæmi) efterfulgt af en efterfølgende ny iltning af væv (reperfusion). I huden, er iskæmi-reperfusion (IR) menes at være en af de medvirkende faktorer til patofysiologien af tryksår, hvor langvarig sengeleje prædisponerer langsigtede hospitalspatienter til skade. Hos disse patienter er både hud og underliggende muskler konstant udsat for vægt presset i områder af knoglefremspring, hvilket resulterer i lokaliserede skader, hvis venstre ubehandlet, kan blive nekrotisk 1.
De involverede i en IRI skader er dobbelt. Under iskæmi, okklusion af blodkar medfører et drastisk fald af oxygen levering til væv. Dette resulterer i et fald i ATP og pH, som inaktiverer ATPaser involveret i cellulær metabolisme. Til gengæld cellulære calcium niveauer spike, og stresset eller beskadiget calen undergår apoptose eller nekrose 2. Frigivelsen af intracellulære indhold eller skader i forbindelse molekylære mønstre (DAMP), ligesom HMGB1, bidrager til det inflammatoriske respons 3. Den anden insult optræder under reperfusion. Skønt oxygen og pH-niveauer er genoprettet under reperfusion, resulterer dette i genereringen af reaktive oxygenspecies (ROS), som fører til oxidationen af intracellulære lipider, DNA og proteiner. Derfor er pro-inflammatoriske mediatorer aktiveret, hvilket sætter en sekundær inflammatorisk reaktion, der involverer rekruttering af immunceller til det inflammatoriske sted 2. Mens den kaskade af biokemiske begivenheder, der fører op til det inflammatoriske respons er blevet godt beskrevet, er den rumlige og tidsmæssige regulering af immun celle aktiviteter ikke godt forstået.
Her beskriver vi en robust IR model på museøre huden ved hjælp af simpel magnet fastspænding. Kombineret med multifoton intravital imaging (MP-IVM), vietableret en model til at studere in vivo inflammatoriske responser, der opstår efter reperfusion finder sted. Rationalet bag udviklingen og brugen af denne teknik er at forsøge at forstå, hvordan både interstitielle og infiltrerende celler reagerer på IR i realtid.
Eksisterende modeller af IR ved hjælp af fastspænding teknik på huden flanke er meget invasiv, da de kræver kirurgisk implantation af stålplader i huden flanke, hvilket gør dem mindre end ideelle til immunologiske undersøgelser 4. Et lignende ikke-invasiv fastspænding teknik er blevet beskrevet i musehud flanke 5,6. Men på grund af indarbejdelsen af intravital imaging komponent i denne metode, vi valgte i stedet, øret huden som den målrettede IR site, da det omgår bevægelser grundet vejrtrækning og tilbyder stabilitet under billeddannelse 7,8. Endvidere leukocytundergrupper der spænder interstitium er identiske mellem øret huden og huden flanke, selv omtal og proportioner kan variere lidt 9. Således ørehuden repræsenterer en ideel billeddannelsessted.
Desuden har de fleste data hentet fra disse IRI modeller er begrænset til makroskopiske evalueringer (sortering af sår) og mikroskopiske analyser af endpoint inflammatoriske indikatorer 10. Under anvendelse af denne model, er tidstro visualisering af det cellulære respons af neutrofiler efter reperfusion i huden af en fluorescerende reporter mus aktiveret. En tidligere offentliggjort intravital øre tegnemodel anvendes 8 med yderligere modifikationer (figur 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter, der beskæftiger sig med levende dyr blev udført i overensstemmelse med alle relevante dyr brug og retningslinjer og regler pleje.
1. Valg af Fluorescent Reporter Mus
- Brug 6- til 12 uger gamle LysM-eGFP 11 mus (ingen præference for enten mænd eller kvinder).
Bemærk: Brugen af forskellige cellespecifikke fluorescerende reporter mus muliggør visualisering af forskellige immunceller in vivo. I denne stamme, cirkulerende neutrofiler (GFP hi celler), cirkulerende monocytter (GFP lo celler), og dermale makrofager (GFP lo celler) kan visualiseres. Med de anvendte imaging parametre, vil blive opdaget kun de lyse signaler fra GFP-positive neutrofiler.
