Abstract
Les cellules meurent par apoptose, également appelé mort cellulaire comme réglementé, acquérir plusieurs nouvelles activités qui leur permettent d'influencer la fonction des cellules vivantes adjacentes. activités vitales, comme la survie, la prolifération, la croissance et la différenciation, sont parmi les nombreuses fonctions cellulaires modulées par les cellules apoptotiques. La capacité de reconnaître et de répondre à des cellules apoptotiques semble être une caractéristique universelle de toutes les cellules, indépendamment de la lignée ou de l'organe d'origine. Toutefois, la diversité et la complexité de la réponse à des cellules apoptotiques mandats qu'un grand soin soit pris en disséquant les événements de signalisation et les voies responsables de tout résultat particulier. En particulier, il faut distinguer entre les multiples mécanismes par lesquels les cellules apoptotiques peuvent influer sur les voies de signalisation intracellulaire dans les cellules répondeuses viables, comprenant: la reconnaissance médiée par le récepteur de la cellule apoptotique, la libération de médiateurs solubles par les cellules apoptotiques et / ou de l'engagement de la phagomachines cytic. Ici, nous fournissons un protocole permettant d'identifier les événements de signalisation intracellulaires qui sont induits dans les cellules répondeuses viables après leur exposition à des cellules apoptotiques. Un avantage majeur du protocole réside dans l'attention qu'il porte à la dissection du mécanisme par lequel les cellules apoptotiques modulent des événements dans les cellules répondant de signalisation. Bien que le protocole est spécifique d'une lignée conditionnellement immortalisée de rein de souris proximale de la cellule tubulaire (cellules BU.MPT), elle est facilement adaptable à des lignées cellulaires qui ne sont pas d'origine épithéliale et / ou dérivés d'organes autres que le rein. L'utilisation de cellules mortes comme un stimulus introduit plusieurs facteurs uniques qui peuvent nuire à la détection d'événements de signalisation intracellulaires. Ces problèmes, ainsi que des stratégies visant à minimiser ou les contourner, sont discutés dans le protocole. L'application de ce protocole devrait aider notre connaissance croissante de la grande influence que les cellules mortes ou mourantes exercent sur leurs voisins en direct, à la fois dans la santé et dans diseÃproprement parler.
Introduction
Apoptose, ou réglementé la mort cellulaire 1, contribue de manière essentielle à l'entretien et le développement des tissus. Vu la plus simple, permet d'apoptose âgés, endommagées, ou les cellules excédentaires à éliminer sans nuire aux tissus environnants 2,3. La contribution de l'apoptose à l'homéostasie tissulaire, cependant, est nettement plus dynamique et varié. Les cellules meurent par apoptose acquièrent plusieurs nouvelles activités, à la fois sécrétée et associée aux cellules, qui leur permettent d'influencer la fonction des cellules vivantes adjacentes 4-10. Des études antérieures ont porté sur la capacité des cellules apoptotiques pour supprimer l' inflammation 11-16, mais les cellules apoptotiques modulent également une large gamme de fonctions cellulaires, y compris des activités vitales comme la survie 4,9,10, la prolifération 4,9,10, la différenciation 17, migration 18, et la croissance 19. De plus, ces effets ne sont pas limités aux phagocytes professionnels, comme macrophages, mais étendre à pratiquement tous les types et les lignées cellulaires, y compris les cellules traditionnellement non phagocytaires, telles que les cellules épithéliales et endothéliales 7,9,10,18-21.
La réponse spécifique des cellules vivantes adjacentes suite à une exposition à des cellules apoptotiques dépend de multiples facteurs qui se rapportent à la fois les cellules répondant viables et les cellules apoptotiques eux-mêmes. Par exemple, bien que l' exposition à des cellules apoptotiques inhibe la prolifération des macrophages murins et les cellules epitheliales tubulaires proximales des reins (PTECs), ces deux types de cellules diffèrent considérablement dans leur réponse à la survie des cellules apoptotiques 4,6,9,10. Les cellules apoptotiques favorisent la survie des macrophages, mais induisent la mort apoptotique de PTECs 4,6,9,10. En particulier, la réponse aux cellules apoptotiques peuvent varier , même parmi les cellules répondant de la même lignée, en fonction de l'organe de la cellule de réponse d'origine 10 (par exemple, PTECs rénaux par rapport à l' épithélium mammairecellules) ou état d'activation 22 (par exemple, les neutrophiles). A l' inverse, les cellules apoptotiques peuvent provoquer des réactions différentes dans la même cellule en fonction de la nature du stimulus apoptotique 10,23 ou au stade de l' apoptose 10,14.
Compte tenu de la diverseness et de la complexité de la réponse à des cellules apoptotiques, un grand soin doit être pris à disséquer les événements de signalisation et les voies responsables de tout résultat particulier. Tout d' abord, les réponses nécessitant une interaction physique directe entre les cellules viables et apoptotiques doivent être différenciés de ceux provoqués par les médiateurs solubles libérés ou générés par la cellule apoptotique 3,6-10. Si une interaction physique est nécessaire, une différenciation supplémentaire doit être effectuée. les événements de signalisation peuvent dépendre de la reconnaissance médiée par le récepteur de la cellule apoptotique, indépendamment de l'engloutissement subséquente ou de l'absorption phagocytaire, indépendamment du récepteur spécifique qui se lie à la cellule apoptotique 3-7,9,10,19. Dans ce dernier cas, la réponse est non spécifique aux cellules apoptotiques, et peut être déclenchée par n'importe quel matériau phagocytaire 4,6.
