Protocol
1. Fremstilling av peptid-baserte formuleringer
- Fremstille stamløsninger av hvert peptid som følger: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml eller 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) og (BP100) 2 K 8 (70 mm). Veie den nødvendige mengde av hvert peptid i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og tilsett Autoclaved ultrarent vann for å oppløse peptidet. Bland godt ved gjentatt pipettering inntil det er oppnådd en klar oppløsning.
- Forsterke og rense plasmid DNA (pDNA), dobbelt-trådet DNA (dsDNA) og dobbelt-trådet RNA (dsRNA) i henhold til standard molekylære metoder. I 1,5 ml mikrosentrifugerør, lage stamløsninger med en konsentrasjon på 1 mg / ml (pDNA og dsDNA) eller 400 nM (dsRNA).
- Fremstille proteinstamoppløsning med en konsentrasjon på 7 um, ved oppløsning av 1 mg protein (f.eks., Alkohol dehydrogenase, ADH) pulver i 1 ml av natrium-karbonat-oppløsning (0,1 M, pH 9). Merk proteinet med fluorescent sonder som rhodamine B (RhB) i henhold til standard protokoller for å muliggjøre mikroskopisk visualisering av den leverte inn i celler protein.
- Kombiner de respektive komponentene i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- For peptid-pDNA formuleringer rettet mot cytoplasma, tilsett 6,4 mL (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) til 20 pl pDNA (1 mg / ml) og bland godt med pipettering. Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 25 ° C. Legg 773.6 ul autoklaveres ultrarent vann for å fortynne løsningen til et sluttvolum på 800 ul. Bruk pDNA konstruksjon laget for atom uttrykk (P35S-RLuc-TNOs, tabell 1).
- For peptid-pDNA formuleringer rettet mot mitokondrier, tilsett 6,6 mL av Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) til 20 pl pDNA (1 mg / ml) og bland godt med pipettering. Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 25 ° C og deretter legge til 2,4 mL av BP100 (1 mg / ml). Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 256, C i ytterligere 15 min. Legg 771 ul autoklaveres ultrarent vann for å fortynne løsningen til et sluttvolum på 800 ul. Bruk pDNA konstruksjon laget for mitokondrie uttrykk (pDONR-cox2: rluc, tabell 1).
- For peptid-dsDNA-formuleringer, tilsett 5,1 mL av (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) i 8 pl av dsDNA (1 mg / ml) og bland godt ved pipettering. Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 25 ° C. Legg 786.9 ul autoklaveres ultrarent vann for å fortynne løsningen til et sluttvolum på 800 ul.
- For peptid-dsrna formuleringer, tilsett 50 ul (KH) 9 -BP100 (800 nm) til 50 ul dsRNA (400 nM) og bland godt med pipettering. Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 25 ° C. Legg 700 ul RNase-fritt vann for å fortynne løsningen til et sluttvolum på 800 ul.
- For peptid-protein formuleringer, tilsett 16 mL (BP100) 2 K 8 (70 mm) til 16 mL av ADH (7 mm) og blandgodt ved pipettering. Tillat blandingen å stabilisere seg i 15 minutter ved 25 ° C. Legg 768 ul autoklaveres ultrarent vann for å fortynne løsningen til et sluttvolum på 800 ul.
- Tillat formuleringene for å stabilisere i 15 min ved 25 ° C.
2. Karakterisering av Peptide-Based Formuleringer
- Overfør hver oppløsning (800 ul) i en kyvette for dynamisk lysspredning (DLS) analyse. Bestem den hydrodynamiske diameter og polydispersitetsindeks dannet komplekser med et zeta Nanosizer, ved anvendelse av en 633 nm He-Ne-laser ved 25 ° C med en tilbakespredningsdeteksjonsvinkel på 173 °.
- Følgende størrelsesmålinger, overfører hver løsning (800 pl) inn i et foldet kapillær celle for zeta-potensial målingene ved standardparameterne for dielektrisk konstant, brytningsindeks og viskositet av vann ved 25 ° C.
- Observere et lite volum av kompleks løsning, som brukes til DLS-analyse, ved atomkraftmikroskopi (AFM). Innskudd 10 ul kompleks løsning på det nylig eksponerte spaltet overflate av et ark glimmer og la glimmeret til å lufttørke over natten i en dekket petriskål av plast.
