Protocol
1. Framställning av en peptid-baserade formuleringar
- Framställa stamlösningar av varje peptid enligt följande: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml eller 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) och (BP100) 2 K 8 (70 ^ M). Väg den erforderliga mängden av varje peptid i en 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt autoklaverat ultrarent vatten för att lösa peptiden. Blanda väl genom upprepad pipettering tills en klar lösning erhålls.
- Amplifiera och rena plasmid-DNA (pDNA), dubbelsträngat DNA (dsDNA) och dubbelsträngat RNA (dsRNA) i enlighet med standardmässiga molekylärmetoder. I 1,5 ml mikrocentrifugrör, göra stamlösningar med en koncentration av 1 mg / ml (pDNA och dsDNA) eller 400 nM (dsRNA).
- Bereda proteinstamlösning med en koncentration av 7 uM, genom upplösning av 1 mg av protein (t ex., Alkoholdehydrogenas, ADH) pulver i 1 ml natriumkarbonatlösning (0,1 M, pH 9). Märka proteinet med fluorescent prober såsom rodamin B (RhB) enligt standardprotokoll för att möjliggöra mikroskopisk visualisering av proteinet avges in i celler.
- Kombinera de respektive komponenterna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- För peptid-pDNA formuleringar inriktning cytoplasman, tillsätt 6,4 pl (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) till 20 pl pDNA (1 mg / ml) och blanda väl genom att pipettera. Låt blandningen stabiliseras under 15 minuter vid 25 ° C. Lägga 773.6 il autoklaverat ultrarent vatten för att späda lösningen till en slutlig volym av 800 | il. Använd pDNA konstruktion avsedd för kärn uttryck (P35S-RLuc-TNOS, Tabell 1).
- För peptid-pDNA formuleringar inriktning mitokondrierna, tillsätt 6,6 pl Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) till 20 pl pDNA (1 mg / ml) och blanda väl genom att pipettera. Låt blandningen stabiliseras under 15 minuter vid 25 ° C och tillsätt sedan 2,4 | il av BP100 (1 mg / ml). Låt blandningen stabiliseras under 15 min vid 256; C under ytterligare 15 min. Lägg 771 | il autoklaverat ultrarent vatten för att späda lösningen till en slutlig volym av 800 | il. Använd pDNA konstruktion avsedd för mitokondriell uttryck (pDONR-COX2: rluc, tabell 1).
- För peptid-dsDNA formuleringar till 5,1 pl (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) till 8 pl dsDNA (1 mg / ml) och blanda väl genom att pipettera. Låt blandningen stabiliseras under 15 minuter vid 25 ° C. Lägga 786,9 | il autoklaverat ultrarent vatten för att späda lösningen till en slutlig volym av 800 | il.
- För peptid-dsRNA formuleringar, tillsätt 50 pl (KH) 9 -BP100 (800 Nm) till 50 pl dsRNA (400 nM) och blanda väl genom att pipettera. Låt blandningen stabiliseras under 15 minuter vid 25 ° C. Lägg 700 ul av RNas-fritt vatten för att späda lösningen till en slutlig volym av 800 | il.
- För peptid-proteinformuleringar, tillsätt 16 pl (BP100) 2 K 8 (70 ^ M) till 16 pl ADH (7 iM) och blandaväl genom pipettering. Låt blandningen stabiliseras under 15 minuter vid 25 ° C. Lägg 768 | il autoklaverat ultrarent vatten för att späda lösningen till en slutlig volym av 800 | il.
- Göra det möjligt för formuleringar för att stabilisera under 15 minuter vid 25 ° C.
2. Karakterisering av peptidbaserad Formuleringar
- Överför varje lösning (800 pl) i en kyvett för dynamisk ljusspridning (DLS) analys. Bestämma index hydrodynamisk diameter och polydispersitet av bildade komplex med en zeta Nanosizer, med användning av en 633 nm He-Ne-laser vid 25 ° C med en backscatter detekteringsvinkel av 173 °.
- Följande mätningar storlek, överför varje lösning (800 | j, l) till ett vikt kapillärcell för zeta potentialmätningar vid förvalda parametrar för dielektricitetskonstant, brytningsindex och viskositeten hos vatten vid 25 ° C.
