Protocol
1. Fremstilling af peptid-baserede formuleringer
- Forbered stamopløsninger af hvert peptid som følger: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml eller 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) og (BP100) 2 K 8 (70 uM). Vej den nødvendige mængde af hvert peptid i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og der tilsættes autoklaveret ultrarent vand for at opløse peptidet. Bland godt ved gentagen pipettering, indtil der fås en klar opløsning.
- Forstærke og oprense plasmid DNA (pDNA), dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ifølge standard molekylær metoder. I 1,5 ml mikrocentrifugerør, gøre stamopløsninger med en koncentration på 1 mg / ml (pDNA og dsDNA) eller 400 nM (dsRNA).
- Forbered protein stamopløsningen med en koncentration på 7 um, ved at opløse 1 mg protein (f.eks., Alkoholdehydrogenase, ADH) pulver i 1 ml natriumcarbonatopløsning (0,1 M, pH 9). Mærk proteinet med fluorescent prober såsom rhodamin B (RhB) ifølge standardprotokoller at muliggøre mikroskopisk visualisering af proteinet afgives til celler.
- Kombiner de respektive komponenter i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- For peptid-pDNA formuleringer målretning cytoplasmaet, tilsættes 6,4 pi (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) til 20 pi pDNA (1 mg / ml) og blandes godt ved pipettering. Lad blandingen stabilisere i 15 minutter ved 25 ° C. Tilføj 773.6 pi autoklaveret ultrarent vand for at fortynde opløsningen til et endeligt volumen på 800 pi. Brug pDNA konstrukt designet til nuklear ekspression (P35S-Rluc-Tnos, tabel 1).
- For peptid-pDNA formuleringer målretning mitokondrier, tilsættes 6,6 pi Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) til 20 pi pDNA (1 mg / ml) og blandes godt ved pipettering. Lad blandingen stabilisere i 15 minutter ved 25 ° C og tilsæt derefter 2,4 pi BP100 (1 mg / ml). Lad blandingen stabilisere i 15 minutter ved 256; C i yderligere 15 minutter. Tilføj 771 pi autoklaveret ultrarent vand for at fortynde opløsningen til et endeligt volumen på 800 pi. Brug pDNA konstrukt designet til mitokondriel ekspression (pDONR-COX2: Rluc, tabel 1).
- For peptid-dsDNA-formuleringer, tilsættes 5,1 pi (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) til 8 pi dsDNA (1 mg / ml) og blandes godt ved pipettering. Lad blandingen stabilisere i 15 minutter ved 25 ° C. Tilføj 786.9 pi autoklaveret ultrarent vand for at fortynde opløsningen til et endeligt volumen på 800 pi.
- For peptid-dsRNA formuleringer, tilsættes 50 pi (KH) 9 -BP100 (800 nM) til 50 pi dsRNA (400 nM) og blandes godt ved pipettering. Lad blandingen stabilisere i 15 minutter ved 25 ° C. Tilføj 700 pi RNase-frit vand til fortynding af opløsningen til en endeligt volumen på 800 pi.
- For peptid-protein-formuleringer, tilsættes 16 pi (BP100) 2 K 8 (70 uM) til 16 pi ADH (7 um) og blandesgodt ved pipettering. Lad blandingen stabilisere i 15 minutter ved 25 ° C. Tilføj 768 pi autoklaveret ultrarent vand for at fortynde opløsningen til et endeligt volumen på 800 pi.
- Tillad formuleringerne at stabilisere i 15 minutter ved 25 ° C.
2. Karakterisering af peptid-baserede formuleringer
- Overfør hver opløsning (800 pi) i en kuvette til dynamisk lysspredning (DLS) -analyse. Bestem den hydrodynamiske diameter og polydispergeringsindeks af dannede komplekser med et zeta nanosizer, under anvendelse af en 633 nm He-Ne laser ved 25 ° C med en tilbagekastning detektering vinkel på 173 °.
- Følgende størrelse målinger, overføre hver opløsning (800 pi) i en foldet kapillær celle til Zetapotential målinger ved standardparametre af dielektriske konstant, brydningsindeks og viskositeten af vand ved 25 ° C.