- Erverve et bilde av kompleksene i luft ved 25 ° C under anvendelse av en silisium cantilever med en fjærkonstant på 1,3 N / m i tappe-modus 27,28.
3. Infiltrasjon av anlegget blader
- Bruk tre uker gamle jord dyrket planter (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 eller poppel 26). Transfektere minst 3 blad for å tjene som triplikat for kvantifisering av genekspresjonen eller protein levering.
- Laster en 1 ml plast nålløs sprøyte med 100 ul kompleks løsning for transfeksjon av ett blad. Plasser tuppen av sprøyten på abaxial overflaten av bladet.
- Trykk på sprøytespissen mot bladet litt og trykke sprøytestempelet langsomt mens utøve et mottrykk med index finger av en latex-hansker hånd fra motsatt side. Vellykket infiltrering kan observeres som spredning av en vann-fuktet område i bladet. Label infiltrert blader for enkel identifisering.
- Inkuber transfekterte blad for optimaliserte varig følgende infiltrasjon med peptid-pDNA (12 timer), peptid-dsDNA (12 timer), peptid-dsRNA (9-48 timer) og peptid-protein (6 timer) formuleringer under følgende betingelser: 16 hr lys / 8 timers mørke ved 22 ° C for A. thaliana og poppel, eller 24 timers konstant lys ved 29 ° C i N. benthamiana.
4. Evaluering av Transfeksjon Efficiency
- Skjære hele transfektert blad av mindre anlegg (f.eks., A. thaliana) eller en 1 cm 2 delen av infiltrert regionen for større anlegg (f.eks., N. benthamiana).
- For transfeksjon eksperimenter med Renilla luciferase (Rluc) reporter vektor, bestemme transfection effektivitet kvantitativt ved hjelp av en Rluc Assay Kit.
- Plasser hver skåret blad eller blad-delen i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 100 ul av 1 x Rluc Assay Lysis Buffer per rør. På samme måte, fremstille lysater av ikke-transfekterte kontrollblader (triplikate).
- Slipe bladet ved hjelp av en homogenisering støter og inkuber den resulterende løsningen ved 25 ° C i 6 - 10 timer.
- Sentrifuger løsningen ved 12 470 x g i en mikrosentrifuge i 1 min. Overføre 20 ul av det klarede lysat til en brønn i en 96-brønners mikroplate, og bruke den gjenværende volum for kvantifisering av totalprotein-konsentrasjon ved anvendelse av en BCA Protein Assay Kit ifølge produsentens protokoll.
- Tilsett 100 ul av 1 x Rluc Assay Substrate (fortynnet med Rluc Assay Buffer) inn i brønnen og bland ved langsom pipettering. Plasser mikro i en multimode mikroplateleser og starte målingen.
- Trekk bakgrunnen luminescens (gjennomsnitt av non-transfekterte tre eksemplarer) fra hver forsøks prøvens luminescens. Beregne forholdet photoluminescence (relative lysenheter, RLU) til mengden av protein (mg).
- For transfeksjon eksperimenter med grønt fluorescerende protein (GFP) reporter vektor eller fluorescensmerkede protein (f.eks., ADH-RhB), observere fluorescens ved hjelp av et konfokal laser scanning mikroskop.
- Skjær kantene av en hel blad (for å lette fjerning av luftrommene), mens et gjennomskåret blad kan brukes som den er. Fjern stempelet fra en 10 ml sprøyte, og plassere hver spaltet blad eller blad-delen i sprøyten.
- Skift stempelet og skyv den forsiktig til bunnen av sprøyten uten å knuse bladet. Trekke vann inn i sprøyten til den er omtrent halvfylt.
- Pek sprøyten oppover og skyv inn stempelet for å fjerne luft fra sprøyten gjennom spissen. Dekk til tuppen av sprøyten og trekk stempelet langsomt ned for å drive ut luft fra leaf. Gjenta denne prosessen flere ganger til bladet vises gjennomskinnelig.
- Dekke overflaten av et objektglass med tape. Skjær et firkantet område på båndet stor nok til bladet prøven ved hjelp av et blad, og skrelle firkantet stykke tape av med tang for å lage et prøvekammer. Tapen vil tjene som en spacer mellom lysbildet og dekk.
- Plasser bladet i kammeret med abaxial flaten vendt oppover og fylle den resterende kammer området med vann. Tett blad inne i kammeret med et dekkglass og feste kantene av dekkglass med tape.