- Observera en liten volym av komplexlösningen, som används för DLS-analys, genom atomkraftsmikroskopi (AFM). Insättning 10 pl komplexlösningen på den nyexponerade klyvs ytan av ett glimmerblad och lämnar glimmer lufttorka över natten i en täckt petriskål av plast.
- Får en bild av komplexen i luft vid 25 ° C med användning av en kisel fribärande med en fjäderkonstant av 1,3 N / m i gängläge 27,28.
3. Infiltration av blad
- Använd tre veckor gamla jordodlade plantor (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 eller poppel 26). Transfektera minst 3 blad att tjäna som triplikat för kvantifiering av genexpression eller protein leverans.
- Ladda en 1 ml nållös plastspruta med 100 pl av komplexlösningen för transfektion av en blad. Placera spetsen på sprutan på abaxial ytan av bladet.
- Tryck på sprutspetsen mot bladet något och tryck sprutkolven långsamt medan utövar ett mottryck med iNDEX fingret av en latex-behandskade handen från den motsatta sidan. Framgångsrik infiltration kan observeras som spridningen av en vattenindränkt område i bladet. Märk infiltrerade blad för att underlätta identifiering.
- Inkubera transfekterade blad för optimerade varaktigheter efter infiltrering med peptid-pDNA (12 tim), peptid-dsDNA (12 tim), peptid-dsRNA (9-48 h) och peptid-protein (6 h) formuleringar under följande betingelser: 16 timmar ljus / 8 timmar mörker vid 22 ° C för A. thaliana och poppel, eller 24 timmar konstant ljus vid 29 ° C för N. benthamiana.
4. Utvärdering av transfektionseffektiviteten
- Skära hela transfekterade blad mindre anläggningar (eg., A. thaliana) eller en 1 cm 2 sektion av infiltrerade regionen för större anläggningar (eg., N. benthamiana).
- För transfektionsexperiment med användning av Renilla luciferas (Rluc) reportervektor, fastställa vilken transfection effektivitet kvantitativt med användning av en Rluc Assay Kit.
- Placera varje utskurna blad eller bladsektion i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 100 pl av 1 × Rluc Assay lyseringsbuffert per rör. På samma sätt, förbereda lysat av icke-transfekterade kontrollblad (triplikat).
- Slipa bladet med hjälp av en homogenisering mortelstöt och inkubera den resulterande lysatet vid 25 ° C under 6 - 10 h.
- Centrifugera lysatet vid 12.470 x g i en mikrocentrifug under 1 min. Överföring 20 | il av klarnat lysat till en brunn i en 96-brunnars mikroplatta, och använda den återstående volymen för kvantifiering av total proteinkoncentration med användning av en BCA Protein Assay Kit enligt tillverkarens protokoll.
- Tillsätt 100 pl av 1 × Rluc Assay Substrate (utspädd med användning av Rluc analysbuffert) i brunnen och blanda genom långsam pipettering. Placera mikro i en multimikroplattläsare och initiera mätningen.
- Subtrahera bakgrunden luminiscens (medelvärde av någonn-transfekterade triplikat) från varje experimentell provets luminiscens. Beräkna förhållandet mellan fotoluminiscens (relativa ljusenheter, RLU) till mängden av protein (mg).
- För transfektionsexperiment med hjälp av grönt fluorescerande protein (GFP) reportervektor eller fluorescerande protein (eg., ADH-RhB), observera fluorescens med hjälp av en konfokala laserskanning mikroskop.
- Skär kanterna av en hela blad (för att underlätta avlägsnandet av luftutrymmen), medan en sektionerad blad kan användas som den är. Avlägsna kolven från en 10 ml spruta och placera varje utskurna blad eller bladsektion i sprutan.
- Byt ut kolven och skjut försiktigt till botten av sprutan utan att krossa bladet. Dra in vatten i sprutan tills den är ungefär hälften fylld.
- Rikta sprutan uppåt och tryck in kolven för att avlägsna luft från sprutan genom spetsen. Täck spetsen på sprutan och dra sakta in kolven för att driva ut luft från leaf. Upprepa denna process flera gånger tills bladet visas genomskinlig.
