Abstract
Celler dør ved apoptose, også kaldet reguleret celledød, erhverve flere nye aktiviteter, der sætter dem i stand til at påvirke funktionen af tilstødende levende celler. Vitale aktiviteter, såsom overlevelse, proliferation, vækst og differentiering, er blandt de mange cellulære funktioner moduleret af apoptotiske celler. Evnen til at genkende og svare apoptotiske celler synes at være en universel træk ved alle celler, uanset afstamning eller organ af opkaldsoprindelse. Men mangfoldigheden og kompleksiteten af respons på apoptotiske celler mandater, stor omhu skal træffes i dissekere de signalering begivenheder og veje, der er ansvarlige for en bestemt udfald. Især må man skelne mellem de multiple mekanismer, som apoptotiske celler kan påvirke intracellulære signalveje inden levedygtige responderceller, herunder: receptormedieret anerkendelse af den apoptotiske celle, frigivelse af opløselige mediatorer af den apoptotiske celle, og / eller indgreb af phagocytic maskiner. Her giver vi en protokol til at identificere intracellulære signalsystemer begivenheder, der induceres i levedygtige responder celler efter deres eksponering for apoptotiske celler. En stor fordel ved protokollen ligger i den opmærksomhed, det kan betale sig at dissektion af den mekanisme, ved hvilken apoptotiske celler modulerer signalering begivenheder inden responderende celler. Medens protokollen specifik for en konditionelt immortaliserede muse nyre proksimal tubulær cellelinje (BU.MPT celler), er det let tilpasses til cellelinier, som er ikke-epitel oprindelse og / eller er fremstillet af andet end nyren organer. Brugen af døde celler som et incitament introducerer flere unikke faktorer, der kan hindre påvisning af intracellulære signalsystemer begivenheder. Disse problemer, samt strategier til at minimere eller omgå dem, der drøftes i protokollen. Anvendelsen af denne protokol skal hjælpe vores voksende viden om det brede indflydelse, som døde eller døende celler udøver på deres live naboer, både i sundhed og i diseaSE.
Introduction
Apoptose eller reguleret celledød 1, bidrager på en væsentlig måde til vedligeholdelse og udvikling af væv. Set mest enkelt, apoptose tillader alderen, er beskadiget eller overskydende celler, der skal fjernes uden skade på omgivende væv 2,3. Bidraget af apoptose til vævshomeostase, er imidlertid betydeligt mere dynamisk og varieret. Celler dør ved apoptose erhverve flere nye aktiviteter, både udskilles og celle-associeret, der sætter dem i stand til at påvirke funktionen af tilstødende levende celler 4-10. Tidligere undersøgelser fokuseret på evnen af apoptotiske celler til at undertrykke inflammation 11-16, men apoptotiske celler også modulere en lang række cellulære funktioner, herunder sådanne vitale aktiviteter som overlevelse 4,9,10, proliferation 4,9,10, differentiering 17, migration 18, og vækst 19. Desuden er disse effekter ikke begrænset til professionelle fagocytter, ligesom makrofags, men strækker sig til praktisk talt alle celletyper og slægter, herunder traditionelt ikke-fagocytiske celler, såsom epitel- og endotelceller 7,9,10,18-21.
Den specifikke reaktion af tilstødende levende celler efter udsættelse for apoptotiske celler afhænger af flere faktorer, der vedrører både de levedygtige responderende celler og apoptotiske celler selv. For eksempel, selv om udsættelse for apoptotiske celler inhiberer proliferation af både murine makrofager og nyre proximale tubulære epitelceller (PTECs), disse to celletyper varierer dramatisk i deres overlevelse respons på apoptotiske celler 4,6,9,10. Apoptotiske celler fremmer overlevelsen af makrofager, men inducere apoptotisk død PTECs 4,6,9,10. Især kan reaktionen på apoptotiske celler afviger selv blandt reagere celler af samme afstamning, afhængigt af den responderende celles organ oprindelse 10 (f.eks, nyre PTECs versus brystepitel-celler) eller tilstand af aktivering 22 (f.eks neutrofiler). Omvendt kan apoptotiske celler fremkalde forskellige reaktioner i selv samme celle afhængigt af arten af den apoptotiske stimulus 10,23 eller den fase af apoptose 10,14.
I betragtning af den diverseness og kompleksiteten af respons på apoptotiske celler, skal der udvises stor omhu i at dissekere de signalering begivenheder og veje, der er ansvarlige for en bestemt udfald. For det første skal reaktioner, der kræver direkte fysisk vekselvirkning mellem levedygtige og apoptotiske celler differentieres fra dem fremkaldes af opløselige mediatorer frigivet eller genereret af apoptotisk celle 3,6-10. Hvis fysisk interaktion er nødvendig, så bør der udføres en yderligere differentiering. Signaleringsbegivenheder kan afhænge af receptor-medieret anerkendelse af den apoptotiske celle, uafhængig af efterfølgende engulfment eller på fagocytisk optagelse, uafhængig af den specifikke receptor, der binder den apoptotiske celle 3-7,9,10,19. I sidstnævnte tilfælde, svaret er ikke specifik for apoptotiske celler, og kan udløses af ethvert fagocyterende materiale 4,6.