- Undersøk blad prøven ved hjelp av konfokal laser scanning mikroskop under en 40X objektiv eller en 63X nedsenking i vann objektiv. GFP eller RhB fluorescens kan visualiseres ved eksitasjonsbølgelengdene av 488 nm eller 555 nm, henholdsvis.
Representative Results
En rekke nukleinsyre og protein last ble introdusert med hell i ulike planter ved hjelp av de utformede peptider som leverings vektorer. Elektrostatiske interaksjoner mellom kationiske peptider og negativt ladede last resulterte i dannelsen av transfeksjon komplekser som kan være direkte infiltrert inn i anlegget bladene ved hjelp av en nålløs sprøyte (figur 1). Optimaliserte formuleringer (empirisk bestemt i disse studiene 21,23-26) for transfeksjon av planteceller er oppført i tabell 1, hvor hver type det store omfanget av leverte last (pDNA, dsDNA, dsrna og protein) er representert. De midlere diametere på alle peptid-baserte formuleringer var i det tilnærmede område av 150 - 300 nm. Basert på DLS-analyse, alle formuleringer viste relativt lave størrelse polydispergerbarheter, noe som indikerer at de dannede peptid-last aggregater har en uniform størrelsesfordeling. Den morfologi avkomplekser mellom peptid og pDNA (figur 2A) eller protein (figur 2B), på glimmer, ble fotografert ved AFM. Homogene kulekomplekser ble observert for begge peptid-pDNA og peptid-protein kombinasjoner, i samråd med data fra DLS målinger. I forhold til zeta potensialet av komplekser (tabell 1), pDNA- og dsDNA-avledet komplekser hadde netto negative overflateladninger mens dsRNA-baserte komplekser hadde en nær-nøytralt overflateladning. Peptid-proteinkomplekser, på den annen side, ble positivt ladet.
Effektiviteten hos peptid-pDNA og peptid-dsDNA-formuleringer i mediere transfeksjon av A. thaliana eller N. benthamiana som modell plantesystemer ble undersøkt kvantitativt og kvalitativt. Den RLuc genekspresjon assay ble anvendt for kvantifisering av genekspresjon nivåer (tabell 1), og derfor for dette eksperimentet pDNA ellerdsDNA som koder for RLuc gen må brukes for kompleksdannelse med de respektive bærerpeptider. Ved hjelp av (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering, kjerne-målrettet levering og ekspresjon av pDNA kan oppnås, etter en inkubasjonstid på 12 timer, med en anslått RLU / mg verdi på omtrent 1 x 10 5. For mitokondrie-målrettet levering og ekspresjon av pDNA, en kombinasjon av peptider, Cytcox- (KH) 9 og BP100, er nødvendig for kompleksdannelse. Med samme optimalisert inkubasjonstid på 12 timer, imidlertid, et mye lavere nivå av transfeksjon (ca. 1 x 10 3 RLU / mg) ble nådd. I mellomtiden ble lignende Inkubasjonstiden (12 timer) og genuttrykk nivå (ca. 1 x 10 3 RLU / mg) påkrevd / registrert for dsDNA-baserte komplekser, også formulert med (KH) 9 -BP100 peptid. Kvalitative vurderinger av genuttrykk ble utført ved direkte mikroskopisk observasjon av bladene behandlet med komplekser FORBEREDELSERed hjelp pDNA eller dsDNA koding av GFP reporter genet. I celler transfektert med ikke-målrettede peptid-pDNA komplekser, diffus grønn fluorescens tilsvarende med GFP uttrykk ble klart observert og funnet å lokalisere i cytosol (figur 3A). Tydelige forskjeller i lokaliseringen mønster av GFP fluorescens var tydelig i celler infiltrert med mitokondrie-målrettet peptid-pDNA komplekser. Her, punktformet grønn fluorescens som colocalize med den mitokondrielle flekken ble synlig, noe som bekrefter spesifisiteten av genekspresjon utelukkende i den mitokondrielle rommet av celler (figur 3B).