- Täcka ytan av ett objektglas med tejp. Skära en kvadratisk yta på bandet tillräckligt stor för att rymma provblad med användning av ett blad, och skala den fyrkantiga tejpbit av med pincett för att skapa en provkammare. Bandet kommer att fungera som en distans mellan sliden och täck.
- Placera bladet i kammaren med abaxial ytan vänd uppåt och fyll den återstående kammarområdet med vatten. Försegla bladet inuti kammaren med ett täckglas och säkra kanterna på täckglas med tejp.
- Undersök provet blad med hjälp av konfokal laserscanning mikroskop under en 40X objektiv eller en 63x nedsänkning i vatten mål. GFP eller RhB fluorescens kan visualiseras vid exciteringsvåglängder av 488 nm eller 555 nm, respektive.
Representative Results
En rad nukleinsyra och proteinlaster framgångsrikt införts i olika växter med hjälp av konstruerade peptider som leverans vektorer. Elektrostatiska interaktioner mellan katjoniska peptider och negativt laddade laster resulterade i bildningen av transfektion komplex som kan direkt infiltreras i växtblad med användning av en nållös spruta (figur 1). Optimerade formuleringar (empiriskt bestämda i dessa studier 21,23-26) för transfektion av växtceller är uppräknade i tabell 1, där varje typ av det stora utbudet av levererade laster (pDNA, dsDNA, dsRNA och protein) är representerad. De genomsnittliga diametrarna av alla peptidbaserade formuleringar var i det ungefärliga området 150-300 nm. Baserat på DLS-analys, alla formuleringar visade relativt låga storleks polydispersiteter, vilket indikerar att de bildade peptid-cargo aggregaten har en likformig storleksfördelning. De morfologierkomplex mellan peptid och pDNA (figur 2A) eller protein (figur 2B), på glimmer, avbildades med AFM. Homogena klotformiga komplex observerades för båda peptid pDNA och peptid-proteinkombinationer, i överenskommelse med data från DLS mätningar. När det gäller zeta-potentialen för komplex (tabell 1), pDNA- och dsDNA-härledda komplex hade negativ netto ytladdningar medan dsRNA-baserade komplex hade en nära-neutral ytladdning. Peptid-protein-komplex, å andra sidan, var positivt laddade.
Effektivitetsvinsterna av peptid pDNA och peptid-dsDNA formuleringar i medla transfektion av A. thaliana eller N. benthamiana som modell växtsystem utvärderades kvantitativt såväl som kvalitativt. Den RLuc genuttryck analys användes för kvantifiering av genuttryck nivåer (tabell 1), därför att detta experiment pDNA ellerdsDNA som kodar för RLuc genen måste användas för komplex med respektive bärarpeptider. Använda (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering kärn målinriktad leverans och uttryck av pDNA kan uppnås, efter en inkubationstid på 12 timmar, med en beräknad RLU / mg värde av cirka 1 x 10 5. För mitokondriell riktade leverans och uttryck av pDNA, en kombination av peptider, Cytcox- (KH) 9 och BP100 krävs för komplexbildning. Med samma optimerade inkubationstiden för 12 timmar, var dock en mycket lägre nivå av transfektion (cirka 1 x 10 3 RLU / mg) uppnås. Samtidigt var liknande inkubationstiden (12 timmar) och genuttryck nivå (ca 1 x 10 3 RLU / mg) som krävs / noterats för dsDNA-baserade komplex, också med användning av det (KH) 9 -BP100 peptid. Kvalitativa bedömningar av genexpression genomfördes genom direkt mikroskopisk observation av bladen behandlades med komplex prepared hjälp av pDNA eller dsDNA som kodar för GFP-reportergenen. I celler transfekterade med peptid-pDNA komplex icke riktade, diffus grön fluorescens motsvarande GFP uttryck klart observeras och fann att lokalisera i cytosolen (Figur 3A). Tydliga skillnader i lokaliseringen mönster av GFP fluorescens var uppenbara i celler infiltrerade med mitokondrie-riktade peptid pDNA komplex. Här, punktuell grön fluorescens som colocalize med mitokondrie fläck var synlig, vilket bekräftar specificiteten av genuttryck uteslutande i den mitokondrieutrymmet i celler (figur 3B).