Betydningen af disse forskelle kan igen blive værdsat af kontrasterende svarene fra makrofager og nyre PTECs. For begge celletyper, udsættelse for apoptotiske celler ændrer aktiviteten af den pro-overlevelse kinase Akt. Modulation er afhængig af fysisk interaktion, da adskillelse af reagere og apoptotiske celler ved en 0,4 um polycarbonat membran afskaffer svar 4,9,10,19. Imidlertid reaktion PTECs er receptor-medieret og uafhængig af fagocytose, mens responset af makrofager er drevet af fagocytose 4,9,10,19. Denne konklusion forstærkes af, at udsættelse for latex-perler, en neutral fagocytisk stimulus, har ingen effekt på Akt aktivitet i PTECs, men efterligner effekten af apoptotiske celler i makrofager 4,9.
"> Selvom mindre godt undersøgt, celler dør ved nekrose eller utilsigtet celledød 1, også modulere funktionen af nærliggende levedygtige celler 3-10,19. Ligesom apoptotiske celler, nekrotiske celler udøver deres effekt gennem en række mekanismer, navnlig lækage af intracellulært indhold gennem deres bristet cellemembran 3,5,6,9,24. Mange celler, herunder PTECs og makrofager, besidder forskellige ikke-konkurrerende receptorer for celler dø ved nekrose 5,9. Indgreb af disse receptorer inducerer signalering begivenheder, der er ofte modsat dem, der induceres ved indgreb af receptorerne for apoptotiske celler 4-10,19. for eksempel i PTECs, nekrotiske celler øger phosphorylering af Akt, hvorimod apoptotiske celler falde phosphorylering 9,10,19. Her beskriver vi en protokol til at identificere intracellulære signalsystemer begivenheder induceret i levedygtige nyre PTECs gennem receptor-medieret anerkendelse af tilstødende apoptotiske PTECs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelser
Bemærk: I denne protokol, to eller flere cellelinjer eller primære cellekulturer, uafhængigt udarbejdet under særlige betingelser. Disse præparater omfatter apoptotiske celler (Protokol 1), nekrotiske celler (protokol 2), raske responderceller (protokol 3). Efter uafhængig fremstilling er apoptotiske eller nekrotiske celler tilsat til responderceller og det resulterende signal transduktion overvåges (protokoller 4, 5 og 6).
- Forbered kulturmedier og reagenser
- Forbered 500 ml dyrkningsmedium A (til brug, når dyrke celler under tolerante betingelser, se afsnit 1.2) ved at kombinere følgende: 1x Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 4,5 g / l glucose, 584 mg / L ʟ-glutamin, 110 mg / l natriumpyruvat, 100 enheder / ml penicillin-streptomycin, 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), og 10 enheder / ml interferon-γ (IFN-γ).
- Forbered 500 ml af dyrkningsmedium B (til brug when serum-sultende celler under ikke-tolerante betingelser, se afsnit 1.2) ved at udelade FBS og IFN-γ fra opskriften af dyrkningsmediet A. At vokse celler under ikke-tolerante betingelser (før serum-udsultning), der tilsættes 10% v / v FBS til dyrkningsmedium B.
- Forbered 0,4% (v / v) paraformaldehyd, pH 7,2, i 1x Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) fra 4% stock paraformaldehyd til fiksering af døde celler.
Bemærk: Paraformaldehyd er giftigt, og passende forsigtighed bør udvises i sin brug.
- Kultur BU.MPT celler
- Optø fra flydende nitrogen et hætteglas af BU.MPT celler.
Bemærk: BU.MPT er en mus nyre proksimal tubulær epitelcelle (PTEC) linje afledt fra en transgen mus, der bærer en temperaturfølsom (ts) mutation (tsA58) af SV40 stort tumorantigen (TAG) under kontrol af muse større histokompatibilitetskompleks (MHC) H-2Kb klasse I-promotoren 25,26. - Plate celler på steril polystyrene vakuum-gas plasma behandlet vævskulturskåle (~ 5 x 10 6 celler pr skål 100 mm diameter).
- Grow celler under tolerante betingelser i en befugtet 5% (v / v) CO2-atmosfære.
Bemærk: tolerante betingelser, som er defineret som kultur ved 33 - 37 * C i nærvær af IFN-γ, muliggør stabil ekspression af tsA58-muterede TAg transgen. I modsætning primære kulturer af muse nyre PTEC, som ikke overlever mere end en enkelt passage eller to, BU.MPT dyrkes under permissive betingelser kan passeres på ubestemt tid.- Passage celler mindst tre gange efter optøning, inden du bruger dem i et eksperiment.
- Til passage celler, tilsættes 1 ml 0,05% trypsin pr 100 mm skål, og inkuber i et befugtet 5% (v / v) CO2-atmosfære ved 37 * C i 5 minutter. Neutralisere trypsin ved tilsætning af 10 ml medium A. Aspirer de løsnede celler, og delt 1: 3 til 1: 5 til nye 100 mm sterilt polystyren vakuum-gas plasma behandlet Tissue dyrkningsskåle. Tilføj medium A for at bringe volumenet op til i alt 10 ml pr 100 mm skål.
- Passage celler mindst tre gange efter optøning, inden du bruger dem i et eksperiment.
- Som forberedelse til eksperimentelle anvendelse som reagerer celler, dyrke cellerne til konfluens i en befugtet 5% (v / v) CO2-atmosfære under ikke-tolerante betingelser (dvs. ved 39 ºC i fravær af IFN-γ [medium B indeholdende 10% volumen / v FBS]).
Bemærk: Under ikke-tolerante betingelser, er ekspression af tsA58-muterede TAg transgen inhiberet med> 95%, og BU.MPT celler opfører sig som primære kulturer af muse nyre PTEC.
- Optø fra flydende nitrogen et hætteglas af BU.MPT celler.