Bemærk: En liste over immun-celle-specifikke fluorescerende reporter musestammer er egnede til denne type af hud imaging undersøgelse kan findes i reference 8.
Bemærk: Det anbefales stærkt at albino mus bruges til billedbehandling, som pigmented mus er mere udsat for lysbeskadigelse. Dette skyldes den pigmenterede øre hud er meget mere følsomme over for laser-induceret speckling (betegnende for væv brænding). Som et resultat heraf kan neutrofil rekruttering og akkumulering observeres selv under steady state 8,12. - Hold musene i specifikke patogenfrie (SPF) betingelser med 12 timers lys-mørke cyklus.
2. Mus Anæstesi
- Bedøver musen med en intraperitoneal injektion af ketamin-xylazin (8 pi g -1 kropsvægt), sammensat af en blanding af 15 mg ml -1 ketamin og 1 mg ml -1 xylazin opløst i sterilt vand.
- Placer musen på en varmepude til at opretholde sin kropstemperatur ved 37 ° C under hele fremstillingsproceduren. Check for tilstrækkelige anæstesi ved at observere et fravær af en tå knivspids refleks.
Bemærk: Efter den første time, vil efterfølgende kvartal doser af bedøvelse skal administreres subkutant end vil vare i cirka 0,5 time hver. Den trækninger af whiskers eller halen kan også indikere, at bedøvelsen er iført slukket, og at en top-up er påkrævet. - Brug oftalmologiske smøremiddel på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
3. Depilation
- Forsigtigt hårfjerningsmiddel til de øverste to tredjedele af den dorsale muse øre ved hjælp af bomuld-tip applikatorer.
- Vent til 2 - 3 min, før du fjerner cremen hjælp våde bomuld-tip applikatorer i en grundig men blid måde.
Bemærk: Lad ikke hårfjerning creme til at blive på musen øre for længe, da det kan fremkalde betændelse 13,14.
4. Induktion af iskæmi og reperfusionsskade
- Brug guldbelagte, N42-grade neodymium, 12 mm diameter x 2 mm tykke magneter, og med en Gauss rating på ca. 3000 til at fremkalde iskæmi i mus øre huden.
Bemærk: I dette tilfælde er små fordybninger flade af magneterne deNOtes dens nordpol. - Slot magneterne i deres individuelle plast guider.
Bemærk: Den plastiske guide tjener til at lette placering og adskillelse af de højstyrke magneter. På grund af deres stærke magnetiske kraft endnu lav modstand mod brud, ikke placerer enkelte magneter i umiddelbar nærhed af hinanden eller til andre metaller. Brud og splintring kan opstå, hvis de trækker mod hinanden. - Placere den første (dorsale) magnet, således at kun kanten er i kontakt med den anden (ventrale) magnet (figur 3a)
Bemærk: Dette forhindrer magneterne fra snapper sammen, før de er blevet korrekt placeret. - Placer begge magneter, således at den ventrale magnet ligger fladt på øret (figur 3a).
Bemærk: Før iskæmi induceres, at musen holdes ved 37 ° C, og at tilstrækkelig anæstesi opretholdes (se trin 2.2). - Når det er klart, omhyggeligt lade magneterne komme sammen (figur 3a Bemærk: Til billeddannelsesformål, klemme kun halvdelen af øret, så der kan observeres en IR og ikke-IR-regionen.
- Efter 1,5 timers iskæmi, fjerne magneterne ved at vride magneterne bort fra hinanden ved hjælp af plast guides, så reperfusion kan finde sted.
Der skal udvises omhu for at forhindre ørerne krøllet, når magneterne er placeret: note. Ufuldstændig iskæmi er udtalt, hvis de makroskopisk synlige store blodkar re-perfundere straks (dvs. blod fylder beholderne straks) efter magneterne er fjernet. Selvom reperfusion ikke forekommer umiddelbart efter fjernelsen af magneter, blodkar okklusion er kun forbigående. Som sådan er det bydende nødvendigt at forberede museøre til billeddannelse så hurtigt som muligt.
5. Injektion af blodkar Mærkning Agenter
- Umiddelbart efter fjernelse magnet, indgives intravenøst (via retro-orbital eller haleveneinjektion) Evans blue (10 mg ml-1i PBS eller saltvand; 1 uL g -1 kropsvægt) eller en anden blodkar mærkning agent valg.
