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Genetics

पेप्टाइड व्युत्पन्न विधि पौधों में सेलुलर के उस पार जीन और प्रोटीन और Organellar बाधाओं को परिवहन करने के लिए

Published: December 16, 2016 doi: 10.3791/54972
Automatic Translation
1, 1, 1
1Enzyme Research Team, RIKEN Center for Sustainable Resource Science

Protocol

1. पेप्टाइड आधारित योगों की तैयारी

  1. इस प्रकार के रूप में प्रत्येक पेप्टाइड का जायजा समाधान तैयार: (एच) 9 -BP100 (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर या 800 एनएम), Cytcox- (एच) 9 (1 मिलीग्राम / एमएल), BP100 (1 मिलीग्राम / एमएल) और (BP100) 2 कश्मीर 8 (70 माइक्रोन) के। एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक पेप्टाइड के लिए आवश्यक राशि वजन और पेप्टाइड भंग करने के लिए autoclaved ultrapure पानी जोड़ें। दोहराया pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स होने तक एक स्पष्ट समाधान प्राप्त की है।
  2. बढ़ाना और प्लास्मिड डीएनए (pDNA), डबल असहाय डीएनए (dsDNA) और डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) मानक आणविक के तरीके के अनुसार शुद्ध। 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में, 1 मिलीग्राम / एमएल (pDNA और dsDNA) या 400 एनएम (dsRNA) के एक एकाग्रता के साथ शेयर समाधान करते हैं।
  3. सोडियम कार्बोनेट समाधान (0.1 एम, पीएच 9) के 1 मिलीलीटर में प्रोटीन (जैसे।, शराब डिहाइड्रोजनेज, ADH) पाउडर का 1 मिलीग्राम भंग द्वारा, 7 माइक्रोन की एकाग्रता के साथ प्रोटीन शेयर समाधान तैयार है। एफ के साथ प्रोटीन लेबलमानक प्रोटोकॉल के अनुसार इस तरह के rhodamine बी (RhB) के रूप में luorescent जांच प्रोटीन कोशिकाओं में कर दिया की सूक्ष्म दृश्य सक्षम करने के लिए।
  4. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में संबंधित घटकों का मिश्रण।
    1. पेप्टाइड pDNA योगों कोशिका द्रव्य को निशाना बनाने के लिए, pDNA (1 मिलीग्राम / एमएल) के 20 μl करने के लिए (एच) के 6.4 μl 9 -BP100 (1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। मिश्रण 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए स्थिर करने की अनुमति दें। 800 μl के अंतिम मात्रा का हल कमजोर करने के लिए autoclaved ultrapure पानी की 773.6 μl जोड़ें। PDNA परमाणु अभिव्यक्ति (P35S-RLuc-TNOS, 1 टेबल) के लिए डिजाइन निर्माण का प्रयोग करें।
    2. पेप्टाइड pDNA योगों माइटोकॉन्ड्रिया को निशाना बनाने के लिए, pDNA (1 मिलीग्राम / एमएल) के 20 μl करने के लिए (एच) 9 (1 मिलीग्राम / एमएल) Cytcox- के 6.6 μl जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। मिश्रण 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए और फिर स्थिर BP100 के 2.4 μl (1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए अनुमति दें। मिश्रण 25 से 15 मिनट के लिए स्थिर करने की अनुमति6, एक और 15 मिनट के लिए सी। 800 μl के अंतिम मात्रा का हल कमजोर करने के लिए autoclaved ultrapure पानी के 771 μl जोड़ें। PDNA mitochondrial अभिव्यक्ति (: rluc, 1 टेबल pDONR-COX2) के लिए डिजाइन निर्माण का प्रयोग करें।
    3. पेप्टाइड dsDNA योगों के लिए, dsDNA (1 मिलीग्राम / एमएल) के 8 μl करने के लिए (एच) के 5.1 μl 9 -BP100 (1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। मिश्रण 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए स्थिर करने की अनुमति दें। 800 μl के अंतिम मात्रा का हल कमजोर करने के लिए autoclaved ultrapure पानी की 786.9 μl जोड़ें।
    4. पेप्टाइड dsRNA योगों के लिए, dsRNA (400 एनएम) के 50 μl करने के लिए (एच) 9 -BP100 (800 एनएम) के 50 μl जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। मिश्रण 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए स्थिर करने की अनुमति दें। 800 μl के अंतिम मात्रा का हल कमजोर करने के लिए RNase मुक्त पानी के 700 μl जोड़ें।
    5. पेप्टाइड प्रोटीन योगों के लिए, ADH के 16 μl (7 सुक्ष्ममापी) से (BP100) 2 कश्मीर 8 (70 माइक्रोन) के 16 μl जोड़ने और मिश्रणअच्छी तरह से pipetting द्वारा। मिश्रण 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए स्थिर करने की अनुमति दें। 800 μl के अंतिम मात्रा का हल कमजोर करने के लिए autoclaved ultrapure पानी के 768 μl जोड़ें।
  5. योगों 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए स्थिर करने की अनुमति दें।