- Observere et lille volumen komplekse løsning, der anvendes til DLS analyse ved atomic force mikroskopi (AFM). Deposit 10 pi kompleks opløsningen på frisk eksponerede spaltet overflade af et glimmer ark og overlade glimmer at lufttørre natten over i en overdækket plast petriskål.
- Erhverve et billede af komplekserne i luft ved 25 ° C under anvendelse af en silicium cantilever med en fjederkonstant på 1,3 N / m i aflytning modus 27,28.
3. Infiltration af Plant Blade
- Brug 3 uger gamle jord-dyrket planter (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 eller poppel 26). Transficere mindst 3 blade for at tjene som triplo til kvantificering af genekspression eller protein levering.
- Indlæse en 1 ml nålløs plastsprøjte med 100 pi kompleks løsning til transfektion af det ene blad. Placer spidsen af sprøjten på abaxial overflade af bladet.
- Tryk sprøjtens spids mod bladet lidt og trykke sprøjtens stempel langsomt, mens udøve en modtryk med iNDEKS finger af en latex-behandsket hånd fra den modsatte side. Vellykket infiltration kan observeres som spredning af en vand-gennemvædet område i bladet. Mærk de infiltrerede blade for at lette identifikation.
- Inkubér transficerede blad til optimerede varigheder efter infiltration med peptid-pDNA (12 timer), peptid-dsDNA (12 timer), peptid-dsRNA (9 - 48 timer) og peptid-protein (6 timer) formuleringer under følgende betingelser: 16 timers lys / 8 timers mørke ved 22 ° C i A. thaliana og poppel, eller 24 timers konstant lys ved 29 ° C i N. benthamiana.
4. Evaluering af transfektionseffektiviteten
- Udskære hele transficeret blad af mindre planter (f.eks., A. thaliana) eller en 1 cm2 afsnit af infiltrerede region for større anlæg (f.eks., N. benthamiana).
- Til transfektion eksperimenter under anvendelse af Renilla luciferase (Rluc) reporter vektor, fastlægge transfection effektivitet kvantitativt under anvendelse af et Rluc Assay Kit.
- Placer hver udskåret blad eller blade sektion i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 100 pi 1 × Rluc Assay Lysis Buffer pr rør. På samme måde, forberede lysater af ikke-transficerede kontrol- blade (tredobbelte).
- Grind bladet under anvendelse af en homogenisering støder og inkuber det resulterende lysat ved 25 ° C til 6 personer - 10 timer.
- Centrifugeres lysatet ved 12.470 x g i en mikrocentrifuge i 1 min. Transfer 20 pi af den klarede lysat til en brønd i en 96-brønds mikroplade, og bruge den resterende mængde til kvantificering af totale proteinkoncentration ved anvendelse af et BCA Protein Assay Kit ifølge producentens protokol.
- Tilsæt 100 pi 1 × Rluc Assay Substrat (fortyndet ved hjælp af Rluc Assay Buffer) i brønden og bland ved langsom pipettering. Placer mikropladen i en multimode mikropladelæser og initiere måling.
- Fratræk baggrunden luminescens (middel af NOn-transficerede triplo) fra hver forsøgsgruppe prøves luminescens. Beregne forholdet mellem photoluminescence (relative lysenheder, RLU) til mængden af protein (mg).
- Til transfektion eksperimenter under anvendelse af grønt fluorescerende protein (GFP) reporter vektor eller fluorescensmærket protein (f.eks., ADH-RhB), observere fluorescensen ved anvendelse af en konfokal laser scanning mikroskop.
- Skær kanterne af en hel blad (til støtte fjernelsen af lufthuller), mens der kan anvendes et sektioneret blad som er. Fjern stemplet fra en 10 ml sprøjte og placere hver udskåret blad eller blade sektion i sprøjten.
- Erstat stemplet og skubbe det forsigtigt ned i bunden af sprøjten uden at knuse bladet. Tegn vand i sprøjten, indtil den omtrent er halvt fyldt.
- Peg sprøjten opad og skub stemplet for at fjerne luft fra sprøjten gennem spidsen. Dæk spidsen af sprøjten og træk stemplet langsomt ned for at fjerne luft fra leaf. Gentag denne proces flere gange, indtil bladet vises gennemsigtigt.
- Dække overfladen af et objektglas med tape. Skær et firkantet område på båndet tilstrækkelig plads bladet prøve under anvendelse en klinge, og skræl firkantet stykke tape af med en pincet for at skabe en prøvekammer. Båndet vil tjene som et afstandsstykke mellem dias og dækglasset.