2. Udarbejdelse af apoptotiske BU.MPT Cells (protokol 1)
Bemærk: Denne protokol er specifik for BU.MPT celler som kilde til apoptotiske celler og staurosporin som fremgangsmåden til apoptose induktion. Alternativt kan en anden cellelinje, eller primær cellekultur, anvendes som kilde til apoptotiske celler, med apoptose induceret af standardiseret protocols for den pågældende celletype og fremgangsmåde til apoptose induktion.
- Efter passage på 100 mm i diameter vakuum-gas plasma sterile polystyren behandlet vævskulturskåle, vokse BU.MPT celler til konfluens i en befugtet 5% (v / v) CO2-atmosfære under permissive betingelser (dvs. ved 37 ºC i dyrkningsmedium A ved 10 ml pr 100 mm skål), som beskrevet i afsnit 1.2.3.
- Skyl det vedhængende cellemonolag tre gange med dyrkningsmedium B, under anvendelse af 10 ml pr skylning.
- Fremkalde apoptose ved at inkubere cellerne i dyrkningsmedium B indeholdende staurosporin, et ikke-selektivt proteinkinasehæmmer, ved 1 ug / ml i 3 timer i en befugtet 5% (v / v) CO2-atmosfære ved 37 * C.
- Aspirer staurosporin-holdige medium indeholdende "flydende" apoptotiske celler, der har løsnet sig fra monolag. Centrifuge dette medium i 10 minutter ved 500 xg, supernatanten fjernes, vaskes pelleten tre gange med dyrkningsmedium B, ogtilføj pelleten tilbage til celler opsamlet i det næste trin, 2.5.
- Frigør de resterende adhærerende celler fra trin 2.3 og 2.4 ved tilsætning af 5 mM (ethylendiamintetraeddikesyre) EDTA i 1x Ca 2 + - og Mg 2 + -fri DPBS ved 1 ml pr skål for 5 min. Aspirer EDTA-holdige medium indeholdende løsrevne apoptotiske celler, og samle de frigjorte celler med de "flydende" apoptotiske celler fra trin 2.4 i en steril 15 ml polystyren centrifugerør.
- Vask de apoptotiske celler tre gange ved centrifugering i 10 minutter ved 500 xg og resuspension i 10 ml 1x Ca + 2 - og Mg + 2 -fri DPBS per vask.
- Efter den sidste vask, suspendere de apoptotiske celler i frisk dyrkningsmedium B ved ~ 5 x 10 6 celler pr ml før brug for at stimulere responderceller. Alternativt fix vaskede apoptotiske celler i 0,4% (v / v) paraformaldehyd i 1 x DPBS i 30 minutter, og derefter vaske tre gange med kulturmedium B, før suspension i dyrkningsmedium B.
- Som hensigtsmæssigt bekræfter induktion af apoptose ved flow-cytometri under anvendelse af en separat fremstilling af apoptotiske celler (eller ved forbeholde nogle celler til dette formål), som tidligere beskrevet 6,9,10,15.
Bemærk: Tidlige apoptotiske celler har intakte cellemembraner, og vises som propidiumiodid (PI) -negative og annexin V-positive celler af nedsat cellestørrelse (i forhold til levedygtige celler). Sent apoptotiske celler har ikke-intakte cellemembraner, og vises som PI-positive og annexin V-positive celler af nedsat cellestørrelse. Brug den nuværende protokol, typiske præparater indeholder ~ 85% tidlig apoptotiske og ~ 15% sene apoptotiske celler. - Tilføj apoptotiske celler til BU.MPT responderceller (protokol 3) ved en apoptotisk-til-responder-forhold på 1: 1, enten direkte eller efter fiksering af apoptotiske celler i 30 minutter med 0,4% (v / v) paraformaldehyd i 1 x DPBS .
Bemærk: Apoptotisk cellefiksering før stimulering af respondere børikke påvirke resultater, medmindre de observerede signaling begivenheder er på grund af frigivelse af et opløseligt mediator (tabel 1).
3. Forberedelse af nekrotisk BU.MPT Cells (protokol 2)
Bemærk: Denne protokol er specifik for BU.MPT celler som kilden til nekrotiske celler, og opvarmning som fremgangsmåden til nekrose induktion. Alternativt kan en anden cellelinje, eller primær cellekultur, anvendes som en kilde for nekrotiske celler, med nekrose induceret af standardiserede protokoller for den pågældende celletype og fremgangsmåde til nekrose induktion.
- Efter passage på 100 mm i diameter vakuum-gas plasma sterile polystyren behandlet vævskulturskåle, vokse BU.MPT celler til konfluens i en befugtet 5% (v / v) CO2-atmosfære under permissive betingelser (dvs. ved 37 ºC i dyrkningsmedium A ved 10 ml pr fad), som beskrevet i afsnit 1.2.3.
- Skyl det vedhængende cellemonolag tre gange med dyrkningsmedium B, under anvendelse af10 ml pr skylning.
- Frigør cellerne ved tilsætning af 5 mM EDTA i 1x Ca + 2 - og Mg + 2 -fri DPBS ved 1 ml pr skål for 5 min. Aspirer EDTA-holdige medium indeholdende løsnede celler, og tilføj cellesuspensionen til et sterilt 15 ml polystyren centrifugerør.
- Vask cellerne tre gange ved centrifugering i 10 minutter ved 500 xg og resuspension i 10 ml Ca + 2 - og Mg + 2 -fri DPBS per vask.
- Efter den sidste vask, suspendere cellerne i frisk dyrkningsmedium B ved ~ 5 x 10 6 celler pr ml.