I tilfelle av peptid-proteinformuleringer, vil konjugasjon av proteinet last (ADH) til en fluorofor (RhB) muliggjøre visualisering av avgitt protein i det intracellulære rommet. Innen kort inkubasjonstid på seks timer ble ADH-RhB protein (blå) funnet å være fordelt over helecytosol og vakuole av infiltrerte celler (Figur 3C). I mellomtiden, kan rask og effektiv nedregulering av genekspresjon bli oppnådd på forskjellige planter ved hjelp av peptid-dsrna formuleringer. I det første forsøket ble A. thaliana blad infiltrert med peptid-dsRNA komplekser til taushet chalconet syntase gen (CHS) ansvarlig for anthocyanin (rød pigment) biosyntesen etter tørke. Forskjellen i utseende fra A. thaliana blader under normale (figur 3D, a) og tørke (figur 3D, b) gitt en enkel måte å evaluere CHS støydempere hjelp av optimalisert peptid-dsRNA formulering (pil 1 indikerer infiltrert region). I det andre eksperiment ble peptid-komplekser dsrna infiltrert i bladene av transgene A. thaliana som uttrykker gul fluorescerende protein (YFP). En tydelig reduksjon i YFP uttrykk kan sees i epidermal cellene 9 hr post-transfeksjon (figur 3E, F). Effektiviteten av formuleringen i å nedregulere genekspresjon i et annet plante-system (poppel, 12 timer etter transfeksjon) ble også bekreftet (figur 3G, H).
Figur 1: Peptide-baserte Formuleringer for levering av nukleinsyre og Protein Lastene i levende planter.
De designede bære peptider består av polykationene konjugert til celle penetrerende eller organellar transitt sekvenser. Polykationene muliggjør binding og / eller kondens av negativt ladde last samt flukt fra endosomal rommet følgende intern inn i cellene. Levering av last inn i celler og deretter til spesifikke organeller er mediert av celle penetrerende sekvenser og organellar transitt-sekvenser, respektivt. Ulike last som kan være successfully levert inn i anlegget omfatte nukleinsyrer som pDNA, dsDNA og dsRNA, samt modell proteiner som bovint serumalbumin (BSA), alkoholdehydrogenase (ADH) og citrine (en variant av gul fluorescerende protein). Bioaktive molekyler er i stand til å danne komplekser med transfeksjon peptidkonjugater via elektrostatiske interaksjoner, som er introdusert inn i planteblader ved hjelp av sprøyte infiltrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: morfologier av peptid-baserte formuleringer.
(A) AFM amplitude bilde av (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering på N / P 0,5. (B) AFM høyde bilde av (BP100) 2 K 8 / ADH formuleringen ved molar Ratio 10. Gjengitt med tillatelse fra publiserte kilder 23,24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Mikroskopisk Evaluering av transfeksjonseffektiviteter hjelp Optimaliserte Peptide-baserte formuleringer.
(A) cytosoliske GFP uttrykk (grønn), tydelig atskilt fra kloroplast autofluorescence (rød), ble observert i svampete mesophyll cellene A. thaliana blader infiltrert med (KH) 9 -BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5; 12 timer ). (B) GFP uttrykk (grønn) ble detektert i mitokondriene (rød) i de epidermale celler av A. thaliana blad infiltrert med Cytcox- (KH) 9 / BP100 / pDNA formulering (N / P 0,5 for hvert peptide; 12 timer). Forstørrede bilder av mitokondrier med GFP uttrykk vises i panelet til ytterste høyre. (C) Levering av ADH-RhB (blå) inn i svampaktig mesophyll cellene A. thaliana blader formidlet av (BP100) 2 K 8 på et peptid / protein molare forholdet 10, visualisert seks timer etter infiltrasjon. (D) A. thaliana blad før (a) og etter (b) behandling med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molforhold 2; 48 timer), noe som resulterte i undertrykkelse av anthocyanin biosyntesebanen. En lignende formulering inneholdende GFP5 dsRNA ble infiltrert i bladet som negativ kontroll (c). Piler 1 og 3 indikerer den infiltrerte området mens pilene 2 og 4 angir de ikke-infiltrerte område innenfor bladet. (E) A. thaliana blader som uttrykker gul fluorescerende protein (YFP) og (F), redusert YFP fluorescens etter infiltrering med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molforhold 2; 9 timer). (G) Transgene poppel bladene uttrykker gult fluorescerende protein (YFP) og (H) den reduserte YFP fluorescens følgende infiltrasjon med (KH) 9 -BP100 / dsRNA formulering (molar ratio 2; 12 timer). Gjengitt med tillatelse fra publiserte kilder 21,23,24,26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Variasjon i Peptide-til-DNA (N / P) Ratio og effekten på Biofysiske Egenskaper av komplekser.