- Placer bladet i kammeret med abaxial overflade vender opad, og fyld den resterende kammer med vand. Forsegl bladet inden i kammeret med et dækglas og sikre kanterne af dækglasset med tape.
- Undersøg bladet prøve ved hjælp af konfokal laser scanning mikroskop under en 40X objektiv eller en 63X vand nedsænkning mål. GFP eller RhB fluorescens kan visualiseres ved excitationsbølgelængder på 488 nm eller 555 nm.
Representative Results
En vifte af nukleinsyre og protein ladninger lykkedes indført i forskellige anlæg, der anvender de designede peptider som levering vektorer. Elektrostatiske interaktioner mellem kationiske peptider og negativt ladede ladninger resulterede i dannelsen af transfektionskomplekser, som direkte kan infiltreret i planteblade anvendelse af en nålløs sprøjte (figur 1). Optimerede formuleringer (empirisk bestemt i disse undersøgelser 21,23-26) til transfektion af planteceller er anført i tabel 1, hvor hver type af den brede vifte af leverede laster (pDNA, dsDNA, dsRNA og protein) er repræsenteret. De gennemsnitlige diametre af alle peptidbaserede formuleringer var i omtrent fra 150 - 300 nm. Baseret på DLS analyse, alle formuleringer viste polydispersiteter relativt ringe størrelse, hvilket indikerer, at de dannede peptidharpiks cargo aggregater har en ensartet størrelsesfordeling. De morfologier afkomplekser mellem peptidet og pDNA (figur 2A) eller protein (figur 2B), om glimmer, blev afbildet ved AFM. Homogene kugleformede komplekser blev observeret for både peptid-PDNA og peptid-protein-kombinationer, i overensstemmelse med data fra DLS målinger. Med hensyn til zetapotentialet af komplekser (tabel 1), pDNA- og dsDNA-afledte komplekser havde netto negativ overfladeladninger mens dsRNA-baserede komplekser havde en næsten neutral overfladeladning. Peptid-proteinkomplekser, på den anden side blev positivt ladet.
De effektivitetsgevinster af peptid-pDNA og peptid-dsDNA formuleringer i mediere transfektion af A. thaliana eller N. benthamiana som model plante systemer blev vurderet kvantitativt såvel som kvalitativt. Den Rluc genekspression assay blev anvendt til kvantificering af genekspression niveauer (tabel 1), derfor, for dette eksperiment pDNA ellerdsDNA koder for Rluc genet skal anvendes til kompleksdannelse med de respektive carrier peptider. Brug af (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering, nuklear målrettet levering og udtryk for pDNA kan opnås efter en inkubationstid på 12 timer, med en anslået RLU / mg værdi på ca. 1 × 10 5. For mitokondrie-målrettet afgivelse og ekspression af pDNA, en kombination af peptider, Cytcox- (KH) 9 og BP100, er nødvendig for kompleksdannelse. Med samme optimeret inkubationsperiode på 12 timer, imidlertid et meget lavere niveau af transfektion (ca. 1 x 10 3 RLU / mg) blev opnået. I mellemtiden blev lignende inkubationsperiode (12 timer) og genekspression niveau (ca. 1 x 10 3 RLU / mg) kræves / registreret for dsDNA-baserede komplekser, også formuleres under anvendelse af (KH) 9 -BP100 peptid. Kvalitative vurderinger af genekspression blev udført ved direkte mikroskopisk observation af blade behandlet med komplekser prepared hjælp pDNA eller dsDNA koder for GFP-reportergenet. I celler transficeret med ikke-målrettede peptid-pDNA-komplekser, diffus grøn fluorescens svarende med GFP-ekspression blev tydeligt observeret og viste sig at lokalisere i cytosolen (figur 3A). Tydelige forskelle i lokaliseringen mønster af GFP-fluorescens var tydelige i celler infiltreret med mitochondriale målrettet peptid-pDNA-komplekser. Her, punktformig grøn fluorescens, som colocalize med den mitokondriske pletten var synlig, hvilket bekræfter specificiteten af genekspression udelukkende i den mitokondriske rum af celler (figur 3B).