2. पेप्टाइड आधारित योगों की विशेषता

  1. प्रत्येक समाधान (800 μl) गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) के विश्लेषण के लिए एक क्युवेट में स्थानांतरण। एक जीटा nanosizer के साथ बनाई परिसरों की hydrodynamic व्यास और polydispersity सूचकांक का निर्धारण, 173 डिग्री के कोण backscatter का पता लगाने के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर एक 633 एनएम वह-ने लेजर का उपयोग कर।
  2. निम्नलिखित आकार माप, प्रत्येक समाधान (800 μl) एक जोड़ केशिका सेल में जीटा संभावित माप के लिए निरंतर ढांकता हुआ, अपवर्तनांक और पानी की चिपचिपाहट के तयशुदा मापदंडों पर 25 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरण।
  3. जटिल समाधान की एक छोटी मात्रा, डीएलएस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा निरीक्षण करें (AFM)। एक अभ्रक चादर के हौसले उजागर cleaved सतह पर जमा जटिल समाधान के 10 μl और एक कवर प्लास्टिक पेट्री डिश में शुष्क हवा के लिए रात भर अभ्रक छोड़ दें।
  4. 25 डिग्री सेल्सियस पर हवा में परिसरों की एक छवि मोल मोड 27,28 दोहन में 1.3 एन / मीटर की लगातार वसंत के साथ एक सिलिकॉन ब्रैकट का उपयोग कर।

3. संयंत्र के पत्तों की घुसपैठ

  1. 3 सप्ताह पुरानी मिट्टी-बड़े पौधों (Arabidopsis thaliana 24, निकोटियाना benthamiana 24 या चिनार 26) का प्रयोग करें। Transfect जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन वितरण की मात्रा का ठहराव के लिए तीन प्रतियों के रूप में काम करने के लिए कम से कम 3 पत्ते।
  2. एक पत्ती के अभिकर्मक के लिए जटिल समाधान के 100 μl के साथ एक 1 मिलीलीटर needleless प्लास्टिक सिरिंज लोड। पत्ती के abaxial सतह पर सिरिंज की नोक स्थिति।
  3. थोड़ा पत्ती के खिलाफ सिरिंज टिप प्रेस और धीरे धीरे सिरिंज सवार दबाना, जबकि मैं के साथ एक जवाबी दबावविपरीत दिशा से एक लेटेक्स दस्ताने हाथ की उंगली ndex। सफल घुसपैठ पत्ती में एक पानी में भिगो क्षेत्र के प्रसार के रूप में मनाया जा सकता है। पहचान में आसानी के लिए घुसपैठ की पत्तियों लेबल।
  4. पेप्टाइड pDNA (12 घंटा), पेप्टाइड dsDNA (12 घंटा), पेप्टाइड dsRNA के साथ घुसपैठ के बाद अनुकूलित अवधि के लिए ट्रांसफ़ेक्ट पत्ती सेते हैं - निम्नलिखित परिस्थितियों में (9 48 घंटा) और पेप्टाइड प्रोटीन (6 घंटा) योगों: 16 मानव संसाधन प्रकाश / एन benthamiana के लिए 29 डिग्री सेल्सियस पर ए thaliana और चिनार, या 24 घंटा लगातार प्रकाश के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे अंधेरा।

