Abstract
Celler som dör genom apoptos, även kallad reglerad celldöd, förvärva flera nya aktiviteter som gör det möjligt för dem att påverka funktionen av intilliggande levande celler. Vital aktiviteter, såsom överlevnad, proliferation, tillväxt och differentiering, är bland de många cellulära funktioner module av apoptotiska celler. Förmågan att känna igen och svara på apoptotiska celler tycks vara en universell egenskap hos alla celler, oavsett härstamning eller organ av origine. Emellertid, mångfalden och komplexiteten av svaret på apoptotiska celler mandat att stor försiktighet vidtas dissekera signalerings händelser och vägar som ansvarar för ett visst utfall. I synnerhet måste en särskilja bland de multipla mekanismer genom vilka apoptotiska celler kan påverka intracellulära signalsystem inom viabla responderceller, inklusive: receptormedierad erkännande av den apoptotiska cellen, frisättning av lösliga mediatorer av den apoptotiska cellen, och / eller ingrepp av phagocytic maskiner. Här ger vi ett protokoll för att identifiera intracellulära signaleringshändelser som induceras i livskraftiga svarsceller efter deras exponering för apoptotiska celler. En stor fördel med protokollet ligger i den uppmärksamhet det lönar sig att dissekering av den mekanism genom vilken apoptotiska celler modulerar signalering händelser inom svarande celler. Medan protokollet är specifik för en villkorligt odödlig mus njure proximala tubuli cellinje (BU.MPT celler), är det lätt att anpassa till cellinjer som är icke-epitelial ursprung och / eller härrör från andra källor än njuren organ. Användningen av döda celler som en stimulans introducerar flera unika faktorer som kan försvåra upptäckt av intracellulära signaleringshändelser. Dessa problem, liksom strategier för att minimera eller kringgå dem, diskuteras inom protokollet. Tillämpningen av detta protokoll ska hjälpa vår växande kunskap om det breda inflytande som döda eller döende celler utövar på sina levande grannar, både i hälsa och i disease.
Introduction
Apoptos, eller reglerad celldöd en bidrar på ett väsentligt sätt till att upprätthålla och utveckla vävnader. Sett enklast, apoptos tillstånd åldern, skadad eller överskott celler som skall elimineras utan att skada omgivande vävnader 2,3. Bidraget från apoptos till vävnadshomeostas, är dock betydligt mer dynamisk och varierad. Celler som dör genom apoptos förvärva flera nya aktiviteter, både utsöndrade och cellassocierade, som gör det möjligt för dem att påverka funktionen av intilliggande levande celler 4-10. Tidigare studier fokuserade på förmågan hos apoptotiska celler för att undertrycka inflammation 11-16, men apoptotiska celler modulera också ett brett utbud av cellfunktioner, inklusive sådana viktiga aktiviteter som överlevnad 4,9,10, proliferation 4,9,10, differentiering 17, migration 18, och tillväxt 19. Dessutom är dessa effekter inte begränsade till professionella fagocyter, som makrofagers, men sträcker sig till praktiskt taget alla typer och härstamningar cell, inklusive traditionellt icke-fagocytiska celler, såsom epitel- och endotelceller 7,9,10,18-21.
Den specifika svar av intilliggande levande celler efter exponering för apoptotiska celler beror på flera faktorer som relaterar till både livskraftiga svarande celler och apoptotiska celler själva. Till exempel, även exponering för apoptotiska celler inhiberar proliferation av både murina makrofager och njur proximala tubulära epitelceller (PTECs), dessa två celltyper skiljer sig dramatiskt i deras överlevnad svar på apoptotiska celler 4,6,9,10. Apoptotiska celler främja överlevnaden av makrofager, men inducera apoptotisk död PTECs 4,6,9,10. Notably, kan svaret på apoptotiska celler skiljer sig även bland svarande celler av samma härstamning, beroende på den svarande cellens ursprungsorgan 10 (t ex njure PTECs kontra bröstepitelialcellerceller) eller aktiverings 22 (t.ex. neutrofiler). Omvänt kan apoptotiska celler framkalla olika svar i mycket samma cell beroende på naturen av den apoptotiska stimulans 10,23 eller stadiet av apoptos 10,14.
Med tanke på den diverseness och komplexiteten av svaret på apoptotiska celler måste stor försiktighet iakttas i dissekera signalerings händelser och vägar som ansvarar för ett visst utfall. Först måste svaren kräver direkt fysisk interaktion mellan livskraftiga och apoptotiska celler skiljas från dem som framkallas av lösliga mediatorer som frigörs eller genereras av apoptotiska cellen 3,6-10. Om fysisk interaktion krävs, så ska utföras en ytterligare differentiering. Signaleringshändelser kan bero på receptorförmedlad erkännande av den apoptotiska cellen, oberoende av efterföljande engulfment eller på fagocytisk upptagning, oberoende av den specifika receptor som binder den apoptotiska cellen 3-7,9,10,19. I det senare fallet är svaret inte är specifik för apoptotiska celler, och kan utlösas av någon fagocytiska material 4,6.
Betydelsen av dessa distinktioner kan återigen uppskattas av kontrasterande svaren från makrofager och njur PTECs. För båda celltyperna, exponering för apoptotiska celler förändrar aktiviteten av den pro-överlevnads kinas Akt. Modulering är beroende av fysisk interaktion, eftersom separation reagera och apoptotiska celler genom en 0,4 pm polykarbonatmembran avskaffar svaret 4,9,10,19. Emellertid är svaret hos PTECs receptormedierad och oberoende av fagocytos, medan svaret hos makrofager drivs av fagocytos 4,9,10,19. Denna slutsats förstärks av det faktum att exponering för latexpärlor, en neutral fagocytisk stimulans, har ingen effekt på Akt aktivitet i PTECs, men härmar effekten av apoptotiska celler i makrofager 4,9.