I tilfælde af peptid-protein-formuleringer, vil konjugering af proteinet fragt (ADH) til en fluorofor (RhB) muliggøre visualisering af den leverede protein i det intracellulære rum. Inden for en kort inkubationsperiode på 6 timer blev fundet ADH-RhB protein (blå), der skal fordeles i helecytosolen og vacuolen af infiltrerede celler (figur 3C). I mellemtiden kunne hurtig og effektiv nedregulering af genekspression opnås på forskellige planter ved anvendelse peptid-dsRNA formuleringer. I det første forsøg blev A. thaliana blad infiltreret med peptid-dsRNA komplekser at lukke munden på chalcon syntasegenet (CHS) med ansvar for anthocyanin (rød pigment) biosyntesen under tørke. Forskellen i udseende af A. thaliana blade under normalt (figur 3D, a) og tørke (figur 3D, b) hvis en nem måde til at vurdere CHS lyddæmpningssystemer hjælp af optimerede peptid-dsRNA formulering (pil 1 angiver infiltrerede område). I det andet eksperiment blev peptid-dsRNA komplekser infiltreret i bladene af transgene A. thaliana udtrykker gult fluorescerende protein (YFP). En tilsyneladende reduktion i YFP-ekspression kunne ses i de epidermale celler 9 timer pOst-transfektion (figur 3E, F). Effektiviteten af formuleringen i ned-regulering af genekspression i en anden plante-system (poppel, 12 timer efter transfektion) blev også bekræftet (figur 3G, H).
Figur 1: peptid-baserede Formuleringer til levering af Nucleic Acid og Protein Cargoes i levende planter.
De designede carrier peptider består af polykationer konjugeret til celle gennemtrængende eller organellar transit-sekvenser. Polykationer muliggør binding og / eller kondensering af negativt ladede laster samt flugt fra endosomale rum efter internalisering i celler. Levering af gods i celler og efterfølgende til specifikke organeller medieres af celle gennemtrængende sekvenser og organellar transit-sekvenser, henholdsvis. Forskellige laster, der kunne være successfully leveret i planten omfatter nukleinsyrer, såsom pDNA, dsDNA og dsRNA samt model proteiner, såsom bovint serumalbumin (BSA), alkoholdehydrogenase (ADH) og citrin (en variant af gult fluorescerende protein). Bioaktive molekyler er i stand til at danne transfektionskomplekser med peptidkonjugater via elektrostatiske vekselvirkninger, som er indført i planteblade med sprøjte infiltration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: morfologier af peptid-baserede formuleringer.
(A) AFM amplitude billede af (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering på N / P 0.5. (B) AFM højde billede af (BP100) 2 K 8 / ADH-formulering på molær ratio 10. Gengivet med tilladelse fra offentliggjorte kilder 23,24. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mikroskopisk Evaluering af transfektionseffektiviteten hjælp Optimerede Peptid-baserede formuleringer.
(A) Cytosoliske GFP-ekspression (grøn), klart adskiller sig fra chloroplast autofluorescens (rød), blev observeret i de svampede mesofylceller A. thaliana blade infiltreret med (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5; 12 timer ). (B) GFP-ekspression (grøn) blev påvist i mitokondrierne (rød) i epidermale celler af A. thaliana blad infiltreret med Cytcox- (KH) 9 / BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5 for hvert peptide; 12 hr). Forstørrede billeder af mitokondrier med GFP-ekspression er vist i det yderste højre panel. (C) Levering af ADH-RhB (blå) i de svampede mesofylceller af A. thaliana blade medieret af (BP100) 2 K 8 ved et peptid / protein-molforhold på 10, visualiseret 6 timer efter infiltration. (D) A. thaliana blad før (a) og efter (b) behandling med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molforhold 2; 48 timer), hvilket resulterede i, at anthocyanin biosyntesevejen. En lignende formulering indeholdende GFP5 dsRNA blev infiltreret i blad som negativ kontrol (c). Pilene 1 og 3 angiver infiltreret område, mens pilene 2 og 4 angiver ikke-infiltreret område i bladet. (E) A. thaliana blade udtrykker gult fluorescerende protein (YFP) og (F) den formindskede YFP fluorescens efter infiltration med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molforhold 2; 9 timer). (G) Transgene poppel blade udtrykker gult fluorescerende protein (YFP) og (H) den formindskede YFP fluorescens efter infiltration med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molforhold 2; 12 timer). Gengivet med tilladelse fra offentliggjorte kilder 21,23,24,26. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Variation i peptid-til-DNA (N / P) Ratio og Virkning på Biofysiske Egenskaber af komplekser.