4. अभिकर्मक दक्षता का मूल्यांकन

  1. छोटे पौधों की पूरी ट्रांसफ़ेक्ट पत्ती (जैसे।, ए thaliana) या बड़े पौधों के लिए घुसपैठ क्षेत्र के एक 1 सेमी 2 खंड उत्पाद शुल्क (उदा।, एन benthamiana)।
  2. Renilla luciferase (Rluc) रिपोर्टर सदिश का उपयोग अभिकर्मक प्रयोगों के लिए, transfectio निर्धारितn दक्षता मात्रात्मक एक Rluc परख किट का उपयोग कर।
    1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक excised पत्ता पत्ता या अनुभाग रखें। ट्यूब प्रति 1 × Rluc परख lysis बफर के 100 μl जोड़ें। इसी तरह, गैर ट्रांसफ़ेक्ट नियंत्रण पत्तियों (तीन प्रतियों) की lysates तैयार करते हैं।
    2. पत्ती एक homogenization मूसल का उपयोग पीस और 6 के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर परिणामी lysate सेते - 10 घंटा।
    3. 1 मिनट के लिए एक microcentrifuge में 12,470 × छ lysate अपकेंद्रित्र। स्थानांतरण एक 96 अच्छी तरह से microplate में एक अच्छी तरह से करने के लिए मंजूरी दे दी lysate के 20 μl, और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग कर कुल प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा का ठहराव के लिए शेष मात्रा का उपयोग करें।
    4. कुएं में 1 × Rluc परख सब्सट्रेट (Rluc परख बफर का उपयोग कर पतला) के 100 μl जोड़ें और धीमी गति से pipetting द्वारा मिश्रण। एक बहुपद्वति microplate रीडर में microplate रखें और माप आरंभ करें।
    5. पृष्ठभूमि luminescence घटाएँ (कोई मतलबn ट्रांसफ़ेक्ट प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूना के luminescence से तीन प्रतियों)। प्रोटीन (एमजी) की राशि के लिए photoluminescence के अनुपात (रिश्तेदार प्रकाश इकाइयों, RLU) की गणना।
  3. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) संवाददाता वेक्टर या fluorescently लेबल प्रोटीन का उपयोग अभिकर्मक प्रयोगों के लिए (जैसे।, ADH-RhB), प्रतिदीप्ति एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग कर निरीक्षण करते हैं।
    1. एक पूरी पत्ती (हवा रिक्त स्थान को हटाने की सहायता करने के लिए) के किनारों में कटौती, जबकि एक sectioned पत्ती है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। एक 10 मिलीलीटर सिरिंज से सवार निकालें और सिरिंज में प्रत्येक excised पत्ता पत्ता या अनुभाग जगह है।
    2. सवार बदलें और पत्ती कुचल के बिना सिरिंज के नीचे करने के लिए यह धीरे धक्का। सिरिंज में पानी भरने जब तक यह लगभग आधा भरा है।
    3. सिरिंज ऊपर की तरफ इशारा करते हैं और सवार में धक्का टिप के माध्यम से सिरिंज से हवा निकालने के लिए। सिरिंज की नोक कवर और खींच सवार धीरे धीरे नीचे घास का मैदान से निष्कासित करने के लिए हवाएफ। जब तक पत्ती पारदर्शी प्रतीत होता है इस प्रक्रिया को दोहराएं कई बार।
    4. चिपकने वाला टेप के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड की सतह को कवर। टेप इतना बड़ा एक ब्लेड का उपयोग पत्ती नमूना समायोजित करने पर एक वर्ग क्षेत्र में कटौती, और टेप का चौकोर टुकड़ा संदंश के साथ बंद छील एक नमूना कक्ष बनाने के लिए। टेप स्लाइड और coverslip के बीच एक स्पेसर के रूप में काम करेगा।
    5. abaxial सतह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ कक्ष में पत्ती की जगह और पानी के साथ शेष चैम्बर क्षेत्र को भरने के। एक गिलास coverslip के साथ कक्ष के भीतर पत्ती को सील करने और चिपकने वाला टेप के साथ coverslip के किनारों को सुरक्षित।
    6. एक 40x उद्देश्य के तहत लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग या एक 63X पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग पत्ती नमूना जांच करते हैं। GFP या RhB प्रतिदीप्ति 488 एनएम या 555 एनएम, क्रमशः की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर देखे जा सकते हैं।