Bemærk: Før injektion, sikre, at der er tilstrækkelig anæstesi stadig vedligeholdes ved at udføre blid tå klemme.
6. Placering af Ear på Imaging Platform
- Klip 2 stykker malertape 1,5 cm i længden og 1,8 cm i bredden.
- Lad limen sider til at holde sammen, mens de forlader ca. 1 mm af lim langs dens bredde.
- Skær masking tape i to, i længderetningen, til at rumme sin placering i slidsen på øret platformen.
- Indsæt dette masking tape omkring halvvejs gennem spalten, således at den klæbende side vender opad.
- Placer musen på varmepude, således at øret skal afbildes er ud for masking tape strip.
- Ved at bruge to PBS-fugtede bomuld-tip applikatorer, tryk forsigtigt øret mod den selvklæbende strimmel.
- Brug strimlen som en guide, bringe musen øregennem spalten samtidig justere musen tættere mod scenen.
- At fjerne tape, først tilføje en dråbe PBS for at reducere klæbeevnen af båndet.
- Adskil muse øre fra malertape så skånsomt som muligt under anvendelse af en fin malerpensel.
- Glat øret af øret platform ved forsigtigt at rulle en fugtig bomuld-tip applikator over øret.
- Sæt en dråbe PBS under dækglasset (som holdes på plads på dækglasset indehaveren hjælp fedt, figur 2) og forsigtigt placere den over øret. Fyld op med mere PBS om nødvendigt.
Bemærk: Indehaveren af dækglas øger stabilitet under billedbehandling. - Indsæt den rektale temperatursonde og forbinde ledningerne til varmesystemet ifølge producentens anvisninger.
Bemærk: Indstil temperaturen af legemet varmepude til 37 ° C og øret stadium platform til 35 ° C.
7. multifotonexcitation Microscope Setop og Imaging Parametre
Bemærk: Denne protokol bruger en enkelt stråle, multifoton mikroskop med en justerbar (680 - 1080 nm) Ti: Sa laser (3,3 W ved 800 nm, puls længde på 140 fs, 80 MHz gentagelse sats) med en 20X vand mål (NA = 1.0) for intravital billeddannende undersøgelser.
- Åbn imaging-softwaren.
- Juster laseren ifølge producentens anvisninger.
- Juster excitationsbølgelængden til 950 nm.
Bemærk: GFP og Evans blå kan være samtidig spændt på 950 nm. - Til preview, bruge følgende indstillinger: 500 um 2 scanfield, 505 x 505 pixel opløsning, og en scanning frekvens på 800 Hz i en enkelt linje scanning. Klik på "Preview".
- Slå dæmperen (laser) magt. Sørg for, at alle væsentlige signaler samles op uden at udsætte den billeddannende feltet til store mængder af laser magt, som kan fremkalde varmeskader.
Bemærk: Begynd ved en lav dæmperen magt og stige, hvis signal er dæmpet. Som neutrofiler vil være fraværende fra interstitium på tidlige tidspunkter efter reperfusion, kan makrofager anvendes som en måler til at bestemme den minimale effekt, der kræves, da de førstnævnte er svagere end neutrofiler.
Bemærk: Hvis dette trin skal gøres for første gang, justere indstillingerne i den ikke-iskæmiske zone, hvor der forventes intakt vaskulær integritet og vil lette indstillingen af dæmperen magt. I efterfølgende eksperimenter, har disse indstillinger ikke meget modifikation medmindre lasereffekten er ustabil. - Juster PMT indstillinger.
Bemærk: Spørg producenten for den maksimale optimale gevinst spænding for PMT. Indstilling af PMT spænding over den anbefalede tærskelværdi vil resultere i en højere signal-til-støj-forhold. Den generelle anbefaling er at sætte PMT gevinst spænding til den anbefalede grænse og øge dæmperen magt som nødvendigt bør signalet være for svagt. - Vælg et billeddannende region, der er i tæt nærhed tilkanten af iskæmi, kendetegnet ved massiv Evans blå lækage.