L'importance de ces différences peut à nouveau être appréciée en comparant les réponses des macrophages et PTECs rénaux. Pour les deux types de cellules, l'exposition à des cellules apoptotiques modifie l'activité de la pro-survie kinase Akt. La modulation dépend de l' interaction physique, étant donné que la séparation des cellules apoptotiques et de répondre par une membrane de polycarbonate de 0,4 um supprime la réponse 4,9,10,19. Cependant, la réponse de PTECs est médiée par un récepteur indépendant de la phagocytose, alors que la réponse des macrophages est entraînée par phagocytose 4,9,10,19. Cette conclusion est renforcée par le fait que l' exposition à des billes de latex, un stimulus phagocytaire neutre, n'a pas d' effet sur l' activité Akt dans PTECs, mais imite l'effet des cellules apoptotiques dans les macrophages 4,9.
"> Bien que moins bien étudié, les cellules meurent par nécrose ou mort accidentelle de la cellule 1, modulent également la fonction des cellules à proximité viables 3-10,19. Comme les cellules apoptotiques, les cellules nécrotiques exercent leurs effets à travers une variété de mécanismes, notamment la fuite du contenu intracellulaire à travers leur membrane cellulaire rupture 3,5,6,9,24. de nombreuses cellules, y compris les PTECs et les macrophages, possèdent des récepteurs distincts non concurrentes pour les cellules meurent par une nécrose de 5,9. l' engagement de ces récepteurs induit des événements de signalisation qui sont souvent opposés à ceux induits par l' engagement des récepteurs des cellules apoptotiques 4-10,19. par exemple, dans PTECs, les cellules nécrotiques augmentent la phosphorylation de Akt, tandis que les cellules apoptotiques diminue la phosphorylation 9,10,19. Ici, nous décrivons un protocole pour identifier les événements de signalisation intracellulaires induits dans PTECs rénaux viables par la reconnaissance médiée par le récepteur des PTECs adjacents apoptotiques
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Protocol
1. Préparatifs
Remarque: Dans ce protocole, deux ou plusieurs lignées cellulaires ou des cultures de cellules primaires, sont préparés indépendamment dans des conditions spécifiques. Ces préparations comprennent des cellules apoptotiques (Protocole 1), les cellules nécrotiques (protocole 2), et les cellules de répondeur en bonne santé (protocole 3). Après la préparation indépendante des cellules apoptotiques ou nécrotiques sont ajoutées aux cellules répondeuses et de la transduction du signal résultant est surveillé (protocoles 4, 5 et 6).
- Préparer les milieux de culture et réactifs
- Préparer 500 ml de milieu de culture A (pour une utilisation lors de la croissance des cellules dans des conditions permissives, voir section 1.2) en combinant les éléments suivants: Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Dulbecco contenant 4,5 g / L de glucose, 584 mg / L ʟ-glutamine, 110 mg / L de pyruvate de sodium, 100 unités / ml de pénicilline-streptomycine, 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin (FBS) et 10 unités / ml d'interféron-γ (IFN-γ).
- Préparer 500 ml de milieu de culture B (pour un usage when cellules de sérum-faim dans des conditions non permissives, voir la section 1.2) en omettant de FBS et IFN-γ de la recette du milieu de culture A. Pour cultiver des cellules dans des conditions non permissives (avant sérum famine), ajouter 10% v / v de FBS à milieu de culture B.
- Préparer 0,4% (v / v) de paraformaldehyde, pH 7,2, dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco 1x (DPBS) à partir de 4% de paraformaldehyde actions pour la fixation des cellules mortes.
Note: paraformaldéhyde est toxique, et la prudence appropriée devrait être exercée dans son utilisation.
- cellules BU.MPT Culture
- Décongeler de l'azote liquide d'un flacon de cellules BU.MPT.
Remarque: BU.MPT est une cellule épithéliale tubulaire (PTEC) ligne proximale de rein de souris provenant d'une souris transgénique portant un (ts) une mutation sensible à la température (tsA58) de l'antigène tumoral grand SV40 (TAG) sous le contrôle de la souris majeur complexe d'histocompatibilité (CMH) H-2K b classe I promoteur 25,26. - cellules de plaques sur polystyr stériletraités boîtes de culture de tissu ène plasma sous vide de gaz (~ 5 x 10 6 cellules par boîte de 100 mm de diamètre).
- Cultiver des cellules dans des conditions permissives dans un humidifiée à 5% (v / v) atmosphère de CO 2.
Remarque: Les conditions permissives, qui sont définies comme la culture à 33-37 ° C en présence d'IFN-γ, permettent une expression stable du transgène TAg tsA58 muté. Contrairement à des cultures primaires de souris rein PTEC, qui ne survivent pas plus d'un seul passage ou deux, BU.MPT cultivée dans des conditions permissives peuvent être repiquées indéfiniment.- cellules Passage au moins trois fois après la décongélation avant de les utiliser dans une expérience.
- Pour les cellules de passage, ajouter 1 ml de trypsine à 0,05% par boîte de 100 mm, et incuber dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2 à 37 ° C pendant 5 min. Neutraliser la trypsine en ajoutant 10 ml de milieu A. Aspirer les cellules individuelles, et de diviser 1: 3 à 1: 5 dans de nouveaux 100 mm de polystyrène stérile SIT plasma sous vide de gaz traitédes boîtes de culture. ue Ajouter le milieu A pour porter le volume jusqu'à un total de 10 ml par boîte de 100 mm.
- cellules Passage au moins trois fois après la décongélation avant de les utiliser dans une expérience.
- En préparation pour une utilisation expérimentale comme répondant cellules, cultiver des cellules jusqu'à la confluence dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2 dans des conditions non permissives (ie à 39 ° C en l'absence d'IFN-γ [milieu B contenant 10% v / v de FBS]).
Remarque: Dans des conditions non permissives, l'expression du transgène TAg tsA58 mutée est inhibée par> 95%, et les cellules BU.MPT se comportent comme des cultures primaires de rein de souris PTEC.
- Décongeler de l'azote liquide d'un flacon de cellules BU.MPT.