Representative Results

न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन कार्गो की एक सरणी सफलतापूर्वक वितरण वैक्टर के रूप में डिजाइन पेप्टाइड्स का उपयोग कर विभिन्न संयंत्रों में पेश किए गए। Cationic पेप्टाइड्स और नकारात्मक आरोप लगाया कार्गो के बीच बातचीत electrostatic अभिकर्मक परिसरों के गठन कि सीधे संयंत्र में घुसपैठ की जा सकती है एक needleless सिरिंज (चित्रा 1) का उपयोग पत्तियों में हुई। अनुकूलित योगों संयंत्र कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए (अनुभव से इन अध्ययनों 21,23-26 में निर्धारित) तालिका 1, जहां से दिया कार्गो (pDNA, dsDNA, dsRNA और प्रोटीन) की व्यापक रेंज के प्रत्येक प्रकार का प्रतिनिधित्व किया है में सूचीबद्ध हैं। 300 एनएम - सभी पेप्टाइड आधारित योगों का मतलब व्यास 150 की अनुमानित रेंज में थे। डीएलएस विश्लेषण के आधार पर, सभी योगों अपेक्षाकृत कम आकार polydispersities दिखाया गया है, यह दर्शाता है कि गठन पेप्टाइड-माल समुच्चय एक समान आकार के वितरण की है। के morphologiesपेप्टाइड और pDNA (2A चित्रा) या प्रोटीन (चित्रा 2 बी) के बीच परिसरों, अभ्रक पर, AFM द्वारा imaged थे। सजातीय गोलाकार परिसरों दोनों पेप्टाइड pDNA और पेप्टाइड प्रोटीन के संयोजन के लिए मनाया गया, डीएलएस माप से डेटा के साथ समझौते में। परिसरों (1 टेबल) की क्षमता जीटा के संदर्भ में, pDNA- और dsDNA व्युत्पन्न परिसरों शुद्ध नकारात्मक सतह प्रभार था, जबकि dsRNA आधारित परिसरों एक के पास तटस्थ सतह आरोप था। पेप्टाइड प्रोटीन परिसरों, दूसरे हाथ पर, सकारात्मक आरोप लगाया गया था।

पेप्टाइड pDNA और ए thaliana या मॉडल संयंत्र प्रणाली के रूप में एन benthamiana के अभिकर्मक मध्यस्थता में पेप्टाइड dsDNA योगों की क्षमता गुणात्मक रूप में रूप में अच्छी तरह मात्रात्मक मूल्यांकन किया गया। RLuc जीन अभिव्यक्ति परख इस प्रयोग pDNA के लिए, जीन अभिव्यक्ति के स्तर की मात्रा का ठहराव (तालिका 1) के लिए नियुक्त किया गया था इसलिए, याdsDNA RLuc जीन एन्कोडिंग संबंधित वाहक पेप्टाइड्स के साथ complexation के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। ,, (एच) 9 -BP100 / pDNA निर्माण, परमाणु-लक्षित वितरण और pDNA की अभिव्यक्ति प्राप्त किया जा सकता का उपयोग करना लगभग 1 × 10 5 के एक अनुमान के अनुसार RLU / मिलीग्राम मूल्य के साथ 12 घंटे की एक ऊष्मायन अवधि के बाद। Mitochondrial-लक्षित वितरण और pDNA, पेप्टाइड्स का एक संयोजन की अभिव्यक्ति के लिए, Cytcox- (एच) 9 और BP100, जटिल गठन के लिए आवश्यक है। 12 घंटा का एक ही अनुकूलित ऊष्मायन अवधि के साथ, तथापि, अभिकर्मक (लगभग 1 × 10 3 RLU / मिलीग्राम) की एक बहुत कम स्तर प्राप्त कर ली गई थी। इस बीच, समान ऊष्मायन अवधि (12 घंटे) और जीन अभिव्यक्ति के स्तर (लगभग 1 × 10 3 RLU / मिलीग्राम) के लिए आवश्यक था, dsDNA आधारित परिसरों के लिए दर्ज की गई है / भी (एच) 9 -BP100 पेप्टाइड का उपयोग कर तैयार की है। जीन अभिव्यक्ति की गुणात्मक आकलन पत्तियों का प्रत्यक्ष सूक्ष्म अवलोकन परिसरों prepar के साथ इलाज से बाहर किए गएएड pDNA का उपयोग कर या dsDNA GFP संवाददाता जीन एन्कोडिंग। गैर लक्षित पेप्टाइड pDNA परिसरों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में, हरी प्रतिदीप्ति इसी GFP अभिव्यक्ति के साथ स्पष्ट रूप से मनाया गया और cytosol (चित्रा 3 ए) में स्थानीयकरण पाया फैलाना। GFP प्रतिदीप्ति का स्थानीयकरण पैटर्न में स्पष्ट मतभेद mitochondrial-लक्षित पेप्टाइड pDNA परिसरों के साथ घुसपैठ की कोशिकाओं में स्पष्ट किया गया है। इधर, कबरा हरी प्रतिदीप्ति कि mitochondrial दाग के साथ colocalize दिखाई दे रहा था, कोशिकाओं की mitochondrial डिब्बे (चित्रा 3 बी) में विशेष रूप से जीन अभिव्यक्ति की विशिष्टता की पुष्टि।