- Inducere nekrose ved opvarmning celler til 70 ºC i 45 minutter i et vandbad, forsigtigt vortexing cellesuspensionen hver 10 min.
- Cellerne inkuberes i 2 timer i en befugtet 5% (v / v) CO2-atmosfære ved 37 ° C. Forsigtigt vortexes cellesuspensionen hver 15 min.
- Som hensigtsmæssigt bekræfter induktion af nekrose ved flowcytometri under anvendelse af en separat fremstilling af necrotic celler (eller forbeholde nogle celler til dette formål), som tidligere beskrevet 6,9,10,15.
Bemærk: nekrotiske celler har sprængt cellemembraner, og fremstår som PI-positive celler med forøget cellestørrelse (i forhold til levedygtige celler). Brug den nuværende protokol, typiske præparater indeholder ≥ 95% nekrotiske celler. Alternativt kan induktion af nekrose og tab af membranintegritet bekræftes ved trypanblåt-farvning.
4. Fremstilling af BU.MPT responderceller (protokol 3)
Bemærk: Denne protokol er specifik for BU.MPT celler som kilden til responderceller. Alternativt kan en anden cellelinje, eller primær cellekultur, anvendes som responderceller. Forud for eksperimentel anvendelse, kan hvile induceres natten af standardiserede protokoller i laboratoriet.
- Grow BU.MPT celler i sterile 100 mm vævskulturskåle under tolerante betingelser i kultur-medium A ved 10 ml pr skålen, indtil de opnår ~85% konfluens.
- Aspirer dyrkningsmedium A, og skyl cellerne tre gange med dyrkningsmedium B ved 10 ml pr skylning. Serum-sulte cellerne natten over i 18 til 24 timer i en befugtet 5% (v / v) CO2-atmosfære under ikke-tolerante betingelser (dvs. ved 39 medium B ved 10 ml pr skålen ºC i kultur), som beskrevet i afsnit 1.2 .4, med henblik på at inducere hviletilstand. Alternativt vokser cellerne i dyrkningsmedium B plus 10% (vol / vol) FBS ved 39 ºC i én dag før serum sultende celler natten over i dyrkningsmedium B uden FBS.
- Mærke et separat vævskulturskål sammenflydende BU.MPT celler for hver eksperimentel betingelse.
- Medtag følgende seks betingelser: stimulering af levedygtige BU.MPT respondenter med enten bil eller epidermal vækstfaktor (EGF) i 15 min, efter deres eksponering i 30 min til enten ingen celler, apoptotiske celler eller nekrotiske celler.
Bemærk: Udsættelse for døde celler kan enten stimulere eller hæmme aktivitetsniveauet for en giVen signalmolekyle. Stimulering er bedst påvist over en lav basislinie (f.eks fravær af EGF), hvorimod inhibering bedst detekteres fra en høj basislinie (f.eks tilstedeværelse af EGF). Eftersom virkningen af stimulering med døde celler er a priori ukendt, anbefales det at udføre alle undersøgelser i både fravær og nærvær af EGF.
5. Stimulering af responderceller med Apoptotisk og nekrotiske celler (protokol 4)
- Aspirer dyrkningsmedium B fra præ-mærkede retter af hvilende (serum-udsultet) BU.MPT responderceller (protokol 3).
Bemærk: Efter dyrkning natten over under ikke-tolerante betingelser, bør BU.MPT celler opfører sig som primære kulturer af mus nyre PTEC. - Pr 100 mm skål, tilsættes 2 ml af et af følgende: dyrkningsmedium B (ingen celler); apoptotisk cellesuspension på ~ 5 x 10 6 celler pr ml i dyrkningsmedium B (Protokol 1); eller nekrotisk cellesuspension på ~ 5 x 10 6 celler pr ml in dyrkningsmedium B (protokol 2).
- Fordel 2 ml suspension af døde celler jævnt over 100 mm skål, og holde tid for dem at afregne til et minimum. For at opnå dette, distribuere de døde cellesuspension dråbevis med en bred spids pipette over hele overfladen af responder cell retter. Brug et volumen på 2 ml som et kompromis mellem minimering af afvikling tid og undgå sammenklumpning af døde celler.
Bemærk: Brugen af en suspension af døde celler som en stimulus indebærer en række særlige overvejelser, som er beskrevet mere detaljeret nedenfor (tabel 2 og diskussion). - Opnå en dead-til-responder-forhold på ~ 1: 1 ved tilsætning af 2 ml af døde celler på ~ 5 x 10 6 celler pr ml til et konfluent 100 mm skål, som indeholder ~ 10 x 10 6 celler. Alternativt for at etablere dosis-afhængighed af eventuelle observerede signalering begivenheder, varierer forholdet mellem døde til responderceller kontinuerligt ved progressiv fortynding i kulture medium B af de døde cellesuspensioner udarbejdet i protokol 1 og 2.
- Fordel 2 ml suspension af døde celler jævnt over 100 mm skål, og holde tid for dem at afregne til et minimum. For at opnå dette, distribuere de døde cellesuspension dråbevis med en bred spids pipette over hele overfladen af responder cell retter. Brug et volumen på 2 ml som et kompromis mellem minimering af afvikling tid og undgå sammenklumpning af døde celler.
- Omrystes forsigtigt retterne, derefter inkuberes ved 37 * C i en befugtet 5% (v / v) CO2-atmosfære.
- Efter 30 min stimulere respondercellerne med enten vehikel eller 50 nM EGF, ifølge den indledende-mærkning af dyrkningsskålen.