2. Préparation des cellules apoptotiques BU.MPT (Protocole 1)
Remarque: Ce protocole est spécifique des cellules BU.MPT en tant que source de cellules apoptotiques et la staurosporine que la méthode de l'induction de l'apoptose. En variante, une autre lignée cellulaire ou une culture de cellules primaires, peuvent être utilisés comme source de cellules apoptotiques, et l'apoptose induite par protoco normaliséls pour ce type particulier de cellules et la méthode d'induction de l'apoptose.
- Après le passage sur un diamètre de 100 mm polystyrène stérile plasma sous vide de gaz traités boîtes de culture de tissu, poussent les cellules BU.MPT jusqu'à la confluence dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2 dans des conditions permissives (ie à 37 ° C en milieu de culture A à 10 ml par boîte de 100 mm), comme décrit dans la section 1.2.3.
- Rincer la monocouche de cellules adhérentes à trois reprises avec un milieu de culture B, en utilisant 10 ml par rinçage.
- Induire l' apoptose par incubation des cellules dans un milieu de culture contenant B staurosporine, un inhibiteur de protéine kinase non sélectif, à 1 pg / ml pendant 3 h dans un humidifiée à 5% (v / v) , une atmosphère de CO2 à 37 ° C.
- Aspirer le milieu contenant staurosporine contenant "flottantes" cellules apoptotiques qui sont détachés de la monocouche. Centrifugeuse ce milieu pendant 10 min à 500 g, éliminer le surnageant, laver le culot trois fois avec un milieu de culture B, etajouter le culot de retour aux cellules recueillies dans l'étape suivante, 2.5.
- Détacher les cellules adhérentes restantes des étapes 2.3 et 2.4 par addition de 5 mM (acide éthylènediaminetétraacétique) EDTA dans 1x Ca 2 + - et Mg 2 + -free DPBS à 1 ml par boîte de 5 min. Aspirer le milieu contenant de l'EDTA contenant des cellules apoptotiques individuelles, et mettre en commun les cellules individuelles avec les "flottantes" cellules apoptotiques de l'étape 2.4 dans un tube de 15 ml de polystyrène à centrifuger stérile.
- Laver les cellules apoptotiques trois fois par centrifugation pendant 10 min à 500 x g et remise en suspension dans 10 ml de 1 x Ca + 2 - et Mg + 2 sans gluten DPBS par lavage.
- Après le dernier lavage, suspendre les cellules apoptotiques dans un milieu de culture frais B à ~ 5 x 10 6 cellules par ml avant utilisation pour stimuler les cellules de répondeur. Alternativement, fixer les cellules apoptotiques lavées dans 0,4% (v / v) paraformaldehyde dans 1x DPBS pendant 30 min, puis laver trois fois avec la culturemilieu B, avant la suspension dans un milieu de culture B.
- Le cas échéant, confirmer induction de l' apoptose par cytométrie de flux en utilisant une préparation séparée des cellules apoptotiques (ou en réservant des cellules à cette fin), comme décrit précédemment 6,9,10,15.
Nota: Les premières cellules apoptotiques ont des membranes cellulaires intactes, et apparaissent comme l'iodure de propidium (PI) cellules séronégatifs et annexine V-positif de la diminution de la taille des cellules (par rapport aux cellules viables). Late cellules apoptotiques ont des membranes cellulaires non-intactes, et apparaissent comme des cellules PI-positives et annexine V-positif de la diminution de la taille des cellules. En utilisant le protocole actuel, les préparations typiques contiennent ~ 85% apoptotique précoce et ~ 15% de cellules apoptotiques tardives. - Ajouter des cellules apoptotiques à BU.MPT cellules répondeuses (protocole 3) à un rapport apoptotique-répondeur à cellule de 1: 1, soit directement, soit après la fixation des cellules apoptotiques pendant 30 min avec 0,4% (v / v) de paraformaldehyde dans 1 x DPBS .
Note: apoptotique fixation des cellules avant la stimulation des intervenants devraitpas d' incidence sur les résultats, à moins que les événements de signalisation observés sont dus à la libération d'un médiateur soluble (tableau 1).
3. Préparation des cellules nécrotiques BU.MPT (protocole n ° 2)
Remarque: Ce protocole est spécifique des cellules BU.MPT comme source de cellules nécrotiques, et de chauffage du procédé de nécrose induction. En variante, une autre lignée cellulaire ou une culture de cellules primaires, peuvent être utilisés comme source de cellules nécrotiques, avec la nécrose induite par des protocoles normalisés pour ce type particulier de cellule et un procédé de nécrose induction.
- Après le passage sur un diamètre de 100 mm polystyrène stérile plasma sous vide de gaz traités boîtes de culture de tissu, poussent les cellules BU.MPT jusqu'à la confluence dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2 dans des conditions permissives (ie à 37 ° C en milieu de culture A à 10 ml par boîte), comme décrit dans la section 1.2.3.
- Rincer la monocouche de cellules adhérentes à trois reprises avec un milieu de culture B, en utilisant10 mL par rinçage.
- Détacher les cellules par addition d'EDTA 5 mM dans 1 x Ca + 2 - et Mg + 2 sans gluten DPBS à 1 ml par boîte pendant 5 min. Aspirer le milieu contenant de l'EDTA contenant des cellules détachées, et ajouter la suspension cellulaire à un tube de 15 ml en polystyrène de centrifugation stérile.
- Laver les cellules trois fois par centrifugation pendant 10 min à 500 x g et remise en suspension dans 10 ml de Ca2 + - et Mg + 2 sans gluten DPBS par lavage.
- Après le dernier lavage, les cellules en suspension dans un milieu de culture frais B à ~ 5 x 10 6 cellules par ml.
- Induire une nécrose des cellules en chauffant à 70 ° C pendant 45 min dans un bain d'eau, tourbillonner doucement la suspension de cellules toutes les 10 min.