पेप्टाइड प्रोटीन योगों के मामले में, प्रोटीन माल (ADH) एक fluorophore (RhB) के विकार intracellular डिब्बे में दिया प्रोटीन के दृश्य के लिए सक्षम हो जाएगा। 6 घंटा की एक छोटी ऊष्मायन अवधि के भीतर, ADH-RhB प्रोटीन (ब्लू) भर में वितरित किया जाना पाया गया थाcytosol और घुसपैठ की कोशिकाओं के कोटर (चित्रा 3 सी)। इस बीच, जीन अभिव्यक्ति की तेजी से और कुशल नीचे विनियमन पेप्टाइड dsRNA योगों का उपयोग कर विभिन्न संयंत्रों में पूरा किया जा सकता है। पहले प्रयोग में, ए thaliana पत्ती पेप्टाइड dsRNA के साथ घुसपैठ था chalcone synthase जीन (सीएचएस) एंथोसायनिन (लाल रंग) सूखे की स्थिति के तहत जैव संश्लेषण के लिए जिम्मेदार चुप्पी के लिए परिसरों। ए thaliana की उपस्थिति में अंतर सामान्य (चित्रा 3 डी, एक) और सूखे की स्थिति (चित्रा 3 डी, ख) अनुकूलित पेप्टाइड dsRNA निर्माण का उपयोग कर मुंह बंद सीएचएस का मूल्यांकन करने के लिए एक आसान साधन उपलब्ध कराए (तीर 1 इंगित करता घुसपैठ क्षेत्र) के तहत छोड़ देता है। दूसरे प्रयोग में, पेप्टाइड dsRNA परिसरों पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) व्यक्त ट्रांसजेनिक ए thaliana की पत्तियों में घुसपैठ कर रहे थे। YFP अभिव्यक्ति में एक स्पष्ट कमी एपिडर्मल कोशिकाओं 9 घंटा पी में देखा जा सकता हैOst अभिकर्मक (चित्रा 3E, एफ)। एक अलग संयंत्र प्रणाली (चिनार, 12 घंटा बाद अभिकर्मक) में नीचे विनियमन जीन अभिव्यक्ति में तैयार की प्रभावशीलता भी सत्यापित किया गया था (चित्रा 3 जी, एच)।