"> Även mindre väl studerade celler dör av nekros, eller oavsiktlig celldöd en, även modulera funktionen närliggande levande celler 3-10,19. Liksom apoptotiska celler, nekrotiska celler utövar sina effekter genom en mängd olika mekanismer, särskilt läckage av intracellulära innehåll genom deras brustna cellmembran 3,5,6,9,24. Många celler, inklusive PTECs och makrofager, har tydliga icke-konkurrerande receptorer för celler dör av nekros 5,9. engagemang av dessa receptorer inducerar signalering händelser som ofta motsatt de som induceras genom ingrepp av receptorerna för apoptotiska celler 4-10,19. till exempel i PTECs, nekrotiska celler ökar fosforylering av Akt, medan apoptotiska celler minskar fosforylering 9,10,19. Här beskriver vi ett protokoll för att identifiera intracellulära signaleringshändelser som induceras i viabla njur PTECs genom receptormedierad igenkänning av intilliggande apoptotiska PTECs
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelser
Obs: I detta protokoll, två eller flera cellinjer, eller primära cellkulturer, oberoende upprättats enligt särskilda villkor. Dessa preparat omfattar apoptotiska celler (protokoll 1), nekrotiska celler (protokoll 2), och friska svarsceller (Protokoll 3). Efter oberoende preparatet uppstår apoptotiska eller nekrotiska celler sattes till respondercellerna och den resulterande signaltransduktion övervakas (Protocols 4, 5 och 6).
- Förbered odlingsmedia och reagenser
- Förbereda 500 ml odlingsmedium A (för användning när växande celler under permissiva betingelser, se avsnitt 1.2) genom att kombinera följande: 1x Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande 4,5 g / L glukos, 584 mg / L ʟ-glutamin, 110 mg / L natriumpyruvat, 100 enheter / ml penicillin-streptomycin, 10% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS), och 10 enheter / ml av interferon-γ (IFN-γ).
- Bered 500 ml odlingsmedium B (för användning WHen serum svältande celler under icke tillåtliga betingelser, se avsnitt 1.2) genom att utelämna FBS och IFN-γ från receptet odlingsmedium A. För att odla celler under icke tillåtliga betingelser (före serumsvält), tillsätt 10% v / v FBS till odlingsmedium B.
- Förbereda 0,4% (volym / volym) paraformaldehyd, pH 7,2, i 1 x Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) från 4% lagerparaformaldehyd för fixering av döda celler.
Obs: Paraformaldehyd är giftig, och lämplig försiktighet bör iakttas vid dess användning.
- Kultur BU.MPT celler
- Tina från flytande kväve en injektionsflaska med BU.MPT celler.
Notera: BU.MPT är en mus kidney proximal rörformad epitelcell (PTEC) linje härledd från en transgen mus som bär en temperaturkänslig (ts) mutation (tsA58) av SV40 stora tumörantigen (TAg) under kontroll av mus större histokompatibilitetskomplexet (MHC) H-2K '' klass I-promotorn 25,26. - Plate celler på steril polystyrene vakuum gas plasma behandlade vävnadsodlingsskålar (~ 5 x 10 6 celler per 100 fat mm diameter).
- Odla celler under tillåtande betingelser i en fuktad 5% (volym / volym) CO2 atmosfär.
Obs: tillåtliga betingelser, som definieras som kultur vid 33-37 ° C i närvaro av IFN-γ, möjliggör stabil expression av tsA58-muterade TAg transgen. Till skillnad från primära kulturer av mus njure PTEC, som inte överlever mer än en enda passage eller två, odlades BU.MPT enligt tillåtande betingelser kan passe obestämd tid.- Passage celler åtminstone tre gånger efter upptining innan du använder dem i ett experiment.
- Att passageceller, tillsätt 1 ml av 0,05% trypsin per 100 mm skål, och inkubera i en fuktad 5% (volym / volym) CO2 atmosfär vid 37 ° C i 5 min. Neutralisera trypsin genom tillsats av 10 ml medium A. Aspirera de lösgjorda cellerna, och dela upp 1: 3 till 1: 5 in i nya 100 mm steril polystyren vakuum gas plasmabehandlade TissUE odlingsskålar. Lägg medium A för att bringa volymen upp till totalt 10 ml per 100 mm skål.
- Passage celler åtminstone tre gånger efter upptining innan du använder dem i ett experiment.
- Som förberedelse för experimentell användning som svarande celler, odla celler till konfluens i en fuktad 5% (volym / volym) CO2 atmosfär under icke-permissiva betingelser (dvs vid 39 ° C i frånvaro av IFN-γ [medium B innehållande 10% volym / vol FBS]).
Notera: Under icke tillåtliga betingelser, är expression av tsA58-muterade TAg transgen inhiberas av> 95%, och BU.MPT celler beter sig som primära kulturer av mus njure PTEC.
- Tina från flytande kväve en injektionsflaska med BU.MPT celler.
2. Framställning av apoptotiska BU.MPT Cells (protokoll 1)
Obs: Detta protokoll är specifik för BU.MPT celler som källa av apoptotiska celler, och staurosporin som metod för apoptosinduktion. Alternativt kan en annan cellinje eller primär cellkultur, användas som en källa till apoptotiska celler, med apoptos inducerad av standardiserad protocoÄr för just celltyp och metod för apoptosinduktion.