- Inkuber i 15 minutter ved 37 ° C i en fugtig 5% (v / v) CO2-atmosfære.
- Vaske væk de døde celler ved tilsætning af 5 ml iskold 1x DPBS, hvirvlende skålen, og opsugning vaskeopløsningen. Gentag tre gange.
- Umiddelbart placere responder celle retter på is til videre forarbejdning.
- Forbered cellelysater
- Forbered cellelyse-buffer indeholdende følgende: 1 × Tris-bufret saltvand (TBS), 10 mM natriumpyrophosphat, 0,5% vægt / volumen deoxycholat, 0,1% vægt / vol SDS, 10% glycerol og 25 mM natriumfluorid.
- Umiddelbart før cellelyse, tilføje følgende i præcis den rækkefølge givet på INDicated koncentrationer: mini EDTA-fri proteaseinhibitor cocktail (1 tablet per 10 ml lyseringspuffer), 10% (volumen / volumen) Triton X-100, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) og 10 mM natriumorthovanadat.
- Tilføj 700 pi iskold cellelysebuffer pr 100 mm skål af frisk stimulerede responderceller på is fra trin 5.7. Skrabe cellerne med en celleskraber og overføre lysatet at pre-kølet 1,5 mL mikrorør. Oprethold rørene på is i 15 minutter.
- Soniker lysater på is med 10 pulser af 20 Hz, mindre end et sekund hver i varighed. Undgå at skabe skum ved gas / væske-grænsefladen, da dette kan overophede prøverne. Fuldt nedsænkes sonikator sonde ind i mikrorør indeholder lysater før skifte ultralydsapparat på, og skifte sonikator fra, før du fjerner sonden fra lysaterne.
- Centrifuger ved 20.000 xg i 10 min ved 4 ° C, overføres supernatanterne i frisk præ-kølet mikrorør, Og opbevar ved -70 ºC.
- Udføre gelelektroforese og immunoblotting på supernatanter af lysater, som tidligere beskrevet 6,9,10,15.
- Forbered cellelyse-buffer indeholdende følgende: 1 × Tris-bufret saltvand (TBS), 10 mM natriumpyrophosphat, 0,5% vægt / volumen deoxycholat, 0,1% vægt / vol SDS, 10% glycerol og 25 mM natriumfluorid.
6. Forebyggelse direkte fysisk kontakt mellem Mål og Respondenter Brug en semipermeabel polycarbonat membran (Protokol 5)
- Forbered BU.MPT responderceller ifølge protokol 3, med en enkelt undtagelse; vokse celler i sterilt polystyren vævskulturbehandlede 12-brønds klynger.
- I udvalgte brønde, placere en gennemtrængelig støttesystem, der indeholder en 0,4 um polycarbonat-membran for at forhindre fysisk interaktion mellem døde og responder celler. Omfatte kontrolbrønde uden en membran i det samme forsøg.
- Aspirer dyrkningsmedium B fra eksperimentelle brønde af serum-udsultede BU.MPT responder celler.
- Følg protokol 4 til stimulering af responder celler med apoptotiske eller nekrotiske celler, med følgende modifikationer:
- Pr brønd af 12-brønds klynge, tilsættes 0,1 ml af et af følgende: dyrkningsmedium B (ingen celler); apoptotisk cellesuspension på ~ 5 x 10 6 celler pr ml i dyrkningsmedium B (Protokol 1); eller nekrotisk cellesuspension på ~ 5 x 10 6 celler pr ml i dyrkningsmedium B (protokol 2).
Bemærk: Som et konfluent brønd af en 12-brønds klynge indeholder ~ 0,5 x 10 6 celler, tilsætning af 0,1 ml af døde celler ved ~ 5 x 10 6 celler pr ml giver en dead-til-responder-forhold på ~ 1: 1. - Til brønde indeholdende det permeable support system, tilføje de døde celler oven på 0,4 um polycarbonatmembran inden den permeable support system, så der er ingen direkte fysisk interaktion mellem døde og responderceller.
- Pr brønd af 12-brønds klynge, tilsættes 0,1 ml af et af følgende: dyrkningsmedium B (ingen celler); apoptotisk cellesuspension på ~ 5 x 10 6 celler pr ml i dyrkningsmedium B (Protokol 1); eller nekrotisk cellesuspension på ~ 5 x 10 6 celler pr ml i dyrkningsmedium B (protokol 2).
7. hæmme fagocytose med Cytochalasin D (protokol 6)
- Forbered BU.MPT responderceller ifølge protokol 3.
- Forbered cytoskeletale inhibitor cytochalasin D i dimethyl sulfoxid (DMSO) ved 4 mg / ml (1,000 ×). Tilføj til pre-mærkede retter af BU.MPT responderceller enten 10 pi vehikel (DMSO) eller 10 pi cytochalasin D for at opnå en slutkoncentration på 4 pg / ml i 10 ml dyrkningsmedium B.
NB: Ved denne koncentration af cytochalasin D, fagocytose med BU.MPT celler og en makrofag cellelinie blev inhiberet med ≥90% 9,10. - Inkuber i 2 timer ved 37 * C i en befugtet 5% (v / v) CO2-atmosfære.
- Følg protokol 4 til stimulering af responderceller med apoptotiske eller nekrotiske celler.
- Som passende, bekræfter inhibering af fagocytose af døde celler ved flowcytometri under anvendelse af en separat fremstilling af døde og responderceller (eller celler reserveret til dette formål), som tidligere beskrevet 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1, giver vi en skematisk afbilder timing og kritiske trin involveret i udarbejdelsen af apoptotiske celler (Protokol 1) og nekrotiske celler (Protokol 2) og stimulering af responderceller med suspensioner af apoptotiske og nekrotiske celler (protokol 4).