आकृति 1
चित्रा 1: न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन कार्गो की डिलीवरी रहने वाले पौधों में लिए पेप्टाइड आधारित योगों।
डिज़ाइन किया गया वाहक पेप्टाइड्स सेल मर्मज्ञ या organellar पारगमन दृश्यों संयुग्मित polycations से मिलकर बनता है। Polycations endosomal डिब्बे से और / या नकारात्मक आरोप लगाया कार्गो के संघनन के रूप में अच्छी तरह से बच बाध्यकारी कोशिकाओं में internalization निम्नलिखित सक्षम करें। विशिष्ट अंगों को कोशिकाओं में कार्गो के वितरण और बाद में, सेल मर्मज्ञ दृश्यों और organellar पारगमन दृश्यों द्वारा मध्यस्थता है क्रमशः। विभिन्न कार्गो कि सफलतापूर्वक किया जा सकता हैlly संयंत्र में कर दिया गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), शराब डिहाइड्रोजनेज (ADH) और सिट्रीन (पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक प्रकार) की तरह इस तरह pDNA, dsDNA और dsRNA के रूप में न्यूक्लिक एसिड, साथ ही मॉडल प्रोटीन शामिल हैं। बायोएक्टिव अणुओं बातचीत electrostatic, जो संयंत्र में पेश कर रहे हैं सिरिंज घुसपैठ करके छोड़ देता है के माध्यम से पेप्टाइड conjugates के साथ अभिकर्मक परिसरों बनाने में सक्षम हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: पेप्टाइड आधारित योगों के Morphologies।
(ए) AFM आयाम (एच) 9 -BP100 एन / पी 0.5 / pDNA तैयार की छवि। (बी) (BP100) 2 कश्मीर 8 / दाढ़ रति पर ADH तैयार करने की AFM ऊंचाई छविओ से 10 प्रकाशित सूत्रों 23,24 से अनुमति के साथ Reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: अनुकूलित पेप्टाइड आधारित योगों का उपयोग कर अभिकर्मक क्षमता की सूक्ष्म मूल्यांकन।
(ए) साइटोसोलिक GFP अभिव्यक्ति (हरा), स्पष्ट रूप से क्लोरोप्लास्ट autofluorescence (लाल) से प्रतिष्ठित, ए thaliana के स्पंजी पर्णमध्यक कोशिकाओं में मनाया गया था (एच) 9 -BP100 / pDNA सूत्रीकरण (एन के साथ घुसपैठ पत्ते / पी 0.5; 12 घंटा )। (बी) GFP अभिव्यक्ति (हरा) प्रत्येक peptid के लिए ए thaliana पत्ती Cytcox- (एच) के साथ घुसपैठ 9 / BP100 / pDNA सूत्रीकरण (एन / पी 0.5 की एपिडर्मल कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया (लाल) में पाया गया थाई; 12 घंटा)। GFP अभिव्यक्ति के साथ माइटोकॉन्ड्रिया के बढ़े हुए छवियों चरम सही पैनल में दिखाया जाता है। (सी) ए thaliana के स्पंजी पर्णमध्यक कोशिकाओं में ADH-RhB (नीला) की डिलिवरी, 10 की एक पेप्टाइड / प्रोटीन दाढ़ अनुपात में (BP100) 2 कश्मीर 8 द्वारा मध्यस्थता पत्ते कल्पना की 6 घंटे बाद घुसपैठ। (डी) से पहले ए thaliana पत्ती (क) और बाद में (ख) (एच) 9 -BP100 / dsRNA निर्माण (दाढ़ अनुपात 2; 48 घंटा) के साथ इलाज है, जो एंथोसायनिन biosynthesis मार्ग के दमन में हुई। इसी तरह की एक निर्माण GFP5 dsRNA युक्त नकारात्मक नियंत्रण (ग) के रूप में पत्ती में घुसपैठ की थी। तीर 1 और 3 में घुसपैठ क्षेत्र से संकेत मिलता है, जबकि तीर 2 और 4 पत्ती भीतर गैर घुसपैठ क्षेत्र से संकेत मिलता है। (ई) ए thaliana पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) और (एफ) कम YFP प्रतिदीप्ति के साथ घुसपैठ के बाद व्यक्त पत्ते (एच) 9 -BP100 / dsRNA निर्माण (दाढ़ अनुपात 2, 9 घंटा)। (G) ट्रांसजेनिक चिनार के पत्ते पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) और (एच) (एच) 9 -BP100 / dsRNA तैयार करने के साथ कम YFP प्रतिदीप्ति निम्नलिखित घुसपैठ व्यक्त (दाढ़ अनुपात 2; 12 घंटा)। प्रकाशित सूत्रों 21,23,24,26 से अनुमति के साथ Reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: पेप्टाइड को डीएनए (एन / पी) अनुपात और प्रभाव पर परिसर के biophysical गुणों में रूपांतर।
डीएनए के अनुपात में वृद्धि के साथ पेप्टाइड, पेप्टाइड आधारित योगों जबकि उनके जीटा-संभावित मूल्यों संक्रमण नकारात्मक से सकारात्मक आकार में कमी।/files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1: विशेषता और विभिन्न पेप्टाइड आधारित योगों का मूल्यांकन। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सारणी 2
तालिका 2: बरकरार संयंत्रों के लिए पेप्टाइड आधारित और अन्य मौजूदा डीएनए वितरण टेक्नोलॉजीज की तुलना। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम है कि अनुभव से पहचान की गई है चर्चा कर रहे हैं। सिरिंज घुसपैठ करके, पेप्टाइड आधारित योगों रंध्र के माध्यम से संयंत्र पत्ती के अंदर airspaces में पेश कर रहे हैं। समाधान के लिए अधिक से अधिक तेज सुनिश्चित करने के लिए, घुसपैठ प्रक्रिया से बाहर किया जाना चाहिए जब पौधों को पर्याप्त पानी के साथ और प्रकाश की अवधि के दौरान प्रदान की स्थिति है कि रंध्र उद्घाटन अर्थात्। के लिए अनुकूल हैं, के तहत कर रहे हैं। साथ अभिकर्मक परिसरों की तैयारी करने का संबंध है, योगों कि दो पेप्टाइड्स (mitochondrial डीएनए-लक्षित वितरण के लिए) का एक संयोजन शामिल करने के लिए, प्रत्येक घटक के अलावा के लिए अनुक्रम महत्वपूर्ण है और उल्टे नहीं किया जाना चाहिए।

वहाँ प्रक्रिया के लिए कई प्रशंसनीय संशोधन कर रहे हैं। संयंत्र कोशिकाओं की घुसपैठ के लिए एक अन्य विकल्प वैक्यूम घुसपैठ का उपयोग करते हैं, जो पूरे पौधों और / या आंशिक सहित ऊतकों में जटिल समाधान पेश करने में सक्षम हैशिखर मेरिस्टेमों। इस वैकल्पिक प्रक्रिया के लिए, पौध अभिकर्मक समाधान में डूबे हुए हैं, और वैक्यूम से उत्पन्न दबाव के आधार पर, पेप्टाइड कार्गो कॉम्प्लेक्स रंध्र के माध्यम से और संयंत्र कोशिकाओं (Yoshizumi, टी, अप्रकाशित डेटा) के लिए मजबूर कर रहे हैं।