- Efter passage på 100 mm diameter steril polystyren vakuum gasplasma behandlade vävnadsodlingsskålar, växa BU.MPT celler till konfluens i en fuktad 5% (volym / volym) CO2 atmosfär under permissiva betingelser (dvs vid 37 ° C i odlingsmedium A vid 10 ml per 100 mm skål), som beskrivs i avsnitt 1.2.3.
- Skölja vidhäftande cellmonoskiktet tre gånger med odlingsmedium B, med användning av 10 ml per sköljning.
- Inducera apoptos genom inkubering av cellerna i odlingsmedium B innehållande staurosporin, ett icke-selektivt proteinkinashämmare, vid ett mikrogram / ml under 3 timmar i en fuktad 5% (volym / volym) CO2 atmosfär vid 37 ° C.
- Aspirera staurosporin innehållande medium innehållande "flytande" apoptotiska celler som har lossnat från monolager. Centrifugera detta medium under 10 min vid 500 xg, kassera supernatanten, tvätta pelleten tre gånger med odlingsmedium B, ochlägga pelleten tillbaka till celler som samlats i nästa steg, 2,5.
- Lossa de kvarvarande vidhäftande cellerna från steg 2.3 och 2,4 genom tillsats av 5 mM (etylendiamintetraättiksyra) EDTA i 1x Ca 2 + - och Mg 2 + -fri DPBS vid 1 ml per skål för 5 min. Aspirera EDTA-innehållande medium innehållande fristående apoptotiska celler, och samla de lösgjorda cellerna med "flytande" apoptotiska celler från steg 2,4 i en steril 15 ml polystyren centrifugrör.
- Tvätta de apoptotiska cellerna tre gånger genom centrifugering under 10 min vid 500 xg och återsuspension i 10 ml 1x Ca + 2 - och Mg + 2 -fria DPBS per tvättning.
- Efter den sista tvätten, suspendera de apoptotiska cellerna i färskt odlingsmedium B vid ~ 5 x 10 6 celler per ml före användning för att stimulera respondercellema. Alternativt, fixa tvättade apoptotiska celler i 0,4% (v / v) paraformaldehyd i 1x DPBS under 30 minuter, och sedan tvätta tre gånger med kulturmedium B, före suspension i odlingsmedium B.
- Vad som är lämpligt, bekräftar induktion av apoptos genom flödescytometri med användning av en separat beredning av apoptotiska celler (eller genom att reservera vissa celler för detta ändamål), såsom tidigare beskrivits 6,9,10,15.
Obs: Tidiga apoptotiska celler har intakta cellmembran, och visas som propidiumjodid (PI) -negativa och Annexin V-positiva celler med minskad cellstorlek (i förhållande till livsdugliga celler). Sen apoptotiska celler har icke-intakta cellmembran, och visas som PI-positiva och Annexin V-positiva celler med minskad cellstorlek. Använda det nuvarande protokollet, typiska preparat innehåller ~ 85% tidigt apoptotiska och ~ 15% sena apoptotiska celler. - Lägg apoptotiska celler till BU.MPT svarsceller (Protokoll 3) vid en apoptotisk-till-responder cellförhållande av 1: 1, antingen direkt eller efter fixering av apoptotiska celler under 30 min med 0,4% (volym / volym) paraformaldehyd i 1x DPBS .
Obs: Apoptotisk cell fixering före stimulering av responders börinte påverka resultaten, såvida de observerade signaleringshändelser beror på frisättning av en löslig medlare (Tabell 1).
3. Beredning av Necrotic BU.MPT Cells (protokoll 2)
Obs: Detta protokoll är specifik för BU.MPT celler som källa för nekrotiska celler, och värme som metod för nekros induktion. Alternativt kan en annan cellinje eller primär cellkultur, användas som en källa för nekrotiska celler, med nekros induceras av standardiserade protokoll för att särskild celltyp och metod för nekros induktion.
- Efter passage på 100 mm diameter steril polystyren vakuum gasplasma behandlade vävnadsodlingsskålar, växa BU.MPT celler till konfluens i en fuktad 5% (volym / volym) CO2 atmosfär under permissiva betingelser (dvs vid 37 ° C i odlingsmedium A vid 10 ml per skål), som beskrivs i avsnitt 1.2.3.
- Skölja vidhäftande cellmonoskiktet tre gånger med odlingsmedium B, med användning av10 ml per sköljning.
- Lösgöra cellerna genom tillsats av 5 mM EDTA i 1x Ca + 2 - och Mg + 2 -fria DPBS vid 1 ml per skål för 5 min. Aspirera EDTA-innehållande medium innehållande fristående celler, och lägga till cellsuspensionen till en steril 15 ml polystyren centrifugrör.
- Tvätta cellerna tre gånger genom centrifugering under 10 min vid 500 xg och återsuspension i 10 ml av Ca + 2 - och Mg + 2 -fria DPBS per tvättning.
- Efter den sista tvätten, suspendera cellerna i färskt odlingsmedium B vid ~ 5 x 10 6 celler per ml.
- Inducera nekros genom upphettning celler till 70 ° C under 45 min i ett vattenbad genom att försiktigt vortexa cellsuspensionen var 10 min.
- Inkubera cellerna under 2 h i en fuktad 5% (volym / volym) CO2 atmosfär vid 37 ° C. Vortexa försiktigt cellsuspensionen var 15 min.
- Vad som är lämpligt, bekräftar induktion av nekros genom flödescytometri med användning av en separat beredning av necrotic celler (eller genom att reservera vissa celler för detta ändamål), såsom tidigare beskrivits 6,9,10,15.