I figur 2 vi giver repræsentative resultater, som viser virkningen af apoptotiske celler på phosphorylering af de to isoformer af serin-threonin-kinase glycogensyntasekinase-3 (GSK-3), GSK-3α og GSK-3β. GSK-3α / β har en fremtrædende rolle i reguleringen af celleproliferation og overlevelse, såvel som dets vigtige rolle i glukosemetabolismen. Phosphorylering af GSK-3α i serin-21 og GSK-3β i serin-9 inhiberer kinaseaktivitet og til gengæld fører til nedsat phosphorylering og øget stabilisering af β-catenin. p-cateninderefter translokerer til kernen, hvor det fremmer transkriptionen af gener, der vides at stimulere celleproliferation og inhibere apoptose. Derfor øges phosphorylering af GSK-3α / β forbundet med øget spredning og overlevelse, mens nedsat fosforylering af GSK-3α / β korrelerer med nedsat proliferation og overlevelse.
Eksponering af hvilende BU.MPT respondere på apoptotiske celler i 30 minutter inhiberede stærkt basal phosphorylering af GSK-3α / β (figur 2A). Tilsvarende forudgående eksponering for apoptotiske mål for 30 min inhiberede kraftigt efterfølgende epidermal vækstfaktor (EGF) -induceret phosphorylering af GSK-3α / β (figur 2A). I modsætning hertil eksponering af BU.MPT respondere til nekrotiske celler havde ingen virkning på hverken basal eller EGF-induceret phosphorylering af GSK-3α / β.
Til forebygt fysisk interaktion mellem BU.MPT responders og apoptotiske celler, blev BU.MPT respondere dyrket i en gennemtrængelig støttesystem og adskilt fra apoptotiske mål ved en 0,4 um polycarbonat membran. Forebyggelse af fysisk interaktion mellem BU.MPT responders og apoptotiske celler ophævede evnen af apoptotiske mål at inhibere phosphorylering af GSK-3α / β (figur 2B). For at vurdere betydningen af fagocytose, brugte vi den cytoskeletale inhibitor cytochalasin D for at forhindre fagocyterende optagelse af døde celler. Inhibering af phosphorylering af GSK-3α / β som reaktion på apoptotiske celler skete i fravær af fagocytose (figur 2C). Vi har tidligere vist, at cytochalasin D, ved den anvendte koncentration, inhiberer PTEC og makrofag fagocytose med ≥90% 9,10. Tilsammen vores resultater viser, at den apoptotiske celle-medieret inhibering af phosphorylering af GSK3α / β kræver direkte fysisk interaktion betwe Or mål og responderceller, men er uafhængig af fagocytose.
Figur 1. Schema for induktion af intracellulær signalering Begivenheder i levedygtige Responder Celler ved fysisk interaktion med omkringliggende celler undergår celledød. De linjegrafer skildrer timing og kritiske begivenheder i fremstillingen af (A) apoptotisk (Apo) celle og (B) nekrotisk (Necro) celle suspensioner af BU.MPT celler, og i (C) stimulering af levedygtige BU.MPT responder celler med suspensioner af apoptotiske eller nekrotiske celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
/ftp_upload/54980/54980fig2.jpg "/>
Figur 2. Hæmning af Phosphorylering af GSK3α / β i BU.MPT responderceller efter eksponering for apoptotiske celler Kræver Direkte celle-celle interaktion, men er uafhængig af Fagocytose. Serum-udsultede BU.MPT responderceller blev forbehandlet i 2 timer med (A, B) køretøj eller (C) cytochalasin D (4 ug / ml) og derefter stimuleret i 30 minutter med ingen celler (-), apoptotiske celler (Apo ), til eller nekrotiske celler (NEC) på en døde celle responder-forhold på 1: 1. Respondercellerne blev derefter vasket og inkuberet i yderligere 15 min i fravær eller nærvær af EGF (50 nM), før høst. Kilden af apoptotiske celler var STAUROSPORIN-behandlede BU.MPT celler. Kilden til nekrotiske celler blev varmebehandlet BU.MPT celler. Interaktion mellem døde celler og BU.MPT respondere var enten (A, C) uhindret, muliggør direktedøde celler-responder fysisk vekselvirkning, eller (B) med separation af døde celler og respons pr en 0,4 um polycarbonatmembran i en permeabel supportsystem. Døde celler og ikke-adhærente responderceller blev fjernet ved vask, og BU.MPT responder cellelysater blev probet med anti-phosphorylerede GSK3α / p-antistoffer som vist. Lige belastning blev bekræftet ved at probe for total glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Effekt på signalering begivenhed antager denne mekanisme | |||||||
| Intervention | Opløselig mægler | Receptor-medieret genkendelse | fagocytose | ||||
| Fiksering af apoptotiske celler * | Elimination | Udholdenhed | Udholdenhed | ||||
| Fysisk adskillelse af apoptotiske og responderceller † | Udholdenhed | Elimination | Elimination | ||||
| Ultracentrifugerede konditioneret medium fra celler, der undergår apoptose som stimulus¶ | Udholdenhed | Elimination | Elimination | ||||
| Nekrotiske celler som stimulus | Elimination | Elimination eller modsat rettet reaktion (f.eks inhibering versus stimulation) | Udholdenhed | ||||
| Latexperler som stimulus | Elimination | Elimination | Udholdenhed | ||||
| Farmakologisk hæmning af fagocytose | Udholdenhed | Udholdenhed | Elimination | * Forventede resultater antage, at fiksering ikke ændrer kritiske overflade determinanter ansvarlige for receptor-medieret anerkendelse og / eller fagocytose. | |||
| † Predicted resultater indebærer to antagelser: første, at det opløselige mediator er lille nok til at passere gennem membranens porer adskiller den apoptotiske og responderende celler, og det andet, at eventuelle stald vesikler eller mikrovesikler, ofte betegnet apoptotiske legemer, er for store til passere gennem membranens porer. En rolle for vesikler eller mikrovesikler ville blive foreslået af en mangel på konkordans i de signaleringsbegivenheder observeret med fysisk adskillelse af apoptotiske og responderceller versus ultracentrifugeret konditioneret medium. | |||||||
| ¶ Ultracentifugering (20.000 x g i 30 min) er nødvendig for at fjerne eventuelle apoptotiske legemer eller andet kaste uopløseligt materiale, der kan efterligne effects af den intakte apoptotiske celle. | |||||||
Tabel 1. Identifikation af mekanisme (r) Ansvarlig for Signaling Begivenheder i levedygtige celler efter eksponering for apoptotiske celler. Adskillige enkle eksperimentelle strategier er tilvejebragt for at skelne blandt de potentielle virkningsmekanisme (r) ansvarlig for signalering begivenheder observeres efter udsættelse for apoptotiske celler. Disse mekanismer omfatter: fysisk vekselvirkning af den apoptotiske celle med specifikke receptorer på responder celle, frigivelse af opløselige mediatorer fra den apoptotiske celle, og indgreb af responder cellens fagocytisk maskineri.