- Indsamle GFP og Evans blå signaler under anvendelse 525/50 bandpass (BP) og 655/40 BP filtre, henholdsvis. For anden harmonisk generation (SHG) signaler af kollagen fibre i huden rum, bruge et 475/42 BP-filter.
- Opret en mappe til at gemme billederne i et format, der er kompatibelt for tilgængelige billedanalyse software.
- At erhverve, bruge følgende indstillinger: 500 um 2 scanfield, 505 x 505 pixel opløsning, og en scanning frekvens 400 Hz i en enkelt linje scanning.
- En 100-um z-stak med en trinstørrelse på 4 um kan erhverves gentagne gange over tid, med 1 minuts mellemrum for at kontrollere neutrofil infiltration.
Bemærk: Især for leukocytter (f.eks, neutrofiler) med en højere vandrende hastighed, et interval, der er længere end 1 min kan resultere i vanskeligheder under cellesporing analyse. I dette tilfælde kan brugeren enten reducere tykkelsen af actagelsen stable eller øge scanningen frekvens.
Bemærk: Mens den krævede erhvervelse stakken af den iskæmiske zone, kan synes mindre som følge af kompressionen (alternativt karakteriseret ved en højere SHG intensitet), vil efterfølgende reperfusion resulterer i massiv inflammation der forårsager øret til at svulme. Væsentlige driver i Z-retningen forventes. Som sådan er nødvendig erhvervelse af en stor z-stakken til at rumme afdrift. - Gennem hele billedbehandling, top op PBS og vand regelmæssigt for at holde øret fugtig og objektivlinsen nedsænket i vand.
Bemærk: En typisk eksperiment varer normalt 2 - 4 timer. Afhængigt af det eksperimentelle design, og koblet med en velkontrolleret anæstesi regime, at forlænge varigheden af billeddannelse er mulig.
8. Afslutning af eksperimentet
- Aflive musen ved kuldioxid kvælning efter institutionens Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) procedures.
Bemærk: aflive altid musen efter godkendte metoder som fastlagt af institutionens regler, forskrifter og retningslinjer. Hvis der er behov gentages billedbehandling, holde musen på varmepuden indtil bedøvelsen aftager. Når musen har genvundet tilstrækkelig bevidsthed og er mobil, returnere musen til sit bur.
9. Image Analysis
Bemærk: Data genereret fra afbildningseksperiment kan visualiseres ved forskellige softwarepakker.
- Åbn imaging analyse software.
- Under overgå Mode importere filen (Open → vælge en fil i den ønskede mappe → Klik på "åben").
- Edit pseudo farver, hvis standardfarverne ikke gælder (Rediger → Skærm justering → Under fanen kanal, skal du vælge den ønskede farve fra farvepaletten).
- Juster lysstyrke, kontrast og baggrund (Rediger → Skærm Justering → Toggle Max og Min værdier). Sørg for, at filen dimensioner er korrekte (Rediger → Billed Egenskaber → Under fanen geometri, kontrollere voxel størrelse. I denne protokol, X = 0,99, Y = 0,99, og Z = 4).
Bemærk: Udlede X og Y ved at dividere scanfield dimension af pixel opløsning. Z er tykkelsen mellem hver skive.
Bemærk: Resultatet af disse datasæt kan præsenteres som maksimale projektion film.
Bemærk: Sporing analyse er nødvendig for fuldt ud at karakterisere cellulære aktiviteter og interaktioner for at forstå deres funktion in vivo. Detaljerede anvisninger celle tracking bruge stedet funktionen tilgængelig i softwaren kan findes i protokollen i reference 15.
Bemærk: Der er mange måder at kvantificere leukocyt migration, nærmere udformning, som kan findes i gennemgangen artikel i reference 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol anvender en specialbygget ørehuden imaging platform, som vist i figur 1. Flere funktioner i denne platform er specielt designet til at lette billeddannelse samtidig opretholde fysiologiske indstillinger. Placering af øret på den opvarmede messing platformen ikke kun fastholder øret ved en fysiologisk temperatur på 35 ° C, men det isolerer også øret fra uundgåelige bevægelser som følge af vejrtrækning. Tilføjelsen af en metal klip på messing-platformen skaber en kløft for at forhindre indehaveren dækglasset fra at udøve vægt på øret, og dermed bevare uafbrudt blodgennemstrømning. Etapen platformen er også designet til at rumme en varmepude, der vil fastholde musen ved 37 ° C under hele imaging procedure.