I fallet med peptid-proteinformuleringar, kommer konjugering av last proteinet (ADH) till en fluorofor (RhB) möjliggöra visualisering av den levererade proteinet i det intracellulära utrymmet. Inom en kort inkubationstid på sex timmar, var ADH-RhB protein (blå) fann att fördelas över helacytosolen och vakuolen infiltrerade celler (Figur 3C). Samtidigt kan en snabb och effektiv nedreglering av genuttryck åstadkommas på olika anläggningar som använder peptid-dsRNA formuleringar. I det första experimentet var A. thaliana blad infiltrerade med peptid-dsRNA-komplex för att tysta chalkonsyntas genen (CHS) som ansvarar för antocyanin (rött pigment) biosyntes i torka. Skillnaden i utseende A. thaliana blad under normala (figur 3D, a) och torka (figur 3D, b) förutsatt ett enkelt sätt att utvärdera CHS tystande med den optimerade peptid-dsRNA formulering (pil 1 visar infiltrerade regionen). I det andra experimentet, var peptid-dsRNA-komplex infiltreras i bladen av transgena A. thaliana som uttrycker gult fluorescerande protein (YFP). En uppenbar minskning i YFP uttryck kunde ses i de epidermala cellerna 9 h post-transfektion (Figur 3E, F). Effektiviteten hos formuleringen i nedreglera genuttryckning i en annan växtsystemet (poppel, 12 h efter transfektion) verifierades också (figur 3G, H).
Figur 1: Peptid-baserade formuleringar för leverans av nukleinsyran och proteinet last i levande växter.
De designade bärarpeptider består av polykatjoner konjugerade till cell penetrerande eller organeller transitsekvenser. Polykatjoner möjliggör bindning och / eller kondensation av negativt laddade laster samt flykt från det endosomala utrymmet efter interna i celler. Leverans av laster i celler och därefter till specifika organeller förmedlas av cellpenetrerande sekvenser och organeller transitsekvenser, respektive. Olika laster som kan vara successfully levereras in i växten innefattar nukleinsyror såsom pDNA, dsDNA och dsRNA, samt modellproteiner såsom bovint serumalbumin (BSA), alkoholdehydrogenas (ADH) och citrin (en variant av gult fluorescerande protein). Bioaktiva molekylerna kan bilda transfektion komplex med peptidkonjugat via elektrostatiska interaktioner, som förs in växtblad med spruta infiltration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: morfologier av peptid-baserade formuleringar.
(A) AFM amplitud bild av (KH) 9 -BP100 / pDNA formuleringen vid N / P 0,5. (B) AFM höjd bild av (BP100) 2 K 8 / ADH formuleringen vid molar ratio 10. Återgivet med tillstånd från publicerade källor 23,24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mikroskopisk utvärdering av transfektionseffektivitet genom optimerad peptidbaserade formuleringar.
(A) cytosoliska GFP uttryck (grön), klart skiljer sig från kloroplast autofluorescens (röd), observerades i den svampiga mesofyllceller av A. thaliana blad infiltrerats med (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5; 12 tim ). (B) GFP uttryck (grön) upptäcktes i mitokondrierna (röd) i epidermala celler av A. thaliana blad infiltrerade med Cytcox- (KH) 9 / BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5 för varje peptide; 12 h). Förstorade bilder av mitokondrier med GFP-uttryck visas i den extrema högra panelen. (C) Leverans av ADH-RhB (blå) i den svampiga mesofyllceller av A. thaliana blad förmedlas av (BP100) 2 K 8 vid ett peptid / protein molförhållande av 10, visualiseras 6 h efter infiltration. (D) A. thaliana blad före (a) och efter (b) behandling med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molförhållande 2, 48 timmar), vilket resulterade i undertryckande av antocyanin biosyntesvägen. En liknande formulering innehållande GFP5 dsRNA infiltrerades in i bladet som negativ kontroll (c). Pilar 1 och 3 indikerar infiltrerade området medan pilar 2 och 4 indikerar icke-infiltrerade område inom bladet. (E) A. thaliana blad som uttrycker gult fluorescerande protein (YFP) och (F) den minskade YFP-fluorescens efter infiltrering med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molförhållande 2, 9 h). (G) Transgena poppel blad uttrycker gul fluorescerande protein (YFP) och (H) den minskade YFP fluorescens efter infiltration med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molförhållande 2; 12 timmar). Återges med tillstånd från publicerade källor 21,23,24,26. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Variation i peptid-till-DNA (N / P) Ratio och effekten på biofysiska egenskaper av komplex.