क्षणिक जीन अभिव्यक्ति, पशु कोशिकाओं का उपयोग अध्ययन के आधार पर, उच्च सांद्रता डीएनए 29-31 के साथ बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। यह (चित्रा 4), अभिकर्मक दक्षता प्रभावित करती है जो ध्यान दें कि डीएनए के लिए पेप्टाइड के अनुपात परिसरों की biophysical गुण (आकार, सतह प्रभार) को प्रभावित करता है महत्वपूर्ण है; इसलिए, इष्टतम अनुपात भी वृद्धि हुई डीएनए एकाग्रता के साथ बनाए रखा जाना चाहिए।

एक जीन / प्रोटीन वितरण एजेंट के रूप में पेप्टाइड्स का उपयोग करने में मुख्य लाभ में से एक यह है कि इसकी अनुक्रम एक वांछित कार्य को पूरा करने के लिए ट्यूनिंग करने के लिए उत्तरदायी है। उदाहरण के लिए, वाहक पेप्टाइड की mitochondrial लक्षित डोमेन इस संवर्धन में वर्णितY इन अंगों को स्थानीयकरण के लिए chloroplastic या peroxisomal-लक्ष्य दृश्यों के साथ बदला जा सकता है। जबकि क्लोरोप्लास्ट परिवर्तन biolistics 32-34 का उपयोग कर कई पौधों में संभव है, न है और न ही एग्रोबैक्टीरियम biolistic विधि माइटोकॉन्ड्रिया या अन्य अंगों नाभिक (तालिका 2) इसके अलावा में जीन मिलवा सकता है।

वहाँ पेप्टाइड आधारित अभिकर्मक के लिए कोई कठोर मेजबान दूरी की सीमाओं, एग्रोबैक्टीरियम आधारित विधि (तालिका 2) के विपरीत हैं। अब तक, ए thaliana, एन benthamiana और चिनार के अभिकर्मक के लिए योगों अनुकूलित किया गया है (तालिका 1), लेकिन विधि भी निकोटियाना Tabacum के लिए आवेदन किया जा सकता है, टमाटर फसल माइक्रो-टॉम, चावल (प्रारंभिक प्रयोगों के आधार पर), और अन्य मोनो और द्विबीजपत्री पौधों।

अभी तक के रूप में, वहाँ ट्रांस्जीन आकार में कोई ज्ञात सीमा है जब पेप्टाइड्स एक इस्तेमाल कर रहे हैंएस अभिकर्मक वैक्टर। इसके विपरीत, बड़े डीएनए अणु एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता तरीकों 35,36 के परिवर्तन दक्षता, और लगभग 200 केबी के ट्रांसजीन 37-39 सूचित किया गया है के लिए एक ऊपरी आकार की सीमा कम करने के लिए पाया गया है। Biolistics का उपयोग करना, दूसरे हाथ पर, बड़े डीएनए टुकड़े तैयारी या पौधों में 38 प्रसव के दौरान sheared जा सकता है। हालांकि कोई ऊपरी सीमा अब तक biolistic परिवर्तन के लिए निर्धारित किया गया है, शारीरिक constrains डीएनए कि बहुत कम से कम 150 केबी 40 को हस्तांतरित किया जा सकता है के आकार को सीमित करने के लिए पाया गया है। या तो एग्रोबैक्टीरियम या microprojectile बमबारी रोजगार मौजूदा दृष्टिकोण, ऊपर चर्चा की तुलना में जीन स्थानांतरण के लिए पेप्टाइड आधारित प्रणाली का उपयोग करने का प्रमुख लाभ, 2 टेबल में संक्षेप हैं।

कुछ सीमाएँ इस विधि के लिए मौजूद हैं के रूप में यह खड़ा है। सबसे पहले, इस तरह के एमआईटी के रूप में विशिष्ट अंगों, को pDNA की डिलीवरी को निशाना बनायाochondria, डीएनए बाध्यकारी, सेल मर्मज्ञ और organelle-पारगमन दृश्यों का एक साधारण संयोजन के द्वारा ही संभव सिद्ध किया गया है, हालांकि दक्षता कम था। ट्रांसजीन अभिव्यक्ति confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है, केवल कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया की एक छोटी सी आबादी में। इसलिए, आगे संशोधन के लिए आवश्यक हैं: (i) सेल / organellar झिल्ली भर में अधिक परिसरों के translocation बढ़ाने, और (ii) हदबंदी और अभिव्यक्ति के लिए लक्ष्य organelle में वाहक पेप्टाइड से pDNA के हस्तांतरण में सुधार होगा। दूसरे, इस डीएनए वितरण प्रणाली का उपयोग कर, बहिर्जात रिपोर्टर जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति सफलतापूर्वक कोशिकाओं के साइटोसोलिक और mitochondrial डिब्बे में हासिल की थी। स्थिर समावेश और संयंत्र परमाणु / organellar जीनोम में पेश जीनों की अभिव्यक्ति के लिए अभी तक उपयुक्त चयन रणनीतियों के अभाव की वजह से नहीं स्थापित किया गया है, हालांकि,।