- Incuber les cellules pendant 2 h dans un humidifiée à 5% (v / v) une atmosphère de CO2 à 37 ° C. vortex doucement la suspension de cellules toutes les 15 min.
- Le cas échéant, confirmer l'induction de la nécrose par cytométrie en flux en utilisant une préparation séparée de necrotic cellules (ou en réservant des cellules à cette fin), comme précédemment décrit 6,9,10,15.
Remarque: Les cellules nécrotiques ont rompu les membranes cellulaires, et apparaissent comme des cellules PI positif de l'augmentation de la taille des cellules (par rapport aux cellules viables). En utilisant le protocole actuel, les préparations typiques contiennent ≥ 95% de cellules nécrotiques. En variante, l'induction d'une nécrose et une perte d'intégrité de la membrane peut être confirmée par une coloration au bleu Trypan.
4. Préparation des cellules BU.MPT Responder (protocole n ° 3)
Remarque: Ce protocole est spécifique des cellules BU.MPT comme source de cellules répondeuses. En variante, une autre lignée cellulaire ou une culture de cellules primaires, peuvent être utilisés en tant que cellules répondeuses. Avant utilisation expérimentale, quiescence peut être induite par nuit protocoles normalisés au sein du laboratoire.
- Cultiver les cellules BU.MPT à 100 mm boîtes de culture de tissus stériles dans des conditions permissives dans un milieu de culture A à 10 ml par boîte jusqu'à ce qu'ils atteignent ~85% de confluence.
- culture Aspirer milieu A, et rincer les cellules trois fois avec un milieu de culture B à 10 ml par rinçage. Sérum-affamer les cellules pendant la nuit pendant 18 à 24 h dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2 dans des conditions non permissives (ie à 39 ° C en milieu de culture B à 10 ml par boîte), tel que décrit dans la section 1.2 .4, afin d'induire la quiescence. Alternativement, cultiver des cellules dans un milieu de culture B plus de 10% (v / v) de FBS à 39 ° C pendant une journée avant que les cellules de sérum de faim pendant la nuit dans un milieu de culture B sans FBS.
- Etiqueter un plat de cellules BU.MPT confluentes de culture de tissus pour chaque condition expérimentale.
- Inclure les six conditions suivantes: stimulation des répondeurs BU.MPT viables avec le facteur de croissance, soit du véhicule ou de l'épiderme (EGF) pendant 15 min, après leur exposition pendant 30 minutes, soit à aucune cellule, des cellules apoptotiques ou de cellules nécrotiques.
Remarque: L'exposition à des cellules mortes peut stimuler ou inhiber le niveau d'activité d'un giême molécule de signalisation. La stimulation est mieux détecté au- dessus d' un faible niveau de référence (par exemple, absence d'EGF), alors que l' inhibition est mieux détectée à partir d' une base de référence élevée (par exemple, la présence d'EGF). Comme l'effet de la stimulation avec des cellules mortes est a priori inconnu, il est recommandé d'effectuer toutes les études à la fois l'absence et la présence de EGF.
5. Stimulation des cellules Responder avec apoptotique et cellules nécrotiques (protocole n ° 4)
- Aspirer milieu de culture B des plats pré-étiquetés de repos (sérum-faim) BU.MPT cellules répondantes (Protocole 3).
Remarque: Après une nuit de culture dans des conditions non permissives, les cellules BU.MPT devrait se comporter comme des cultures primaires de rein de souris PTEC. - Par boîte de 100 mm, ajouter 2 ml d'une des opérations suivantes: milieu de culture B (pas de cellules); suspension de cellules apoptotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un milieu de culture B (Protocole 1); ou de suspension de cellules nécrotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml in milieu de culture B (protocole n ° 2).
- Distribuer la suspension 2 ml de cellules mortes uniformément sur le plat de 100 mm, et de garder le temps pour eux de régler au minimum. Pour ce faire, distribuer les morts goutte de suspension cellulaire à goutte avec une pipette de pointe large sur toute la surface des plats de cellules de répondeur. Utiliser un volume de 2 ml en tant que compromis entre la réduction du temps de stabilisation et d'éviter l'agglutination des cellules mortes.
Note: L'utilisation d'une suspension de cellules mortes comme un stimulus entraîne un certain nombre de considérations spéciales, qui sont décrits ci - dessous plus en détail (tableau 2 et discussion). - Atteindre un ratio de 1 ~ mort à répondeur cellule: 1 en ajoutant 2 mL de cellules mortes à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un plat confluentes de 100 mm, qui contient ~ 10 x 10 6 cellules. En variante, afin d'établir la relation dose-dépendance de tous les événements de signalisation observés, faire varier le rapport de la mort des cellules répondeuses en continu par dilution progressive cileure milieu B des suspensions de cellules mortes préparées dans les protocoles 1 et 2.
- Distribuer la suspension 2 ml de cellules mortes uniformément sur le plat de 100 mm, et de garder le temps pour eux de régler au minimum. Pour ce faire, distribuer les morts goutte de suspension cellulaire à goutte avec une pipette de pointe large sur toute la surface des plats de cellules de répondeur. Utiliser un volume de 2 ml en tant que compromis entre la réduction du temps de stabilisation et d'éviter l'agglutination des cellules mortes.
- Remuer doucement les plats, puis incuber à 37 ° C dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2.
- Après 30 min, stimuler les cellules répondantes avec un véhicule ou 50 nM d'EGF, d'après le pré-marquage de la boîte de culture.
- Incuber pendant 15 min à 37 ° C dans un humidifiée à 5% (v / v) , une atmosphère de CO2.
- Laver les cellules mortes en ajoutant 5 ml de glace-froid 1x DPBS, tourbillonnant le plat, et aspirer le liquide de lavage. Répétez trois fois.
- Immédiatement placer les plats de cellules de répondeur sur la glace pour un traitement ultérieur.