Dækglasset holder (figur 2) er designet til at gøre det muligt for dækglasset skal fastgøres på holderen metallet ved hjælp af vakuum greaSE. Indehaveren dækglasset er forbundet til et stativ, der giver mulighed for fleksibel tilpasning i de lodrette og vandrette akser ved hjælp af adapteren. På denne måde kan brugeren først præcist justere placeringen af dækglasset over øret og efterfølgende løse denne stilling ved at stramme skruerne på adapteren.
I denne protokol, har vi beskrevet anvendelsen af magneter til at simulere iskæmi og reperfusion. Figur 3b viser repræsentative udsigt over ørerne før og umiddelbart efter iskæmi. Under fysiologiske betingelser, kan større blodkar visualiseres makroskopisk. Den klemme virkning af magneterne midlertidigt stængler blodgennemstrømningen, hvilket kan iagttages ved en forbigående blanchering effekt (sort pil), når magneterne er fjernet.
I dette særlige demonstration, er imaging fokuseret på kanten af den iskæmiske zone (figur 3c (figur 3d). Dette skaber vigtige vartegn for intravital billeddiagnostiske undersøgelser og hjælper med at bevare sammenhængen mellem uafhængige forsøg.
Dataene viser, at som svar på et IR insult, infiltrerende neutrofiler exit ind i interstitium fra intakte blodkar foring kanten af den iskæmiske zone og migrere til skadestedet (figur 3d og Movie 1). Vi forventer en forsinket respons af neutrofiler, der migrerer ind i interstitium i forhold til andre inflammatoriske modeller pga manglende rentable blodkar perfusion på tidligere tidspunkter post-reperfusion. For fuldt ud at karakterisere disse cellegelmæssige aktiviteter, kan celle sporing analyse anvendes til at forstå deres funktion in vivo. Hastighed, betyder forskydning, og kemotaktisk indeks er nogle af de potentielle udlæsninger, der kan opnås fra cellen sporing analyse.
Figur 1. Skematisk diagram af en Skræddersyede Ear Skin Stage for Intravital multifotonexcitation Imaging. (a) Ovenfra af øret imaging scenen med dens dimensioner. (b) forfra og dimensioner. Bemærk, at messing pladen er tykkere ved siderne, for at give stabilitet til platformen, og tyndere i midten, for at minimere kontaktområdet med huden, sikre uafbrudt blodgennemstrømning, når øret er foldet over kanten af slidsen og hvilede på platformen. (c) set fra siden af den buede indehaver, der stifter ned feedback sonden. Varmepuden kan værefastgjort på platformen ved hjælp afdækningstape (ikke vist). Modificeret fra Li et al., Nat Protoc 2012 8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Design af dækglasset Holder; Side og Top View. Indehaveren dækglasset holder dækglasset i en fast position og reducerer således z-drift. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. IR Model. (A) Skematisk diagram, der viser positioneringen af magneter. (B) (C) Skematisk af øret, der viser regionen afbildes i forhold til, hvor magneten var blevet anbragt. (D) Maksimal intensitet z-projiceret snapshots fra en time-lapse-sekvens viser neutrofil infiltration post-reperfusion i en LysM-eGFP mus. Forløbet tid vist i tt: mm format. Skala Bar: 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1. Neutrofil Rekruttering i IR Skade. En time-lapse sekvens af maksimal projektion viser neutrofile (grøn) infiltration i respons på reperfusion i LysM-eGFP albino mus øre huden efter 1,5 timers iskæmi. På tidligere tidspunkter, manglen påEvans blue signal (rød) angiver midlertidig karokklusion efter iskæmi. Collagen (blå, anden harmoniske generation). Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydning
IR er en af de førende årsager til huden tryksår. De tidlige stadier (I og II) af tryksår beskriver tilstanden af menneskehud (sammenlignet med de underliggende subkutane væv og muskler). Imidlertid er en forståelse af den immunologiske ætiologi stadig mangler. Her præsenterer vi en enkel og robust IR model på mus øre huden for at løse dette hul. Vi simulere iskæmi ved at spænde museøre mellem to magneter og efterfølgende studere de nedstrøms immunreaktioner efter magnet fjernelse (reperfusion). Ved at bruge magneter til at generere et konstant tryk på hvert øre for en bestemt periode, overtalelse iskæmi, er vi i stand til at sikre reproducerbarhed og sammenhæng mellem forsøgene.