स्वीकार करते हुए वहाँ सुधार या आगे विकास के लिए क्षेत्र हैं किevelopment, पेप्टाइड व्युत्पन्न रणनीति यहाँ वर्णित एक सरल और बहुमुखी तकनीक है कि विभिन्न कार्गो के वितरण विविध संयंत्र प्रकार में के लिए मार्ग प्रशस्त किया है बनी हुई है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों उन्नत प्रौद्योगिकी के लिए जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी खोजपूर्ण रिसर्च (JST-ERATO), नई ऊर्जा और औद्योगिक प्रौद्योगिकी विकास संगठन (एनईडीओ), और क्रॉस-मंत्रालयी सामरिक अभिनव संवर्धन कार्यक्रम (एसआईपी), जापान से धन स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(KH)9-BP100 peptide Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute N/A Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH-
KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 peptide Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute N/A Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL-
KYLKKKKKKKK
BP100 peptide Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute N/A Sequence: KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9 peptide Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute N/A Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-
KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS N/A N/A Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc N/A N/A Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) N/A N/A Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNA N/A N/A For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNA N/A N/A For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 ml and 10 ml Plastic Syringes TERUMO Corporation SS-01T, SS-10ESZ
1.5 ml Microcentrifuge Tube AS ONE Corporation 151212
96-Well Flat-Bottom Plate Asahi Glass Co., Ltd. 3860-096
Adhesive Tape Sekisui Chemical Co., Ltd. No. 835
Alcohol Dehydrogenase Sigma-Aldrich Co., LLC. A-7011
Atomic Force Microscope Seiko Instruments Inc. SPI3800, SPA 300HV
Atomic Force Microscope Hitachi High-Tech Science Corporation AFM5300E
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific Inc. 23227
Cantilever Hitachi High-Tech Science Corporation K-A102001593
Confocal Laser Scanning Microscope Carl Zeiss LSM700
Cork Borer Sigma-Aldrich Co., LLC. Z165220 For excision of leaves into 1-cm diameter disks
Coverslip Matsunami Glass Ind., Ltd. C02261
Cuvette Sarstedt 759116
Folded Capillary Cell Malvern Instruments, Ltd. DTS1070
Forceps Shimizu Akira Inc. Stainless pincet 150
Homogenization Pestle Ieda Trading Corp. 9993
Mica Nisshin EM Co., Ltd. LC23Z
Microcentrifuge Beckman Coulter BKA46472
Microplate Reader Molecular Devices Corporation Spectra MAX M3
Microscope Slide Matsunami Glass Ind., Ltd. S011120
Pipette Eppendorf Research® plus 3120000909
Pipette Tips AS ONE Corporation 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Plastic Petri Dish AS ONE Corporation 1-7484-01
Renilla Luciferase Assay Kit Promega corporation E2810
Rhodamine B Isothiocyanate Sigma-Aldrich Co., LLC. 283924
RNase-Free Water Qiagen 129112
Sodium Carbonate Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 199-01585
Surgical Blade and Handle FEATHER Safety Razor Co., Ltd. Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)
Syringe Tip Cap Musashi Engineering Inc. NC-3E
Weighing Balance Sartorius CPA225D
Zeta Potentiometer Malvern Instruments, Ltd. Zetasizer Nano-ZS

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आनुवंशिकी अंक 118 पेप्टाइड आधारित वितरण organelle लक्ष्यीकरण जीन अभिव्यक्ति प्लास्मिड डीएनए डबल असहाय डीएनए डबल असहाय शाही सेना प्रोटीन, तंबाकू
पेप्टाइड व्युत्पन्न विधि पौधों में सेलुलर के उस पार जीन और प्रोटीन और Organellar बाधाओं को परिवहन करने के लिए
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Chuah, J. A., Horii, Y., Numata, K.… More

Chuah, J. A., Horii, Y., Numata, K. Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants. J. Vis. Exp. (118), e54972, doi:10.3791/54972 (2016).

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