- Préparer des lysats cellulaires
- Préparer un tampon de lyse cellulaire contenant ce qui suit: 1 x tampon Tris salin (TBS), le pyrophosphate de sodium 10 mM, 0,5% p / v de désoxycholate, 0,1% p / v de SDS, 10% de glycerol, et le fluorure de sodium 25 mM.
- Immédiatement avant la lyse cellulaire, ajouter ce qui suit dans l'ordre exact donné à l'indLes concentrations icated: inhibiteur de protéase de mini-cocktail d'EDTA (1 comprimé par 10 ml de tampon de lyse), 10% (v / v) de Triton X-100, 1 mM de dithiothréitol (DTT), le fluorure de phénylméthanesulfonyle 1 mM (PMSF), et 10 orthovanadate de sodium mM.
- Ajouter 700 pi de tampon de lyse cellulaire glacée par boîte de 100 mm de cellules répondeuses fraîchement stimulées sur la glace de l'étape 5.7. Racler les cellules avec un grattoir à cellules et transférer le lysat pré-refroidie de 1,5 ml microtubes. Maintenir les tubes sur la glace pendant 15 min.
- lysats Soniquer sur la glace avec 10 impulsions de 20 Hz, moins d'une seconde chacun dans la durée. Eviter la formation de mousse à l'interface gaz / liquide, car cela peut surchauffer les échantillons. immerger complètement la sonde sonicateur dans les microtubes contenant lysats avant de mettre l'appareil à ultrasons sur, et mettez le sonicateur avant de retirer la sonde à partir des lysats.
- Centrifugeuse à 20.000 xg pendant 10 min à 4 ° C, transférer les surnageants dans des microtubes pré-réfrigérés frais, Et conserver à -70 ° C.
- Effectuer une électrophorèse sur gel et immunotransfert de lysats sur des surnageants, comme décrit précédemment 6,9,10,15.
- Préparer un tampon de lyse cellulaire contenant ce qui suit: 1 x tampon Tris salin (TBS), le pyrophosphate de sodium 10 mM, 0,5% p / v de désoxycholate, 0,1% p / v de SDS, 10% de glycerol, et le fluorure de sodium 25 mM.
6. Prévention de contact direct physique entre les cibles et les intervenants L'utilisation d'un semi-perméable Polycarbonate Membrane (Protocole 5)
- Préparer les cellules répondeurs BU.MPT selon le protocole 3, à une exception; faire croître des cellules dans une culture tissulaire en polystyrène stérile traité grappes de 12 puits.
- Dans les puits sélectionnés, placer un système de support perméable contenant une membrane de polycarbonate de 0,4 um pour empêcher une interaction physique entre les cellules mortes et répondeurs. Inclure les puits témoins sans membrane dans la même expérience.
- Aspirer milieu de culture B à partir de puits expérimentaux de cellules BU.MPT répondeurs privées de sérum.
- Suivre le protocole 4 pour la stimulation des cellules répondeuses avec des cellules apoptotiques ou nécrotiques, avec les modifications suivantes:
- Par puits de 1groupe 2 puits, ajouter 0,1 mL d'une des opérations suivantes: milieu de culture B (pas de cellules); suspension de cellules apoptotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un milieu de culture B (Protocole 1); ou d'une suspension de cellules nécrotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un milieu de culture B (protocole 2).
Remarque: Comme bien agglomérée d'un groupe de 12 puits contenant 0,5 x 10 ~ 6 cellules, l'addition de 0,1 ml de cellules mortes à ~ 5 x 10 6 cellules par ml donne un rapport de point mort à répondeur cellule d'environ 1: 1. - Aux puits contenant le système de support perméable, ajouter les cellules mortes au-dessus de la membrane de polycarbonate de 0,4 um dans le système de support perméable, de sorte qu'il n'y a aucune interaction physique directe entre les cellules mortes et répondeurs.
- Par puits de 1groupe 2 puits, ajouter 0,1 mL d'une des opérations suivantes: milieu de culture B (pas de cellules); suspension de cellules apoptotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un milieu de culture B (Protocole 1); ou d'une suspension de cellules nécrotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un milieu de culture B (protocole 2).
7. L'inhibition de la phagocytose par la cytochalasine D (protocole n ° 6)
- Préparer les cellules répondeurs BU.MPT conformément au protocole 3.
- Préparer le cytosquelette inhibiteur cytochalasine D dans dimethyl sulfoxyde (DMSO) à 4 mg / ml (1000 fois). Ajouter des plats pré-marqués de cellules répondeuses BU.MPT soit 10 pl de véhicule (DMSO) ou 10 ul de cytochalasine D pour obtenir une concentration finale de 4 pg / mL dans 10 mL de milieu de culture B.
Note: A cette concentration , la cytochalasine D, la phagocytose par les cellules BU.MPT et une lignée de cellules macrophages est inhibée par ≥90% 9,10. - Incuber pendant 2 heures à 37 ° C dans un humidifiée à 5% (v / v) atmosphère de CO 2.
- Suivre le protocole 4 pour la stimulation des cellules répondeuses avec des cellules apoptotiques ou nécrotiques.
- Le cas échéant, confirmer l' inhibition de la phagocytose des cellules mortes par cytométrie en flux en utilisant une préparation séparée des cellules mortes et répondeur (ou cellules réservées à cet effet), comme décrit précédemment 9,10.
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Representative Results
Dans la figure 1, nous fournissons un schéma représentant les timing et critiques étapes impliquées dans la préparation de cellules apoptotiques (Protocole 1) et les cellules nécrotiques (protocole 2) et la stimulation des cellules de répondeur avec des suspensions de cellules apoptotiques et nécrotiques (protocole n ° 4).