Med stigende peptid til DNA-forhold, peptidbaserede formuleringer falde i størrelse, mens deres zeta-potentiale værdier overgang fra negativ til positiv./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Karakterisering og evaluering af forskellige Peptid-baserede formuleringer. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 2: En sammenligning af peptid-baserede og andre eksisterende DNA Delivery Technologies for intakt Planter. Klik her for at se en større version af denne tabel.
Discussion
Kritiske trin i den protokol, der er blevet identificeret empirisk diskuteres. Med sprøjte infiltration, er peptidbaserede formuleringer introduceres i luftrum inde i planten blad gennem spalteåbninger. For at sikre maksimal optagelse af løsningen, bør infiltration processen udføres når planterne er under forhold, der bidrager til stomatal åbning dvs., Forsynet med tilstrækkeligt vand og i lyset periode. Med hensyn til fremstillingen af transfektionskomplekser, for formuleringer, der involverer en kombination af to peptider (for mitokondrie-målrettet DNA levering), sekvensen for tilsætning af hver komponent er afgørende og bør ikke vendes.
Der er mange plausible ændringer af proceduren. En anden mulighed for infiltrationen af planteceller er anvendelsen af vakuum infiltration, som er i stand til at indføre den komplekse opløsning til hele planter og / eller partielle væv, herunderapikale dannelsesvæv. Til denne alternative procedure, er frøplanter nedsænket i transfektion opløsning, og baseret på det tryk, der genereres af vakuum, er peptid-cargo komplekser tvinges gennem stomata og i plantecellerne (Yoshizumi, T., upublicerede data).
Forbigående genekspression, baseret på undersøgelser under anvendelse af dyreceller, har vist sig at øges med højere DNA-koncentrationer 29-31. Det er vigtigt at bemærke, at forholdet mellem peptid og DNA påvirker de biofysiske egenskaber (størrelse, overfladeladning) af komplekser (figur 4), hvilket påvirker transfektionseffektiviteten; derfor behov for optimale forhold, der skal opretholdes, selv med øget DNA-koncentration.
En af de vigtigste fordele ved at anvende peptider som et gen / protein levering middel er, at dets sekvens er modtagelig for tuning at opfylde den ønskede funktion. For eksempel mitokondrie-targeting domæne af bæreren peptid beskrevet i denne study kan erstattes med chloroplast eller peroxisomale-targeting sekvenser til lokalisering til disse organeller. Mens chloroplast-transformation er muligt i flere anlæg ved hjælp biolistics 32-34, kunne hverken Agrobacterium eller biolistisk fremgangsmåde introducere gener i mitokondrierne eller andre organeller foruden kernen (tabel 2).
Der er ingen stive vært-range begrænsninger for peptidbaseret transfektion modsætning Agrobacterium -baseret fremgangsmåde (tabel 2). Hidtil har formuleringer til transfektion af A. thaliana, N. benthamiana og poppel blevet optimeret (tabel 1), men fremgangsmåden kan også anvendes til Nicotiana tabacum, tomat kultivar Micro-Tom, ris (baseret på indledende forsøg), og andre mono- og tokimbladede planter.
Endnu er der ingen kendt begrænsning i transgen størrelse, når peptider anvendes ens transfektion vektorer. I modsætning hertil er der fundet store DNA-molekyler til at reducere transformationseffektivitet på Agrobacterium-medieret metoder 35,36, og en øvre størrelsesgrænse for transgener på ca. 200 kb er blevet rapporteret 37-39. Brug af biolistics, på den anden side store DNA-fragmenter kan blive klippet under fremstillingen eller levering til planter 38. Selv om ingen øvre grænse er blevet bestemt for biolistisk transformation hidtil har fysisk begrænser vist sig at begrænse størrelsen af DNA, som kan overføres til meget mindre end 150 kb 40. De største fordele ved at anvende peptid-baseret system til genoverførsel i forhold til eksisterende fremgangsmåder, der anvender enten Agrobacterium eller mikroprojektilbombardement, diskuteret ovenfor, er opsummeret i tabel 2.