Notera: Nekrotiska celler har spruckit cellmembran, och visas som PI-positiva celler av ökad cellstorlek (i förhållande till livsdugliga celler). Använda det nuvarande protokollet, typiska preparat innehåller ≥ 95% nekrotiska celler. Alternativt kan induktion av nekros och förlust av membranintegritet bekräftas av Trypan blå färgning.
4. Framställning av BU.MPT svarsceller (protokoll 3)
Obs: Detta protokoll är specifik för BU.MPT celler som källa för svararceller. Alternativt kan en annan cellinje eller primär cellkultur, användas som svararceller. Före experimentell användning kan passivitet induceras natten av standardiserade protokoll inom laboratoriet.
- Väx BU.MPT celler i sterila 100 mm vävnadsodlingsskålar enligt begränsande villkor i odlingsmedium A vid 10 ml per skål tills de uppnår ~85% konfluens.
- Aspirera odlingsmedium A och skölj cellerna tre gånger med odlingsmedium B vid 10 ml per sköljning. Serum svälta cellerna över natten för 18 till 24 timmar i en fuktad 5% (v / v) CO2 atmosfär under icke tillåtliga betingelser (dvs vid 39 ° C i odlingsmedium B vid 10 ml per skål), som beskrivs i avsnitt 1.2 0,4, för att framkalla inaktivitet. Alternativt odla celler i odlingsmedium B plus 10% (volym / volym) FBS vid 39 ° C i en dag innan serum svältande celler över natten i odlingsmedium B utan FBS.
- Märka en separat vävnadsodlingsskål av konfluenta BU.MPT celler för varje experimentell skick.
- Inkluderar de följande sex villkor: stimulering av viabla BU.MPT responders med antingen vehikel eller epidermal tillväxtfaktor (EGF) under 15 min, efter deras exponering för 30 min till antingen inga celler, apoptotiska celler, eller nekrotiska celler.
Notera: Exponering för döda celler kan antingen stimulera eller hämma graden av aktivitet av en giVen-signalmolekyl. Stimulering bäst detekteras över en låg baslinje (t.ex. frånvaro av EGF), medan inhibering bäst detekteras från en hög baslinje (t.ex. närvaro av EGF). Eftersom effekten av stimulering med döda celler är a priori okänd, är det rekommenderat att utföra alla undersökningar i både frånvaro och närvaro av EGF.
5. Stimulering av svararceller med Apoptotic och nekrotiska celler (protokoll nr 4)
- Aspirera odlingsmedium B från pre-märkta rätter vilande (serumsvältes) BU.MPT svararceller (Protokoll 3).
Obs: Efter odling över natten under icke tillåtliga betingelser, bör BU.MPT celler beter sig som primära kulturer av mus njure PTEC. - Per 100 mm skål, tillsätt 2 ml av ett av följande: odlingsmedium B (inga celler); apoptotiska cellsuspension på ~ 5 x 10 6 celler per ml i odlingsmedium B (protokoll 1); eller nekrotisk cellsuspensionen vid ~ 5 x 10 6 celler per ml in odlingsmedium B (protokoll 2).
- Fördela 2 ml suspension av döda celler jämt över 100 mm skål, och hålla tiden för dem att sedimentera till ett minimum. För att uppnå detta, distribuera den döda cellsuspension droppe för droppe med en bred spets pipett över hela ytan av de responder cell rätter. Använda en volym av 2 ml som en kompromiss mellan minimering av sedimenteringstiden och undvika klumpning av döda celler.
Anmärkning: Användning av en suspension av döda celler som en stimulus medför ett antal speciella överväganden, vilka beskrivs nedan i större detalj (tabell 2 och diskussion). - Uppnå en cellförhållande dead-till-svarare av ~ 1: 1 genom att tillsätta 2 ml av döda celler vid ~ 5 x 10 6 celler per ml till ett sammanflytande 100 mm skål, vilken innehåller ~ 10 x 10 6 celler. Alternativt, för att fastställa sambandet mellan dos-beroendet av eventuella observerade signaleringshändelser, varierar förhållandet av döda till responsceller kontinuerligt genom progressiv utspädning i kulture medium B av de döda cellsuspensioner framställda i protokollen 1 och 2.
- Fördela 2 ml suspension av döda celler jämt över 100 mm skål, och hålla tiden för dem att sedimentera till ett minimum. För att uppnå detta, distribuera den döda cellsuspension droppe för droppe med en bred spets pipett över hela ytan av de responder cell rätter. Använda en volym av 2 ml som en kompromiss mellan minimering av sedimenteringstiden och undvika klumpning av döda celler.
- Snurra försiktigt rätter, sedan inkubera vid 37 ° C i en fuktad 5% (v / v) CO2 atmosfär.
- Efter 30 min, stimulera respondercellema med antingen vehikel eller 50 nM EGF, enligt den pre-märkning av odlingsskålen.
- Inkubera i 15 min vid 37 ° C i en fuktad 5% (volym / volym) CO2 atmosfär.
- Tvätta bort döda celler genom att tillsätta 5 ml iskall 1x DPBS, virvlande skålen och aspirera tvättvätskan. Upprepa tre gånger.
- Omedelbart placera svarscell rätter på is för vidare bearbetning.
- Förbered cellysat
- Förbereda cellys buffert innehållande följande: 1 × Tris-buffrad saltlösning (TBS), 10 mM natriumpyrofosfat, 0,5% vikt / volym deoxikolat, 0,1% vikt / volym SDS, 10% glycerol och 25 mM natriumfluorid.