Sur la figure 2, nous fournissons des résultats représentatifs montrant l'effet des cellules apoptotiques sur la phosphorylation des deux isoformes de la sérine-thréonine kinase glycogène synthase kinase-3 (GSK-3), GSK-3α et GSK-3β. GSK-3α / β a un rôle important dans la régulation de la prolifération cellulaire et la survie, ainsi que son rôle important dans le métabolisme du glucose. La phosphorylation de la GSK-3α à la sérine-21 et de GSK-3β à sérine-9 inhibe l'activité kinase et, à son tour, conduit à une diminution de la phosphorylation et l'augmentation de la stabilisation de la β-caténine. ß-caténinepuis translocation vers le noyau où elle favorise la transcription des gènes connus pour stimuler la prolifération cellulaire et inhiber l'apoptose. Par conséquent, l'augmentation de la phosphorylation de la GSK-3α / β est associée à une augmentation de la prolifération et de la survie, alors une phosphorylation diminuée de la GSK-3α / β est corrélée avec une diminution de la prolifération et la survie.
L' exposition des répondeurs BU.MPT repos à apoptotique des cellules pendant 30 min fortement inhibé la phosphorylation basale de GSK-3α / β (figure 2A). De même, une exposition antérieure à des cibles apoptotiques pendant 30 min fortement inhibée subséquente du facteur de croissance épidermique (EGF) , la phosphorylation induite par la GSK-3α / β (figure 2A). En revanche, l'exposition des répondeurs BU.MPT aux cellules nécrotiques n'a eu aucun effet sur la phosphorylation soit de base ou induite par l'EGF de la GSK-3α / β.
Pour prévenl'interaction physique entre les répondeurs t BU.MPT et les cellules apoptotiques, BU.MPT répondeurs ont été cultivées dans un système de support perméable et séparé des cibles apoptotiques par une membrane de polycarbonate de 0,4 um. La prévention de l' interaction physique entre les répondeurs et les cellules apoptotiques BU.MPT abolit la capacité des cibles apoptotiques à inhiber la phosphorylation de la GSK-3α / β (figure 2B). Pour évaluer le rôle de la phagocytose, nous avons utilisé le cytosquelette inhibiteur de cytochalasine D pour empêcher l'absorption phagocytaire des cellules mortes. Inhibition de la phosphorylation de la GSK-3α / β en réponse à des cellules apoptotiques est survenue en l'absence de phagocytose (figure 2C). Nous avons précédemment montré que la cytochalasine D, à la concentration utilisée, inhibe PTEC et la phagocytose par les macrophages ≥90% 9,10. Pris dans leur ensemble, nos résultats montrent que l'inhibition à médiation cellulaire apoptotique de la phosphorylation de la GSK3a / β nécessite une interaction physique directe betwe en cibles et des cellules de répondeur, mais est indépendante de la phagocytose.
La figure 1. Schéma pour l' induction de signalisation intracellulaire des événements dans les cellules Responder Viable par interaction physique avec les cellules voisines subissant une mort cellulaire. Les graphiques de ligne représentent les événements critiques de synchronisation et dans la préparation de (A) apoptotique (Apo) cellule (B) nécrotique (nécro) des suspensions cellulaires de cellules BU.MPT, et (C) la stimulation de la viabilité BU.MPT répondeur des cellules avec des suspensions de cellules apoptotiques ou nécrotiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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La figure 2. L' inhibition de la phosphorylation de GSK3a / β dans les cellules BU.MPT Responder Après exposition à des cellules apoptotiques Requiert direct cellule-cellule Interaction mais est indépendante de phagocytose. Cellules répondeuses BU.MPT privées de sérum ont été prétraitées pendant 2 h avec (A, B) un véhicule ou (C) cytochalasine D (4 ug / ml), puis stimulées pendant 30 min avec aucune des cellules (-), les cellules apoptotiques (Apo ), ou des cellules nécrotiques (NEC) à une cellule morte à répondeur rapport de cellules de 1: 1. Les cellules répondeuses ont ensuite été lavées et incubées pendant 15 min en absence ou en présence d'EGF (50 nM) avant la récolte. La source des cellules apoptotiques a été BU.MPT cellules traitées staurosporine. La source des cellules nécrotiques a été BU.MPT des cellules traitées à la chaleur. L' interaction entre les cellules mortes et les intervenants BU.MPT était soit (A, C) sans entrave, ce qui permet directementmort cellulaire intervenant d'interaction physique, ou (B) avec séparation des cellules mortes et les répondeurs par une membrane de polycarbonate de 0,4 um dans un système de support perméable. Les cellules mortes et les cellules répondeuses non adhérentes ont été éliminées par lavage, et le répondeur BU.MPT lysats de cellules ont été sondées avec des anticorps GSK3a / ß anti phosphorylés comme indiqué. Une charge égale a été confirmée par le sondage pour le total déshydrogénase glycéraldéhyde-3-phosphate (GAPDH). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Effet sur la signalisation événement en supposant que ce mécanisme | |||||||
| Intervention | Soluble médiateur | La reconnaissance du récepteur à médiation | phagocytose | ||||
| Fixation des cellules apoptotiques * | Élimination | Persistance | Persistance | ||||
| La séparation physique des cellules apoptotiques et répondeur † | Persistance | Élimination | Élimination | ||||
| Ultracentrifugation milieu conditionné à partir de cellules en apoptose comme stimulus¶ | Persistance | Élimination | Élimination | ||||
| Les cellules nécrotiques comme stimulus | Élimination | L' élimination ou la réponse dirigée opposée (par exemple, l' inhibition par rapport à la stimulation) | Persistance | ||||
| perles de latex comme stimulus | Élimination | Élimination | Persistance | ||||
| inhibition pharmacologique de la phagocytose | Persistance | Persistance | Élimination | * Les résultats prévus supposent que la fixation ne modifie pas les déterminants de surface critiques responsables de la reconnaissance et / ou d'une phagocytose médiée par le récepteur. | |||
| † Les résultats prévus comportent deux hypothèses: premièrement, que le médiateur soluble est assez petit pour passer à travers les pores de la membrane séparant le apoptotique et répondant cellules, et la seconde, que les vésicules ou microvésicules hangar, corps apoptotiques souvent appelés, sont trop grands pour passer à travers les pores de la membrane. Un rôle pour les microvésicules ou vésicules serait suggéré par un manque de concordance dans les événements de signalisation observés avec une séparation physique des cellules apoptotiques et des répondeurs par rapport à une ultracentrifugation du milieu conditionné. | |||||||
| ¶ ultracentrifugation (20 000 x g pendant 30 min) est nécessaire pour éliminer tous les corps apoptotiques ou un autre hangar insoluble qui peut imiter l'effects de la cellule apoptotique intacte. | |||||||
Tableau 1. Identification du mécanisme (s) responsable pour les événements de signalisation dans les cellules viables après exposition à des cellules apoptotiques. Plusieurs stratégies expérimentales simples sont fournis pour établir une distinction entre le mécanisme potentiel (s) responsable des événements de signalisation observés suite à une exposition à des cellules apoptotiques. Ces mécanismes sont les suivants: l'interaction physique de la cellule apoptotique avec des récepteurs spécifiques sur les cellules répondeuses, la libération de médiateurs solubles à partir de la cellule apoptotique et d'engagement des machines phagocytose de la cellule de répondeur.