| Eksperimentel problem | Ledige strategier for minimering og / eller omgåelse |
| begrænset antalaf apoptotiske celler pr reagere celle (~ 1: 1-forhold). | 1. Øge antallet af apoptotiske celler, men apoptotiske-til-responder celle-forholdet skal holdes <2: 1. * |
| Behov for tyngdekraft-afhængig bundfældning af apoptotiske celler. | 1. minimere volumenet af mediet, hvori apoptotiske celler suspenderes. |
| 2. Centrifuger skålen eller plade til at drive de apoptotiske celler gennem suspensionsmediet hurtigere. | |
| Ujævn rumlige fordeling af apoptotiske celler. | 1. distribuere forsigtigt den apoptotiske celle suspension dråbevis med en bred spids pipette over hele overfladen af responder cell retter. |
| 2. Undgå petriskåle eller brønde med en diameter <35 mm, hvor menisk effekter kan føre til ujævne fordelinger. | |
| Heterogenitet apoptotiske cellepopulation. | 1. Brug en stærk induceraf apoptose. |
| 2. Efter induktion fastsætte de apoptotiske celler med paraformaldehyd og sortering ved flowcytometri for at opnå en mere ensartet population. | |
| * Ved apoptotiske-til-responder-forhold> 2: 1, vil de apoptotiske celler danner et sammenflydende tæppe og yderligere apoptotiske celler vil ikke længere tage direkte kontakt med responderceller | |
Tabel 2. Eksperimentel spørgsmål i forbindelse med brug af en Cellular suspension som Stimulus af intracellulær signalering begivenheder. Flere eksperimentelle forhindringer forbundet med brugen af en celle suspension som en stimulus er opført, samt strategier for deres delvise afhjælpe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi leverer her en protokol til karakterisering de intracellulære signalsystemer begivenheder induceret i levedygtige celler efter deres eksponering for celler undergår apoptose, eller andre former for celledød. Protokollen fremhæver de mange mekanismer, som eksponering for apoptotiske celler kan modulere intracellulære signalveje inden levedygtige responder celler. Disse mekanismer omfatter: interaktionen (via brodannende molekyler eller overflade determinanter på de døde celle eller dens stald vesikler og mikrovesikler, ofte betegnes apoptotiske legemer) med specifikke receptorer på responder celle; frigivelse af opløselige mediatorer (eller endda deres ekstracellulære generation 27); og inddragelse af den fagocytiske maskiner. Under omstændigheder, hvor væsentlig fagocytose opstår, endnu en mekanisme, der skal overvejes, er levering af mediatorer, såsom microRNA, beriget i apoptotiske celle eller dets vesikler 21. Betydningen af vores protokol, sammenlignet med other metoder, ligger i dens omhyggelige dissektion af de mange mekanismer, som apoptotiske celler kan modulere signaltransduktion inden responderende celler. En stor fordel er, at de fleste af de teknikker, der kræves, er ligetil og standard til cellekultur.
Mens protokollen er specifik for BU.MPT celler, en udødeliggjort mus nyre PTEC linje, som kilden til både døde og responderende celler, tilpasning af protokollen til andre cellelinjer og primære cellekulturer er ligetil og nemt implementeres. Hertil kommer, som i vores tidligere publikationer, kilden til døde og responderende celler behøver ikke nødvendigvis være den samme 9,10,19. Mens vi beskriver anvendelsen af staurosporin og varme som inducere af apoptose og nekrose henholdsvis mode og udløser af celledød kan også variere. Mens signalering begivenheder induceret i BU.MPT respondenter efter eksponering for apoptotiske celler er stort set uafhængig af tilstanden af apoptose induktion, ha vive observeret nogle forskelle 9,10. Af denne grund, anbefaler vi replikerende vigtige resultater med flere forskellige udløser af apoptotisk celledød. For eksempel, hvis stærkt fagocytiske celler, såsom makrofager, anvendes som respondenter 4,6, eller hvis varigheden af interaktionen mellem respondere og døde celler er lang nok til væsentlig fagocytose gøre sig gældende, kunne man overveje et ugiftigt inducer af apoptose, såsom ultraviolet- eller gamma-bestråling 4,9,10, at udelukke potentiel fagocytisk levering af toksinet. kan også betragtes alternative metoder til induktion af nekrose. Mens vi har opnået identiske resultater med opvarmning og frysetørring af celler, omfattende celle sammenklumpning og snavs forekommer med frysning-optøning gør brugen problematisk.