Et par begrænsninger findes for denne metode, som den er. For det første målrettet afgivelse af pDNA til specifikke organeller, såsom mitochondria, har vist sig muligt ved en simpel kombination af DNA-bindende, celle-gennemtrængende og organel-transit-sekvenser selv om effektiviteten var lav. Transgenekspression kunne påvises, ved konfokal mikroskopi, kun i en lille population af mitokondrier i cellerne. Derfor er det nødvendigt for yderligere ændringer: (i) øge translokation af flere komplekser over cellen / organellar membran, og (ii) at forbedre dissociation og overførsel af pDNA fra luftfartsselskabet peptid ind i målet organel for ekspression. For det andet ved anvendelse af dette DNA leveringssystem, transient ekspression af exogene reportergener blev succes opnået i den cytosoliske og mitokondriel rum i celler. Stabil inkorporering og ekspressionen af de indførte gener i atomkraftværket / organellar genom er endnu ikke fastlagt, men på grund af manglen på egnede selektionsstrategier.
Erkender, at der er områder til forbedringer eller videre ddvikling, peptid-afledte strategi beskrives her fortsat en enkel og alsidig teknik, der har banet vejen for levering af forskellige ladninger i forskellige anlægstyper.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende finansiering fra Japan Science and Technology Agency sonderende forskning for Advanced Technology (JST-ERATO), den Nye Energi og Industrial Technology Development Organization (NEDO), og Cross-ministerielle Promotion Program Strategic Innovation (SIP), Japan .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (KH)9-BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL |
| (BP100)2-K8 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK |
| BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYL |
| Cytcox-(KH)9 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH |
| P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10) |
| pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751) |
| dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39) |
| GFP5 siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| CHS siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| 1 ml and 10 ml Plastic Syringes | TERUMO Corporation | SS-01T, SS-10ESZ | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | AS ONE Corporation | 151212 | |
| 96-Well Flat-Bottom Plate | Asahi Glass Co., Ltd. | 3860-096 | |
| Adhesive Tape | Sekisui Chemical Co., Ltd. | No. 835 | |
| Alcohol Dehydrogenase | Sigma-Aldrich Co., LLC. | A-7011 | |
| Atomic Force Microscope | Seiko Instruments Inc. | SPI3800, SPA 300HV | |
| Atomic Force Microscope | Hitachi High-Tech Science Corporation | AFM5300E | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | 23227 | |
| Cantilever | Hitachi High-Tech Science Corporation | K-A102001593 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Cork Borer | Sigma-Aldrich Co., LLC. | Z165220 | For excision of leaves into 1-cm diameter disks |
| Coverslip | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C02261 | |
| Cuvette | Sarstedt | 759116 | |
| Folded Capillary Cell | Malvern Instruments, Ltd. | DTS1070 | |
| Forceps | Shimizu Akira Inc. | Stainless pincet 150 | |
| Homogenization Pestle | Ieda Trading Corp. | 9993 | |
| Mica | Nisshin EM Co., Ltd. | LC23Z | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | BKA46472 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices Corporation | Spectra MAX M3 | |
| Microscope Slide | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S011120 | |
| Pipette | Eppendorf Research® plus | 3120000909 | |
| Pipette Tips | AS ONE Corporation | 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03 | |
| Plastic Petri Dish | AS ONE Corporation | 1-7484-01 | |
| Renilla Luciferase Assay Kit | Promega corporation | E2810 | |
| Rhodamine B Isothiocyanate | Sigma-Aldrich Co., LLC. | 283924 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Sodium Carbonate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-01585 | |
| Surgical Blade and Handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle) | |
| Syringe Tip Cap | Musashi Engineering Inc. | NC-3E | |
| Weighing Balance | Sartorius | CPA225D | |
| Zeta Potentiometer | Malvern Instruments, Ltd. | Zetasizer Nano-ZS |
References
- Altman, A., Hasegawa, P. M. Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).
- Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
- Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
- Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
- Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
- Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
- Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).
- Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
- Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
- Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
- Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
- Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
- Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
- Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
- Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
- Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
- Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
- Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751 (2015).
- Plant transformation method. Patent. Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. , WO2015133652 A1 (2015).
- Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).
- Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
- Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
- Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
- Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
- Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
- Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
- Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
- Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P.
- Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
- Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
- Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
- Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).
- Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
- Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).