| question expérimentale | Stratégies disponibles pour la réduction et / ou le contournement |
| nombre restreintles cellules de l'apoptose par cellule de répondre (~ 1: 1). | 1. Augmenter le nombre de cellules apoptotiques, mais le rapport apoptotique à répondeur cellule doit être maintenue <2: 1. * |
| Nécessité d'une décantation gravitaire dépendant des cellules apoptotiques. | 1. Réduire le volume du milieu dans lequel les cellules apoptotiques sont suspendues. |
| 2. Centrifugeuse le plat ou une plaque pour conduire les cellules apoptotiques à travers le milieu de suspension plus rapidement. | |
| distribution spatiale inégale des cellules apoptotiques. | 1. Distribuez soigneusement le apoptotique goutte de suspension cellulaire à goutte avec une pipette de pointe large sur toute la surface des plats de cellules de répondeur. |
| 2. plats ou puits Éviter la culture d'un diamètre <35 mm, dans lequel les effets méniscales peuvent conduire à des distributions inégales. | |
| Hétérogénéité de la population des cellules apoptotiques. | 1. Utilisez un inducteur puissantde l'apoptose. |
| 2. Après l'induction, fixer les cellules apoptotiques avec du paraformaldehyde, et trier par cytométrie de flux pour obtenir une population plus uniforme. | |
| ratios de cellules * À apoptotique-à-répondeur> 2: 1, les cellules apoptotiques formeront un tapis confluentes et les cellules apoptotiques supplémentaires ne seront plus en contact direct avec les cellules de répondeur | |
Tableau 2. Experimental Problèmes liés à l'utilisation d'une suspension cellulaire comme une stimulation de la signalisation intracellulaire des événements. Plusieurs obstacles expérimentaux associés à l'utilisation d'une suspension cellulaire comme un stimulus sont répertoriés, ainsi que des stratégies pour leur remède partiel.
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Discussion
Nous fournissons ici un protocole permettant de caractériser les événements de signalisation intracellulaires induits dans les cellules viables suite à leur exposition à des cellules subissant une apoptose ou d'autres formes de mort cellulaire. Le protocole met l'accent sur les multiples mécanismes par lesquels l'exposition à des cellules apoptotiques peuvent moduler les voies de signalisation intracellulaire dans les cellules répondeuses viables. Ces mécanismes sont les suivants: l'interaction (par l'intermédiaire de molécules de pontage ou des déterminants de surface sur la cellule morte ou ses vésicules de foule et de microvésicules, souvent appelé corps apoptotiques) avec des récepteurs spécifiques sur les cellules répondeuses; la libération de médiateurs solubles (ou même leur génération extracellulaire 27); et l'engagement de la machinerie phagocytaire. Dans des circonstances dans lesquelles la phagocytose importante se produit, un mécanisme supplémentaire à considérer est la livraison de médiateurs, tels que microRNA, enrichi dans la cellule apoptotique ou de ses vésicules 21. La signification de notre protocole, comparativement à ométhodologies utres, réside dans sa dissection minutieuse des multiples mécanismes par lesquels les cellules apoptotiques peuvent moduler la transduction du signal dans les cellules répondant. Un avantage majeur est que la plupart des techniques nécessaires sont simples et standard pour la culture cellulaire.
Bien que le protocole est spécifique des cellules BU.MPT, une ligne de PTEC de rein de souris immortalisées, comme la source des deux cellules mortes et répondant, adaptation du protocole à d'autres lignées cellulaires ou des cultures de cellules primaires est simple et facilement mis en œuvre. En outre, comme dans nos publications précédentes, la source de cellules mortes et répondant n'a pas besoin d' être nécessairement le même 9,10,19. Bien que nous décrivons l'utilisation de staurosporine et de la chaleur comme inducteurs de l'apoptose et de la nécrose, respectivement, le mode et les déclencheurs de la mort cellulaire peuvent également varier. Alors que les événements de signalisation induits chez les répondeurs BU.MPT après une exposition à des cellules apoptotiques sont largement indépendantes du mode d'induction de l'apoptose, nous haai observé quelques différences 9,10. Pour cette raison, nous recommandons les principaux résultats répliquant avec plusieurs déclencheurs différents de la mort cellulaire apoptotique. Par exemple, si des cellules hautement phagocytaires telles que les macrophages, sont utilisés comme répondeurs à 4,6, ou si la durée de l' interaction entre les répondeurs et les cellules mortes est suffisamment longue pour phagocytose importante se produise, on pourrait envisager un inducteur non toxique l' apoptose, comme UW ou gamma-irradiation 4,9,10, pour écarter la livraison phagocytaire potentielle de la toxine. D'autres méthodes d'induction de la nécrose peuvent également être considérés. Bien que nous ayons obtenu des résultats identiques avec chauffage et congélation-décongélation des cellules, la vaste agglutination des cellules et des débris se produisant avec congélation-décongélation rendent son utilisation problématique.