Styrken af denne ikke-invasive IR model ligger også i dens evne til at vise, i realtid, in vivo immunresponser ved at anvende en veletableret model for intravital imaging ørehuden, som tilbyder mere stabilitet under billedbehandling i forhold til huden flanke proceduren. Nogle af de nuværende hud flanke modeller involverer kirurgiske procedurer, der kan ændre immun landskab af huden fire. Desuden billeddannelse huden flanke selv udgør en teknisk udfordring, som respiratoriske bevægelser kan bidrage til motion-relaterede artefakter under billeddannelse 5,6. Vores nuværende model omgår disse problemer.
Ud over at studere de fysiologiske reaktioner i immunceller til IR, kan denne model også gælde for patofysiologiske indstillinger som diabetes mellitus, hvor diabetes kan forværre IR skade gennem øget oxidativt stress. Forståelse af de immunreaktioner vil bidrage til en forståelse af sårheling.
Kritiske trin
Når musen er under anæstesi, er termoregulering svækket og kernen kropstemperatur falder drastisk. For at forhindre hypotHermia, ekstern opvarmning er vigtigt at opretholde kroppens kernetemperatur ved 37 ° C. Øret, placeret distalt til kroppen kerne, er fysiologisk køligere med 1 - 2 ud ° C og skal holdes på 35 ° C. Denne sammenhæng i opvarmning vil også sikre reproducerbare udlæsning af celle dynamik. Samtidig skal varmesystemet kontrolleres for at sikre, at musen er ikke overophedning over hele længden af anæstesi.
Brugen af albino mus (BALB / c og C57BL / 6-C 2J) for alle hud billeddiagnostiske undersøgelser anbefales for at undgå pigment-induceret speckling skader. Hvis albinomus ikke er tilgængelige, kan faldende lasereffekten under billedoptagelsen afhjælpe problemet for pigmenterede mus. Dog kan være behov for yderligere optimering, som en reduceret dybde af væv penetration kan resultere i en dårligere resultat erhvervelse.
Øret hud er meget sart; derfor skal der udvises forsigtighed for at undgå omstændigheder, derkan forårsage betændelse. Eksempler på ukorrekt teknikker indbefatter, men er ikke begrænset til, følgende: 1), der forlader hårfjerningsmiddel på for en stor mængde af tid over hvad der anbefales; 2) at bruge stort friktion på øret, når bringe øret gennem slidsen af øret imaging platform eller når afmonterer øre fra malertape; og 3) overophedning øret, enten på grund af en defekt varmeanlæg eller en fejlplaceret temperatur tilbagemelding probe, som kan optage omgivelsestemperatur i stedet for musen kernetemperatur.
Ændringer og fejlfinding
De fleste af fejlfinding vedrørende forberedelse øre proceduren er tidligere blevet opført otte. Hvis øret afbildes på et senere tidspunkt efter reperfusion, kan øret kvælde ud over 0,5 mm hul skabt af metalclipsen at rumme tykkelsen af øret (figur 1). I dette scenario placeringen af dækglasset over øretkan hindre blodgennemstrømning, hvilket er tydeligt, når de makroskopisk synlige blodkar forsvinder ud af syne. Dette skal undgås ved at skabe et større mellemrum mellem dækglasset indehaveren og messing platform. Dette kan gøres på to måder, enten ved manuelt at justere højden på dækglasset holderen (figur 2) eller ved anvendelse af en tykkere metalclips.