Med ökande peptid till DNA-förhållande, peptidbaserade formuleringar minskar i storlek medan deras Zeta-potentialen värden övergång från negativt till positivt./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Karakterisering och utvärdering av olika peptidbaserade formuleringar. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 2: En jämförelse av peptid-baserade och andra befintliga DNA Leverans Teknik för intakta växter. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Discussion
Kritiska steg i det protokoll som har identifierats empiriskt diskuteras. Med injektionsspruta infiltration, är peptidbaserade formuleringar införs i luftrum inuti växters blad genom klyvöppningarna. För att säkerställa maximal upptagning av lösningen, bör infiltration processen utföras när växterna är under förhållanden som främjar stomata öppning dvs., Försedda med tillräckligt med vatten och under den ljusa perioden. När det gäller framställning av transfektion komplex, för formuleringar som innebär en kombination av två peptider (för mitokondrie inriktade DNA leverans), är sekvensen för tillsats av varje komponent avgörande och bör inte vändas.
Det finns många tänkbara modifieringar av förfarandet. Ett annat alternativ för infiltration av växtceller är användningen av vakuuminfiltration, som har förmåga att införa den komplexa lösningen till hela växter och / eller partiella vävnader inkluderandeapikala meristem. För detta alternativa förfarande är plantor nedsänkt i transfektion lösning, och baserat på det tryck som genereras av vakuum, är peptid-lastkomplex tvingas genom klyvöppningarna och in i växtceller (Yoshizumi, T., opublicerade data).
Transient genuttryck, baserat på studier med djurceller har visat sig öka med högre DNA-koncentrationer 29-31. Det är viktigt att notera att förhållandet mellan peptid och DNA påverkar biofysiska egenskaper (storlek, ytladdning) av komplex (Figur 4), som påverkar transfektionseffektiviteten; hence, måste det optimala förhållandet för att upprätthållas även med ökad DNA-koncentration.
En av de största fördelarna med att använda peptider som en gen / protein leverans agent är att dess sekvens är mottaglig för tuning att uppfylla en önskad funktion. Till exempel, det mitokondriella-målsökande domän av bäraren peptiden som beskrivs i denna study kan ersättas med kloroplast eller peroxisomala inriktning sekvenser för lokalisering till dessa organeller. Medan kloroplast-transformation är möjlig i flera anläggningar med hjälp av biolistik 32-34, kunde varken Agrobacterium eller den biolistiska metoden införa gener i mitokondrier eller andra organ förutom kärnan (tabell 2).
Det finns inga stela värd-range begränsningar för peptidbaserad transfektion, till skillnad från Agrobacterium -baserad metod (tabell 2). Hittills har formuleringar för transfektion av A. thaliana, N. benthamiana och poppel optimerats (tabell 1), men metoden kan också tillämpas för Nicotiana tabacum, tomat sort Micro-Tom, ris (baserat på preliminära experiment), och andra mono- och dikotyledona växter.
Ännu finns det ingen känd begränsning i transgen storlek när peptider används ens transfektion vektorer. Däremot har stora DNA-molekyler har visat sig minska omvandlingseffektiviteten av Agrobacterium-medierad metoder 35,36, och en övre storleksgräns för transgener av cirka 200 kb har rapporterats 37-39. Med användning biolistik, å andra sidan, stora DNA-fragment kan skjuvas under framställning eller leverans till växter 38. Även om ingen övre gräns har fastställts för biolistisk transformation hittills har fysiska hållande visat att begränsa storleken på DNA som kan överföras till mindre än 150 kb 40. De stora fördelarna med att använda peptidbaserade system för genöverföring jämfört med befintliga metoder som utnyttjar antingen Agrobacterium eller mikro bombardemang, som diskuterats ovan, är sammanfattade i tabell 2.