Flere enkle strategier kan bidrage til at belyse den særlige mekanisme ansvarlig for eventuelle signaleringsbegivenheder observeres efter udsættelse for apoptotiske celler (tabel 1 tabel 1, kan virkningen på den konstaterede signalhændelse lokalisere den ansvarlige mekanisme. For eksempel i tilfælde af receptormedieret anerkendelse af den apoptotiske celle bør signalhændelse vedbliver på trods af fiksering af den apoptotiske celle, og bør fjernes med udskiftning af apoptotiske celler ved konditioneret medium eller latexperler, samt med fysisk adskillelse af døde og responderende celler. Som reaktion på nekrotiske celler, bør signalhændelse elimineres eller bliver modsat rettet (f.eks inhibering versus stimulation).
Der er flere konsekvenser af denne begrænsede døde-til-responder-forhold, der kanføre til en reduktion eller tilsløring af signalering begivenheder. At interagere fysisk med en levedygtig responder celler, skal en apoptotisk celle først afregne gennem søjlen af suspensionsmedium. Selv med minimale mængder, kan tiden for afregning af celler være mærkbar, så længe 10 til 20 min. Intracellulær signalering begivenheder vil således blive ukoordineret blandt responderende celler. Derfor er den første kontakt mellem responderceller og døde celler ikke præcist timet, men snarere falder inden en noget bred vifte af gange. Til signalering hændelser, der opstår på en tidsskala kortere end den for afregning, kan denne manglende synkronisering føre til en tilsløring af signal, således at det ikke længere kan skelnes fra baggrunden. Selv signaler af forlænget varighed, hvis ikke af tilstrækkelig størrelse, kan være modtagelige for dette problem.
Ud over disse timelige spørgsmål, kan rumlige forhold også negativ indvirkning resultater. Menisk effekter, især i brønde og retter af small diameter (f.eks polystyren vævskulturbehandlede 96 brønde klynger), eller flydende strøm, der genereres af for kraftig pipettering kan føre til en uensartet fordeling af døde celler og derved skabe en tilstand af fest eller Hunger blandt responder celler. Da det målte signal stammer fra, at af alle responderceller i en enkelt brønd eller plade, kan variation i fangst af døde celler skjule svagere signaler.
Et sidste spørgsmål vedrører heterogenitet apoptotiske cellepopulation. Selv med en stærk udløser af apoptose, såsom staurosporin, vil enhver forberedelse af døde celler indeholder celler på flere stadier i dødsprocessen. Dette bliver relevant, hvis styrken af reaktionen på den apoptotiske celle afhænger af dens tidspunkt i dødsprocessen 10,14. Eftersom i gennemsnit hver reagerer celle møder bare en apoptotisk celle, kan heterogenitet i dette tilfælde føre til svækkelse af den samlede opdaget signalering begivenhed. tabel 2
Der er flere andre eksperimentelle bekymringer entydigt forbundet med brugen af døde celler som en stimulus. Vigtigere, kan dyrkningsbetingelser påvirker ikke kun de reagerende celler, men også de døde celler selv. For eksempel serumproteiner, hvis til stede, kan vedhæfte til overfladen af den døde celle, og forøge eller inhibere anerkendelsen ved at svare celler. Ved fejlfinding en usammenhængende resultat, eller et resultat afviger fra det rapporteret i litteraturen, bør man være opmærksom på følgende dyrkningsbetingelser (for både responder og døde celler): graden af sammenløb, passage nummer, tilstedeværelsen af serum, varme inaktivering af serum , og art og varighed hviletilstand. Endelig er man nødt til at være opmærksom på, at celledød er en ubønhørlig aspekt af al cellekultur og responder celler derfor løbende udsat for et lavt niveau af dødeceller. Denne eksponering kan potentielt påvirke den eksperimentelle svar på en bolus af døde celler, da selve signaler under studiet bliver løbende induceret. Signal modulation kan opstå gennem normale feedback-veje, eller selv gennem udvælgelse af en subpopulation af responderceller, især hvis de inducerede signaleringshændelser involverer overlevelse eller proliferation.
Sammenfattende har vi beskrevet en protokol til bestemmelse af intracellulære signalsystemer begivenheder induceret i levedygtige celler ved deres fysiske interaktion med tilstødende døde eller døende celler. Selvom fokus er overvejende på signalering begivenheder induceret af receptor-medieret genkendelse af døde celler, protokollen tillader også identifikation af signalering begivenheder induceret af fagocytisk optagelse eller frigivelse af opløselige mediatorer fra de døde celler. Brugen af døde celler som et incitament introducerer flere unikke faktorer, der kan hindre påvisning af intracellulære signalsystemer begivenheder. Bevidsthed om disse unique faktorer, samt de mange mekanismer, som døde celler modulerer intracellulær signalering, er afgørende for udformningen og fortolkningen af eksperimenter inden for dette voksende fagområde. Den her beskrevne protokol skal hjælpe med at forstå de mekanismer, der døde eller døende celler påvirker deres live naboer i både sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