Begrænsninger af teknikken
I denne protokol, anvendte vi Evans blue til at bestemme placeringen af den iskæmiske zone, eftersom lækage af Evans blåt i interstitium markerer grænsen af den iskæmiske zone ved tidlige tidspunkter efter iskæmi. Evans blå er almindeligt anvendt som et blodkar mærkningsmiddel. Men under inflammatoriske tilstande, vaskulær integritet alvorligt kompromitteret. Dette resulterer i lækage af Evans Blå i interstitium. I denne model, vi observerer en drastisk tab af kontrast mellem blodkar og interstitium hurtigt efter reperfusion. Som sådan i studies hvor leukocyt-endotel interaktioner er involveret, anbefaler vi at eksperimentere med andre mærkning blodkar agenter i forskellige størrelser (fx dextraner osv.).
Fremtidige applikationer
Udover at udnytte LysM-eGFP musen til at vise, hvordan neutrofiler svare huden IR, kan denne model også anvendes til undersøgelse af andre leukocyt-responser, både i infiltrerende (monocytter) og i hjemmehørende interstitielle (makrofager) leukocytter. Denne model kan også udvides til andre undersøgelser der undersøger blod og lymfe integritet, samt leukocyt-endotel interaktioner efter en IR skade. Koblet med evnen til at visualisere collagen SHG signaler via MP-IVM, ville det også være interessant at overvåge kollagen integritet efter IR eller under sårheling. Sammenfattende har vi oprettet en non-invasiv, robust model af IR for intravital billeddannelse for at studere immunreaktioner i mus øre huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strains | |||
| Lysozyme-GFP C57BL/6 | Thomas Graf, Center for Genomic Regulation | ||
| C57BL/6-C2J | Jackson Laboratories | 000058 | To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging |
| Reagents | |||
| PBS | |||
| Viaflex 0.9% (wt/vol) saline | Baxter Healthcare | F8B1323 | |
| Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride | Parnell | Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed | |
| Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride) | Troy Laboratories | Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed. | |
| Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline) | Sigma-Aldrich | 46160 | |
| Ultrapurified water | |||
| Equipment | |||
| Insulin syringe with needle | BD | 328838 | |
| Transfer pipettes | Biologix Research Company | 30-0135 | |
| 3 M paper masking tape | 3M | 2214 | |
| Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm) | Paul Marienfeld | 101112 | |
| Curved splinter forceps | Aesculap, B. Braun Melsungen | BD312R | |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser | ||
| Medical cotton-tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| C-fold towels | Kimberly-Clark | 20311 | |
| Kimwipes delicate task wipes | Kimtech Science | 34155 | |
| Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick | first4magnets | F656S | |
| Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material) | fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microscope | |||
| TriM Scope II single-beam two-photon microscope | LaVision BioTec | ||
| Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate) | Coherent | ||
| Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0) | Olympus | XLUMPLFLN20xW | |
| Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue) | |||
| 495 long-pass | Chroma | T495LPXR | |
| 560 lomg-pass | Chroma | T560LPXR | |
| 475/42 band-pass | Semrock | FF01-475/42-25 | |
| 525/50 band-pass | Chroma | ET525/50m | |
| 655/40 band-pass | Chroma | NC028647 | |
| Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly) | |||
| A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm) | |||
| A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge) | |||
| Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation | |||
| Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform | |||
| Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640106 | connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C |
| Resistive heater blocks RH-2 | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640274 | Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating. |
| Temperature controller TC-344B for the ear platform | (Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 640101 | |
| Temperature controller TR-200 for mouse heating pad | Fine Science Tools | 21052-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Power supply for TR-200 | Fine Science Tools | 21051-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives |
| Heating pad | Fine Science Tools | 21060-00 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. |
| Animal rectal probe | Fine Science Tools | 21060-01 | Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C |
| Coverslip holder | |||
| 2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length | |||
| 1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram) | |||
| 3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place | |||
| 1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge | |||
| 1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod | |||
| 1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base. | |||
| Imaging analysis software | |||
| Imaris v8.1.2 | Bitplane | ||
References
- Black, J., et al. National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system. Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J.
- Huebener, P., et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).
- Wassermann, E., et al. A chronic pressure ulcer model in the nude mouse. Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).
- Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers. Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).
- Saito, Y., et al. The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer. J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. Visualizing dendritic cell migration within the skin. Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).
- Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci Rep. 3, 1913 (2013).
- Ng, L. G., et al. Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites. PLoS Pathog. 4, e1000222 (2008).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. , e51805 (2014).
- Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J.