Med økende peptid til DNA-forhold, peptid-baserte formuleringer avta i størrelse mens deres zeta-potensial verdier overgang fra negativ til positiv./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Karakterisering og evaluering av ulike Peptid-baserte formuleringer. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 2: En sammenligning av peptid-baserte og andre Eksisterende DNA Levering Technologies for Intakte planter. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen som er identifisert empirisk blir diskutert. Ved å sprøyte infiltrering, blir de peptid-baserte formuleringer ført inn i luftrommene inne i planteblad gjennom stomata. For å sikre maksimal opptak av oppløsningen, bør infiltrasjonsprosessen utføres når plantene er under betingelser som bidrar til stomatal åpning ie., Forsynt med nok vann og i løpet av den lyse perioden. Med hensyn til fremstillingen av transfeksjon komplekser, for formuleringer som omfatter en kombinasjon av to peptider (for mitokondrisk DNA-målrettet levering), er rekkefølgen for tilsetningen av hver komponent viktig og bør ikke være byttet om.
Det er mange plausible modifikasjoner i fremgangsmåten. Et annet alternativ for infiltrasjon av planteceller er bruken av vakuum-infiltrering, som er i stand til å innføre den komplekse oppløsning til hele planter og / eller partielle vev innbefattendeapikale meristemer. For denne alternative fremgangsmåten, blir frøplanter neddykket i transfeksjon oppløsning, og på grunnlag av det trykket som dannes av vakuum, blir de peptid-komplekser lasten tvinges gjennom stomata og inn i plantecellene (Yoshizumi, T., upubliserte data).
Transient genekspresjon, på grunnlag av undersøkelser med animalske celler, har vist seg å øke med høyere DNA-konsentrasjoner 29-31. Det er viktig å merke seg at forholdet mellom peptid og DNA påvirker de biofysiske egenskaper (størrelse, overflateladning) av kompleksene (figur 4), som påvirker transfeksjonseffektiviteten; derfor må det optimale forholdet for å bli opprettholdt selv med økt DNA-konsentrasjon.
En av de viktigste fordeler ved å bruke peptider som et gen / protein-leveringsmiddel er at dens sekvens er mottagelig for innstiller for å oppfylle en ønsket funksjon. For eksempel, mitokondrie-målsøkende domene av bæreren peptid som er beskrevet i denne study kan erstattes med chloroplastic eller peroksisom-målsøkende sekvenser for lokalisering til disse organeller. Mens kloroplast transformasjon er mulig på flere anlegg ved hjelp av biolistics 32-34, kunne hverken Agrobacterium heller biolistic metode innføre gener i mitokondriene eller andre organeller i tillegg til kjernen (tabell 2).
Det er ingen begrensninger stive vert toner for peptid-baserte transfeksjon, i motsetning til Agrobacterium-basert metode (tabell 2). Så langt formuleringer for transfeksjon av A. thaliana, N. benthamiana og poppel har blitt optimalisert (tabell 1), men fremgangsmåten kan også anvendes for tobakksplante, tomat sorten Micro-Tom, ris (basert på foreløpige eksperimenter), og andre mono- og dicotyledonous planter.
Så langt er det ingen kjent begrensning på transgenet størrelse når peptidene anvendes ens transfeksjon vektorer. I motsetning til dette har store DNA-molekyler som er funnet å redusere transformasjonen effektiviteten av Agrobacterium medierte metoder 35,36, og en øvre størrelsesgrense for transgener på omtrent 200 kb er blitt rapportert 37-39. Ved hjelp av biolistics, på den annen side store DNA-fragmenter kan bli skåret under fremstillingen eller levering inn i planter 38. Selv om ingen øvre grense er bestemt for biolistic transformasjon så langt har fysiske begrensninger er funnet å begrense størrelsen av DNA som kan overføres til mye mindre enn 150 kb 40. De største fordelene med å bruke peptid-basert system for genoverføring i forhold til eksisterende praksis som anvender enten Agrobacterium eller microprojectile-bombardement, omtalt ovenfor, er oppsummert i tabell 2.