- Omedelbart före cell-lys, lägga till följande i exakt ordning som anges på indicated koncentrationer: mini EDTA-fri proteashämmare cocktail (en tablett per 10 ml lysbuffert), 10% (volym / volym) Triton X-100, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF), och 10 mM natriumortovanadat.
- Lägg 700 mikroliter av iskall cellysbuffert per 100 mm skål av färskt stimulerade svararceller på is från steg 5,7. Skrapa celler med en cell skrapa och överföra lysatet till pre-kyld 1,5 ml mikrorör. Bibehålla rören på is under 15 min.
- Sonikera lysat på is med 10 pulser av 20 Hz, mindre än en sekund vardera i varaktighet. Undvika skapandet av skum vid gas / vätskegränsytan, eftersom detta kan överhetta proverna. Fullt doppa ultraljudsonden i mikrorör innehållande lysat innan du slår på sonikator på och stänga av ultraljuds innan du tar bort sonden från lysaten.
- Centrifugera vid 20.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C, överföra supernatanterna till frisk pre-kyld mikrorörOch förvara vid -70 ° C.
- Utför gelelektrofores och immunoblotting på supernatanter av lysat, såsom tidigare beskrivits 6,9,10,15.
- Förbereda cellys buffert innehållande följande: 1 × Tris-buffrad saltlösning (TBS), 10 mM natriumpyrofosfat, 0,5% vikt / volym deoxikolat, 0,1% vikt / volym SDS, 10% glycerol och 25 mM natriumfluorid.
6. Förhindra direkt fysisk kontakt mellan mål och Responders Använda ett semipermeabelt polykarbonatmembran (Protokoll 5)
- Förbered BU.MPT svararceller enligt protokoll 3, med ett undantag; odla celler i steril polystyren vävnadskultur behandlade 12-brunnskluster.
- I utvalda brunnar, placera en genomsläpplig stödsystem som innehåller en 0,4 pm polykarbonatmembran för att förhindra fysisk interaktion mellan döda och svararceller. Inkluderar kontrollbrunnar utan ett membran i samma experiment.
- Aspirera odlingsmedium B från experimentella brunnar i serumsvultna BU.MPT svararceller.
- Följ protokoll 4 för stimulering av svarande celler med apoptotiska eller nekrotiska celler, med följande ändringar:
- Per brunn av en2-brunnars kluster, tillsätt 0,1 ml av ett av följande: odlingsmedium B (inga celler); apoptotiska cellsuspension på ~ 5 x 10 6 celler per ml i odlingsmedium B (protokoll 1); eller nekrotisk cellsuspensionen på ~ 5 x 10 6 celler per ml i odlingsmedium B (protokoll 2).
Notera: Som ett konfluent brunn i en 12-brunnars kluster innehåller ~ 0,5 x 10 6 celler, tillsättning av 0,1 ml av döda celler vid ~ 5 x 10 6 celler per ml ger en död-till-responder cellförhållande av ~ 1: 1. - Till brunnar innehållande det permeabla stödsystemet, tillsätt de döda cellerna ovanpå 0,4 ^ m polykarbonatmembran inom det permeabla stödsystemet, så det finns ingen direkt fysisk interaktion mellan döda och svararceller.
- Per brunn av en2-brunnars kluster, tillsätt 0,1 ml av ett av följande: odlingsmedium B (inga celler); apoptotiska cellsuspension på ~ 5 x 10 6 celler per ml i odlingsmedium B (protokoll 1); eller nekrotisk cellsuspensionen på ~ 5 x 10 6 celler per ml i odlingsmedium B (protokoll 2).
7. Hämning av fagocytos med Cytochalasin D (Protokoll 6)
- Förbered BU.MPT svararceller enligt protokoll 3.
- Förbered cytoskelettala hämmaren cytochalasin D i dimethyl sulfoxid (DMSO) vid 4 mg / ml (1000 ×). Lägg till pre-märkta rätter av BU.MPT svarsceller antingen 10 mikroliter av vehikel (DMSO) eller 10 mikroliter av cytochalasin D för att uppnå en slutlig koncentration av 4 | ig / ml i 10 ml odlingsmedium B.
Obs: Vid denna koncentration av cytochalasin D, fagocytos av BU.MPT celler och en makrofag cellinje inhiberades med ≥90% 9,10. - Inkubera i 2 h vid 37 ° C i en fuktad 5% (volym / volym) CO2 atmosfär.
- Följ protokoll 4 för stimulering av svarande celler med apoptotiska eller nekrotiska celler.
- I förekommande fall bekräfta inhibition av fagocytos av döda celler genom flödescytometri med användning av en separat beredning av döda och svarsceller (eller celler reserverade för detta ändamål), som tidigare beskrivits 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1, tillhandahåller vi ett schema som visar tids och kritiska stegen vid framställning av apoptotiska celler (protokoll 1) och nekrotiska celler (protokoll 2) och stimuleringen av svarsceller med suspensioner av apoptotiska och nekrotiska celler (protokoll 4).
I figur 2, tillhandahåller vi representativa resultat som visar effekten av apoptotiska celler på fosforylering av de två isoformerna av serin-treonin-kinas glykogensyntaskinas-3 (GSK-3), GSK-3α och GSK-3β. GSK-3α / β har en framträdande roll i regleringen av celltillväxt och överlevnad, samt dess viktiga roll i glukosmetabolismen. Fosforylering av GSK-3α vid serin-21 och GSK-3β vid serin-9 hämmar kinasaktivitet och, i sin tur, leder till minskad fosforylering och ökad stabilisering av β-catenin. P-cateninsedan translokerar till kärnan, där det främjar transkription av gener som är kända för att stimulera celltillväxt och hämma apoptos. Därför är ökad fosforylering av GSK-3α / β i samband med ökad spridning och överlevnad, medan minskad fosforylering av GSK-3α / β korrelerar med minskad proliferation och överlevnad.