Några begränsningar finns för denna metod som det står. För det första, målinriktad leverans av pDNA till specifika organeller, såsom mitochondria, har bevisats möjligt genom en enkel kombination av DNA-bindande, cellpenetrerande och organell-transitsekvenser fastän effektiviteten var låg. Transgenexpression kunde detekteras genom konfokalmikroskopi, endast i en liten population av mitokondrier i celler. Därför ytterligare modifieringar är nödvändiga för att: (i) öka translokation av mer komplex över cellen / organeller membran, och (ii) att förbättra dissociation och överföring av pDNA från bäraren peptiden i målet organell för expression. För det andra, med hjälp av detta DNA-leveranssystem, övergående uttryck av exogena reportergener uppnåddes framgångsrikt i den cytosoliska och mitokondriella utrymmet i celler. Stabil inkorporering och uttryck av de införda generna i växt nukleära / organeller genom har inte fastställts ännu, men på grund av avsaknaden av lämpliga urvalsstrategier.
Samtidigt som man erkänner att det finns områden som kan förbättras eller ytterligare dtveckling peptiden härrörande strategi som beskrivs här är fortfarande en enkel och mångsidig teknik som har banat väg för leverans av olika laster i olika växtsorter.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för finansiering från Japan Science and Technology Agency Exploratory Research for Advanced Technology (JST-ERATO), den Nya Energin och Industriteknik Development Organization (NEDO), och korset-minister strategiska innovations Promotion Program (SIP), Japan .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (KH)9-BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL |
| (BP100)2-K8 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK |
| BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYL |
| Cytcox-(KH)9 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH |
| P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10) |
| pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751) |
| dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39) |
| GFP5 siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| CHS siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| 1 ml and 10 ml Plastic Syringes | TERUMO Corporation | SS-01T, SS-10ESZ | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | AS ONE Corporation | 151212 | |
| 96-Well Flat-Bottom Plate | Asahi Glass Co., Ltd. | 3860-096 | |
| Adhesive Tape | Sekisui Chemical Co., Ltd. | No. 835 | |
| Alcohol Dehydrogenase | Sigma-Aldrich Co., LLC. | A-7011 | |
| Atomic Force Microscope | Seiko Instruments Inc. | SPI3800, SPA 300HV | |
| Atomic Force Microscope | Hitachi High-Tech Science Corporation | AFM5300E | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | 23227 | |
| Cantilever | Hitachi High-Tech Science Corporation | K-A102001593 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Cork Borer | Sigma-Aldrich Co., LLC. | Z165220 | For excision of leaves into 1-cm diameter disks |
| Coverslip | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C02261 | |
| Cuvette | Sarstedt | 759116 | |
| Folded Capillary Cell | Malvern Instruments, Ltd. | DTS1070 | |
| Forceps | Shimizu Akira Inc. | Stainless pincet 150 | |
| Homogenization Pestle | Ieda Trading Corp. | 9993 | |
| Mica | Nisshin EM Co., Ltd. | LC23Z | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | BKA46472 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices Corporation | Spectra MAX M3 | |
| Microscope Slide | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S011120 | |
| Pipette | Eppendorf Research® plus | 3120000909 | |
| Pipette Tips | AS ONE Corporation | 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03 | |
| Plastic Petri Dish | AS ONE Corporation | 1-7484-01 | |
| Renilla Luciferase Assay Kit | Promega corporation | E2810 | |
| Rhodamine B Isothiocyanate | Sigma-Aldrich Co., LLC. | 283924 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Sodium Carbonate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-01585 | |
| Surgical Blade and Handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle) | |
| Syringe Tip Cap | Musashi Engineering Inc. | NC-3E | |
| Weighing Balance | Sartorius | CPA225D | |
| Zeta Potentiometer | Malvern Instruments, Ltd. | Zetasizer Nano-ZS |
References
- Altman, A., Hasegawa, P. M. Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).
- Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
- Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
- Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
- Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
- Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
- Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).
- Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
- Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
- Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
- Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
- Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
- Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
- Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
- Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
- Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
- Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
- Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751 (2015).
- Plant transformation method. Patent. Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. , WO2015133652 A1 (2015).
- Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).
- Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
- Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
- Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
- Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
- Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
- Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
- Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
- Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. Plastid transformation. Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).
- Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
- Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
- Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
- Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).
- Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
- Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).