Noen begrensninger finnes for denne metoden som det står. For det første, målrettet levering av pDNA til spesifikke organeller, slik som mitochondria, har vist seg mulig ved en enkel kombinasjon av DNA-binding, celle-organelle penetrerende og transitt-sekvenser, selv om effektiviteten var lav. Transgen ekspresjon kunne påvises ved konfokal mikroskopi, bare i en liten populasjon av mitokondrier i cellene. Derfor ytterligere modifikasjoner er nødvendig for å: (i) å forbedre den translokasjon av flere kompleksene gjennom celle / organellar membranen, og (ii) forbedre dissosiasjon og overføring av pDNA fra bæreren peptidet inn i målet organeller for ekspresjon. For det andre, ved hjelp av denne DNA-leveringssystem, den forbigående ekspresjon av eksogene rapportørgener er med hell oppnådd i det cytosoliske og mitokondrielle rommet av celler. Stabil inkorporering og ekspresjon av de innførte gener i planteatom / organellar genomet er ikke fastlagt ennå, men på grunn av fravær av egnede seleksjonsstrategier.
Erkjenner at det finnes områder for forbedring eller videre development, peptid-avledet strategi beskrevet her er fortsatt en enkel og allsidig teknikk som har banet vei for levering av ulike last inn ulike plantetyper.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne finansiering fra Japan Science and Technology Agency Utforsk Research for Advanced Technology (JST-ERATO), New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO), og på tvers av departements Strategisk Innovasjon Promotion Program (SIP), Japan .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (KH)9-BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL |
| (BP100)2-K8 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK |
| BP100 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: KKLFKKILKYL |
| Cytcox-(KH)9 peptide | Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute | N/A | Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH |
| P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10) |
| pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751) |
| dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS) | N/A | N/A | Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39) |
| GFP5 siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| CHS siRNA | N/A | N/A | For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027) |
| 1 ml and 10 ml Plastic Syringes | TERUMO Corporation | SS-01T, SS-10ESZ | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | AS ONE Corporation | 151212 | |
| 96-Well Flat-Bottom Plate | Asahi Glass Co., Ltd. | 3860-096 | |
| Adhesive Tape | Sekisui Chemical Co., Ltd. | No. 835 | |
| Alcohol Dehydrogenase | Sigma-Aldrich Co., LLC. | A-7011 | |
| Atomic Force Microscope | Seiko Instruments Inc. | SPI3800, SPA 300HV | |
| Atomic Force Microscope | Hitachi High-Tech Science Corporation | AFM5300E | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | 23227 | |
| Cantilever | Hitachi High-Tech Science Corporation | K-A102001593 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Cork Borer | Sigma-Aldrich Co., LLC. | Z165220 | For excision of leaves into 1-cm diameter disks |
| Coverslip | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C02261 | |
| Cuvette | Sarstedt | 759116 | |
| Folded Capillary Cell | Malvern Instruments, Ltd. | DTS1070 | |
| Forceps | Shimizu Akira Inc. | Stainless pincet 150 | |
| Homogenization Pestle | Ieda Trading Corp. | 9993 | |
| Mica | Nisshin EM Co., Ltd. | LC23Z | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | BKA46472 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices Corporation | Spectra MAX M3 | |
| Microscope Slide | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S011120 | |
| Pipette | Eppendorf Research® plus | 3120000909 | |
| Pipette Tips | AS ONE Corporation | 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03 | |
| Plastic Petri Dish | AS ONE Corporation | 1-7484-01 | |
| Renilla Luciferase Assay Kit | Promega corporation | E2810 | |
| Rhodamine B Isothiocyanate | Sigma-Aldrich Co., LLC. | 283924 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Sodium Carbonate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-01585 | |
| Surgical Blade and Handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle) | |
| Syringe Tip Cap | Musashi Engineering Inc. | NC-3E | |
| Weighing Balance | Sartorius | CPA225D | |
| Zeta Potentiometer | Malvern Instruments, Ltd. | Zetasizer Nano-ZS |
References
- Altman, A., Hasegawa, P. M. Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).
- Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
- Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
- Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
- Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
- Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
- Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).
- Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
- Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
- Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
- Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
- Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
- Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
- Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
- Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
- Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
- Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
- Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751 (2015).
- Plant transformation method. Patent. Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. , WO2015133652 A1 (2015).
- Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).
- Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
- Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
- Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
- Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
- Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
- Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
- Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
- Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P.
- Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
- Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
- Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
- Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).
- Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
- Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).