Exponering av vilande BU.MPT responders till apoptotiska celler under 30 minuter starkt inhiberade basal fosforylering av GSK-3α / β (Figur 2A). På liknande sätt, före exponering för apoptotiska mål för 30 min inhiberade starkt efterföljande epidermal tillväxtfaktor (EGF) -inducerad fosforylering av GSK-3α / β (Figur 2A). I kontrast, exponering av BU.MPT responders till nekrotiska celler hade ingen effekt på vare sig basal eller EGF-inducerad fosforylering av GSK-3α / β.
att Prevent fysisk interaktion mellan BU.MPT responders och apoptotiska celler, BU.MPT responders odlas i ett genomsläppligt stödsystem och separeras från apoptotiska mål genom en 0,4 pm polykarbonatmembran. Förebyggande av fysikalisk växelverkan mellan BU.MPT responders och apoptotiska celler avskaffade förmågan hos apoptotiska mål för att inhibera fosforylering av GSK-3α / β (Figur 2B). För att utvärdera betydelsen av fagocytos använde vi cytoskelettala hämmaren cytochalasin D för att förhindra fagocytiska upptag av döda celler. Hämning av fosforylering av GSK-3α / β som svar på apoptotiska celler förekom i frånvaro av fagocytos (Figur 2C). Vi har tidigare visat att cytochalasin D, vid den koncentration som används, hämmar PTEC och makrofag fagocytos av ≥90% 9,10. Sammantaget visar våra resultat att apoptotiska cellmedierad hämning av fosforylering av GSK3α / β kräver direkt fysisk interaktion betwe sv mål och svarsceller, men är oberoende av fagocytos.
Figur 1. Schema för induktion av intracellulära signal händelser i livskraftiga svararceller genom fysisk interaktion med angränsande celler som genomgår celldöd. De linjediagram visar tids och kritiska händelser i framställningen av (A) apoptotiska (Apo) cell och (B) nekrotisk (Necro) cellsuspensioner av BU.MPT celler, och i (C) stimulering av livskraftiga BU.MPT svars celler med suspensioner av apoptotiska eller nekrotiska celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/ftp_upload/54980/54980fig2.jpg "/>
Figur 2. Inhibering av Fosforylering av GSK3α / β i BU.MPT Responder-celler efter exponering för apoptotiska celler Kräver direkt cell-cellinteraktion, men är oberoende av fagocytos. Serumsvultna BU.MPT svarsceller förbehandlades under 2 h med (A, B) fordon eller (C) cytochalasin D (4 | ig / ml) och stimulerades sedan under 30 min med inga celler (-), apoptotiska celler (Apo ), till eller nekrotiska celler (NEC) på en död cell-svaret cellförhållande av 1: 1. Respondercellema tvättades sedan och inkuberades under ytterligare 15 min i frånvaro eller närvaro av EGF (50 nM), före skörd. Källan för apoptotiska celler var staurosporin behandlade BU.MPT celler. Källan för nekrotiska celler var värmebehandlade BU.MPT celler. Interaktion mellan döda celler och BU.MPT responders var antingen (A, C) obehindrat, vilket möjliggör direktdöd cell-svarare fysisk interaktion, eller (B) med separation av döda celler och responders av en 0,4 | j, m polykarbonatmembran i en permeabel stödsystem. Döda celler och icke-vidhäftande responder celler avlägsnades genom tvättning, och BU.MPT responder cellysat probades med anti-fosforylerade GSK3α / p-antikroppar, såsom visas. Lika lastning bekräftades genom sondering för total glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Effekt på signal händelse antar denna mekanism | |||||||
| Intervention | löslig mediator | Receptormedierad igenkänning | fagocytos | ||||
| Fixering av apoptotiska celler * | Eliminering | Uthållighet | Uthållighet | ||||
| Fysisk separation av apoptotiska och svarsceller † | Uthållighet | Eliminering | Eliminering | ||||
| Ultracentrifugerkonditionerat medium från celler som genomgår apoptos som stimulus¶ | Uthållighet | Eliminering | Eliminering | ||||
| Nekrotiska celler som stimulans | Eliminering | Eliminering eller motsatt riktade respons (t.ex. inhibering mot stimulering) | Uthållighet | ||||
| Latexpärlor som stimulans | Eliminering | Eliminering | Uthållighet | ||||
| Farmakologisk inhibition av fagocytos | Uthållighet | Uthållighet | Eliminering | * Förväntade resultat förutsätter att fixeringen inte påverkar kritisk yta bestämnings ansvariga för receptormedierad igenkänning och / eller fagocytos. | |||
| † Förutspådda resultat innebär två antaganden: för det första att den lösliga medlare är tillräckligt små för att passera genom porerna i membranet som skiljer den apoptotiska och svarande celler, och andra, att alla skjul blåsor eller mikrovesiklar, ofta benämnda apoptotiska kroppar, är för stora för att passera genom membranets porer. En roll för vesiklar eller mikrovesiklar skulle föreslås av en bristande överensstämmelse i signalerings som observerats med fysikalisk separation av apoptotiska och svararceller kontra ultracentrifugerkonditionerat medium. | |||||||
| ¶ Ultracentrifugering (20.000 x g under 30 min) är nödvändigt för att avlägsna eventuella apoptotiska kroppar eller annat skjul olösligt material som kan härma effeCTS av den intakta apoptotiska cellen. | |||||||
Tabell 1. Identifiering av mekanismen (s) Ansvarig för att signalera händelser i levande celler efter exponering för apoptotiska celler. Flera enkla experimentella strategier är anordnade för att skilja mellan den potentiella mekanismen (er) som ansvarar för signalering händelser observerades efter exponering för apoptotiska celler. Dessa mekanismer inkluderar: fysisk interaktion av den apoptotiska cellen med specifika receptorer på responder cell, frisättning av lösliga mediatorer från den apoptotiska cellen, och ingrepp av responder cells fagocytiska maskiner.