Plusieurs stratégies simples peuvent aider à élucider le mécanisme particulier responsable des événements de signalisation observés suite à une exposition à des cellules apoptotiques (tableau 1 tableau 1, l'effet sur l'événement de signalisation observé peut identifier le mécanisme responsable. Par exemple, dans le cas de la reconnaissance médiée par le récepteur de la cellule apoptotique, l'événement de signalisation devrait persister malgré la fixation de la cellule apoptotique et doit être éliminé avec le remplacement de cellules apoptotiques par les moyens ou les billes de latex conditionné, ainsi qu'avec une séparation physique des cellules mortes et répondre. En réponse à des cellules nécrotiques, l'événement de signalisation doit être éliminé ou devenir l' opposé dirigé (par exemple, l' inhibition par rapport à la stimulation).
Il y a plusieurs conséquences de cette mort restreinte à répondeur rapport cellulaire qui peutconduire à une réduction ou obscurcissement des événements de signalisation. Pour interagir physiquement avec une cellule de répondeur viable, une cellule apoptotique doit d'abord régler à travers la colonne de milieu de suspension. Même avec des volumes minimaux, le temps de sédimentation des cellules peut être appréciable, aussi longtemps que 10 à 20 min. événements de signalisation intracellulaires seront donc non coordonnées entre les cellules répondant. Par conséquent, le contact initial entre les cellules de répondeur et morts ne peut pas être précisément chronométré, mais relève plutôt d'un peu large éventail de fois. Pour les événements qui se produisent sur une échelle de temps plus court que celui nécessaire pour la décantation de signalisation, cette absence de synchronisation peut conduire à une occultation du signal de telle sorte qu'il ne se distingue de l'arrière-plan. Même les signaux de durée prolongée, sinon d'une ampleur suffisante, peuvent être sensibles à cette question.
En plus de ces questions temporelles, les questions spatiales peuvent également avoir une incidence défavorable sur les résultats. effets méniscales, en particulier dans les puits et les plats de sdiamètre du centre commercial (par exemple, la culture de tissus de polystyrène traité grappes de 96 puits), ou des courants de fluides générés par pipetage trop énergique peut conduire à une distribution non uniforme des cellules mortes, créant ainsi un état de fête ou la famine parmi répondeur cellules. Etant donné que le signal mesuré dérive de celle de toutes les cellules répondeuses dans un seul puits ou d'une plaque, la variation de la capture de cellules mortes peut obscurcir les signaux les plus faibles.
Une dernière question se rapporte à l'hétérogénéité de la population des cellules apoptotiques. Même avec une forte tendance à déclencher l'apoptose, tels que la staurosporine, une préparation de cellules mortes contient des cellules à différents stades du processus de mort. Cela devient pertinent, si la force de la réponse à la cellule apoptotique dépend de sa phase au sein de la 10,14 processus de mort. Depuis, en moyenne, chaque cellule répondant rencontre une seule cellule apoptotique, l'hétérogénéité dans ce cas, peut conduire à un affaiblissement de l'événement de signalisation globale détectée. Tableau 2
Il existe plusieurs autres préoccupations expérimentales associées de façon unique à l'aide de cellules mortes comme stimulus. Surtout, les conditions de culture peuvent affecter non seulement les cellules répondant, mais aussi les cellules mortes elles-mêmes. Par exemple, les protéines sériques, si elles sont présentes, peuvent se fixer à la surface de la cellule morte, et renforcer ou inhiber sa reconnaissance par les cellules répondeuses. Dans le dépannage d'un résultat incohérent, ou un résultat différent de celui rapporté dans la littérature, l'attention devrait être accordée aux conditions de culture suivantes (pour les deux intervenants et les cellules mortes): degré de confluence, numéro de passage, présence de sérum, l'inactivation thermique de sérum , et la nature et la durée de quiescence. Enfin, il faut être conscient que la mort cellulaire est un aspect inexorable de toute culture de cellules, et les cellules de répondeur sont donc constamment exposés à un niveau de mort bascellules. Cette exposition peut potentiellement affecter la réponse expérimentale à un bolus de cellules mortes, puisque les signaux très à l'étude sont continuellement induites. la modulation du signal peut résulter par les voies normales de rétroaction, ou même à travers la sélection d'une sous-population de cellules répondantes, en particulier si les événements de signalisation induites impliquent la survie ou la prolifération.
En résumé, nous avons décrit un protocole pour la détermination des événements de signalisation intracellulaire induite dans les cellules viables par leur interaction physique avec des cellules mortes ou mourantes adjacentes. Bien que l'accent est mis surtout sur des événements induits par la reconnaissance du récepteur à médiation par des cellules mortes de signalisation, le protocole permet également l'identification des événements provoqués par l'absorption phagocytaire ou la libération de médiateurs solubles à partir des cellules mortes de signalisation. L'utilisation de cellules mortes comme un stimulus introduit plusieurs facteurs uniques qui peuvent nuire à la détection d'événements de signalisation intracellulaires. La conscience de ces ufacteurs, nique ainsi que les multiples mécanismes par lesquels les cellules mortes modulent la signalisation intracellulaire, est essentielle à la conception et l'interprétation des expériences dans ce domaine en pleine croissance de l'étude. Le protocole décrit ici devrait aider à comprendre les mécanismes par lesquels les cellules mortes ou mourantes affectent leurs voisins vivent dans la santé et la maladie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
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