| experimentell fråga | Tillgängliga strategier för minimering och / eller kringgående |
| begränsat antalav apoptotiska celler per svarar cell (~ 1: 1-förhållande). | 1. Öka antalet apoptotiska celler, men den apoptotiska till svarscellförhållandet bör hållas <2: 1. * |
| Behov av gravitationsberoende sedimentering av apoptotiska celler. | 1. minimera volymen av medium i vilket apoptotiska celler är suspenderade. |
| 2. Centrifugera skålen eller platta för att driva apoptotiska celler genom suspensionsmediet snabbare. | |
| Ojämn geografiska fördelningen av apoptotiska celler. | 1. fördela försiktigt apoptotiska cellsuspensionen droppvis med en bred spets pipett över hela ytan av svarscell rätter. |
| 2. Undvik odlingsskålar eller brunnar med en diameter <35 mm, där menisk effekter kan leda till ojämna fördelningar. | |
| Heterogenitet den apoptotiska cellpopulationen. | 1. Använd en stark inducerareav apoptos. |
| 2. Efter induktion, fixera de apoptotiska cellerna med paraformaldehyd, och sortera efter flödescytometri för att erhålla en mer enhetlig population. | |
| * Vid apoptotiska mot svarscellförhållanden> 2: 1, kommer apoptotiska celler bildar en sammanhängande matta och ytterligare apoptotiska celler inte längre ta direktkontakt med svarsceller | |
Tabell 2. Experimentell frågor i samband med användning av en Cellular Suspension som en stimulans av intracellulära signalerings händelser. Flera experimentella hinder i samband med användning av en cellsuspension som ett stimulus är noterade, liksom strategier för deras partiella botemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi tillhandahåller här ett protokoll för karakterisering de intracellulära signaleringshändelser som induceras i viabla celler efter deras exponering för celler som genomgår apoptos, eller andra former av celldöd. Protokollet understryker de många mekanismer genom vilka exponering för apoptotiska celler kan modulera intracellulära signalvägar inom livskraftiga svararceller. Dessa mekanismer innefattar: interaktionen (via överbryggande molekyler eller determinanter ytan på de döda cellen eller dess skjul vesiklar och mikrovesiklar, ofta benämns apoptotiska kroppar) med specifika receptorer på responder cell; frisättningen av lösliga mediatorer (eller ens deras extracellulära generation 27); och ingreppet av den fagocytiska maskiner. Under omständigheter där betydande fagocytos inträffar ytterligare en mekanism som skall beaktas är leverans av mediatorer, såsom microRNA, berikad i den apoptotiska cellen eller dess vesiklar 21. Betydelsen av våra protokoll, jämfört med ofins metoder, ligger i dess noggrann dissektion av flera mekanismer genom vilka apoptotiska celler kan modulera signaltransduktion inom svarande celler. En stor fördel är att de flesta av de tekniker som krävs är okomplicerade och standard till cellodling.
Medan protokollet är specifik för BU.MPT celler, en immortaliserad mus njure PTEC linje, som källan till både döda och svarande celler, är anpassning av protokollet till andra cellinjer eller primära cellkulturer enkel och lätt implementeras. Dessutom som i våra tidigare publikationer, källan till döda och svarande cellerna behöver inte nödvändigtvis vara samma 9,10,19. Samtidigt som vi beskriver användningen av staurosporin och värme som inducerare av apoptos och nekros, respektive läget och utlöser celldöd kan också variera. Medan de signaleringshändelser som induceras i BU.MPT responders efter exponering för apoptotiska celler är till stor del oberoende av läget för apoptosinduktion, vi HAve observerade några skillnader 9,10. Av denna anledning rekommenderar vi replikerande nyckel resultat med flera olika utlösare av apoptotisk celldöd. Till exempel, om mycket fagocytiska celler, såsom makrofager, används som responders 4,6, eller om varaktigheten av växelverkan mellan responders och döda celler är tillräckligt länge för betydande fagocytos att inträffa, då man kunde överväga en giftfri inducerare av apoptos, såsom ultraviolet- eller gamma-strålning 4,9,10, för att utesluta potentiella fagocytiska leverans av toxinet. Alternativa förfaranden för induktion av nekros kan också övervägas. Även om vi har fått samma resultat med värme och frysning-tining av celler, omfattande cellklumpning och skräp förekommer med frysning-tining göra användningen problematisk.
Flera enkla strategier kan bidra till att belysa den särskilda mekanism som ansvarar för eventuella signaleringshändelser som observerades efter exponering för apoptotiska celler (Tabell 1 tabell 1, kan effekten på den observerade signal händelsen precisera ansvariga mekanismen. Till exempel, i fallet med receptormedierad erkännande av den apoptotiska cellen, bör händelse signaleringskvarstår trots fixering av den apoptotiska cellen, och bör därför avlägsnas med ersättning av apoptotiska celler genom konditionerat medium eller latexpärlor, samt med fysikalisk separation döda och svarande celler. Som svar på nekrotiska celler, bör händelsen signaleringen elimineras eller blir motriktade (t.ex. inhibering mot stimulering).
Det finns flera konsekvenser av detta begränsade dead-till-responder cellförhållandet som kanleda till en minskning eller fördunklande av signaleringshändelser. Att interagera fysiskt med en livskraftig svarscell, måste en apoptotisk cell först lösa genom kolonnen av suspenderingsmedium. Även med minimala volymer, kan tiden för sedimentering av celler vara märkbar, så länge som 10 till 20 minuter. Intracellulära signaleringshändelser kommer således att uncoordinated bland svarande celler. Hence, den första kontakten mellan responder och döda celler kan inte exakt tidsinställda, utan snarare faller inom ett något brett intervall av tider. För signalering händelser som inträffar på en tidsskala som är kortare än den som erfordras för sedimentering, kan denna brist på synkronisering leda till en fördunklande av signalen på sådant sätt att det inte längre är urskiljbar från bakgrunden. Även signaler om förlängning av giltighetstiden, om inte av tillräcklig storlek, kan vara känsliga för denna fråga.
Utöver dessa timliga frågor, kan rumsliga frågor också negativt påverka resultaten. Menisk effekter, särskilt i brunnar och rätter av sköpcentret diameter (t.ex. polystyren vävnadsodlingsbehandlade 96-brunnars kluster), eller fluidströmmar som alstras av alltför kraftig pipettering kan leda till en icke-likformig fördelning av döda celler, och därigenom skapa ett tillstånd av fest eller svält bland responder celler. Eftersom den uppmätta signalen härrör sig från alla svararceller i en enda brunn eller platta, kan variation i tillfångatagandet av döda celler skymma svagare signaler.
En sista fråga avser heterogenitet den apoptotiska cellpopulationen. Även med en stark trigger av apoptos, såsom staurosporin, kommer någon beredning av döda celler innehåller celler vid flera stadier av dödsprocessen. Detta blir relevant, om styrkan av svaret på den apoptotiska cellen beror på dess scen i dödsprocessen 10,14. Eftersom i genomsnitt varje svarande cell möter bara ett apoptotiska cell, kan heterogeniteten i detta fall leda till en försvagning av den totala detekterade signal händelse. tabell 2
Det finns flera andra experimentella frågor unikt associerade med användning av döda celler som en stimulus. Viktigare, kan odlingsbetingelser påverka inte bara de svarande cellerna, utan även de döda cellerna själva. Till exempel, serumproteiner, om närvarande, kan fästa till ytan av den döda cellen, och förstärka eller hämma dess igenkänning av svarande celler. Vid felsökning ett inkonsekvent resultat, eller ett resultat som skiljer sig från vad som rapporterats i litteraturen, bör man vara uppmärksam på följande odlingsbetingelser (för både svars och döda celler): grad av sammanflödet, passage nummer, närvaro av serum, värmeinaktivering av serum och natur och varaktighet passivitet. Slutligen måste man vara medveten om att celldöd är en obeveklig aspekt av all cellkultur, och svarsceller därför kontinuerligt utsätts för en låg nivå av dödaceller. Denna exponering kan potentiellt påverka den experimentella svar på en bolus av döda celler, eftersom de signaler som studeras är att kontinuerligt induceras. Signalmodulering kan uppstå genom normala återkopplingsvägar, eller till och med genom val av en subpopulation av svarande celler, i synnerhet om de inducerade signaleringshändelser involverar överlevnad eller proliferation.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett protokoll för bestämning av intracellulära signaleringshändelser som induceras i levande celler genom deras fysiska interaktion med angränsande döda eller döende celler. Även om fokus är övervägande på signalsystem händelser som induceras av receptormedierad igenkänning av döda celler, protokollet tillåter också identifiering av signaleringshändelser som induceras av fagocytiska upptag eller frisättningen av lösliga mediatorer från döda celler. Användningen av döda celler som en stimulans introducerar flera unika faktorer som kan försvåra upptäckt av intracellulära signaleringshändelser. Kännedom om dessa unique faktorer, liksom de många mekanismer som döda celler modulerar intracellulär signalering, är avgörande för utformningen och tolkningen av experiment inom detta växande ämnesområdet. Protokollet som beskrivs här bör underlätta förståelsen av de mekanismer genom vilka döda eller döende celler påverkar deras levande grannar i både hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | add 10% (v/v) to the culture medium A |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | add 100 units/mL to the culture media A and B |
| γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | add 10 units/mL to the culture medium A |
| Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic | Corning (Durham, NC) | 353003 | sterile, 100 mm diameter |
| Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom | Corning (Durham, NC) | 352095 | sterile, 15 mL |
| Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | sterile, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Chemicals and inhibitors | |||
| Staurosporine, from Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis |
| Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | use at 50 nM to stimulate responder cells |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM to detach adherent cells |
| Trypan blue solution, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | for dead cells staining |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | stock solution |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | stock solution |
| Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvent for cytochalasin D |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | for cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0.5% w/v for cell lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0.1% w/v for cell lysis buffer |
| Glycerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% for cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM for cell lysis buffer |
| Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% for cell lysis buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM for cell lysis buffer |
| Sodium orthovandate | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM for cell lysis buffer |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B centrifuge | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, water bath | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Cell counting chamber, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, UK) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis |
| Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane | Corning (Corning, NY) | 3413 | sterile, polystyrene, tissue culture treated |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody | Cell Signaling Technology | 9331 | rabbit polyclonal antibody |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) | Cell Signaling Technology | 2118 | rabbit monoclonal antibody |
References
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
