Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Identificazione di segnale intracellulare eventi indotta in cellule vitali per interazione con le cellule vicine sottoposti apoptotica delle cellule morte

doi: 10.3791/54980 Published: December 27, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Le cellule che muoiono per apoptosi, di cui anche la morte delle cellule, come regolamentato, acquisire più nuove attività che consentono loro di influenzare la funzione di cellule vive adiacenti. attività vitali, come la sopravvivenza, la proliferazione, la crescita e la differenziazione, sono tra le molte funzioni cellulari modulati dalle cellule apoptotiche. La capacità di riconoscere e rispondere alle cellule apoptotiche sembra essere una caratteristica universale di tutte le cellule, indipendentemente stirpe o organo dell'origine. Tuttavia, la diversità e la complessità della risposta di cellule apoptotiche mandati che grande cura essere presa in sezionare gli eventi di segnalazione e percorsi responsabili per qualsiasi particolare risultato. In particolare, si deve distinguere tra le molteplici meccanismi con cui le cellule apoptotiche possono influenzare vie di segnalazione intracellulare nelle cellule responder vitali, tra cui: il riconoscimento mediata dal recettore della cellula apoptotica, rilascio di mediatori solubili dalla cellula apoptotica, e / o impegno della phagomacchinari cytic. Qui, forniamo un protocollo per identificare gli eventi di segnalazione intracellulare che sono indotti in cellule responder vitali a seguito della loro esposizione a cellule apoptotiche. Uno dei principali vantaggi del protocollo sta nella sua attenzione alla dissezione del meccanismo con cui le cellule apoptotiche modulano la segnalazione di eventi all'interno delle cellule che rispondono. Mentre il protocollo è specifico per una linea condizionale immortalate rene di topo prossimale cella tubolare (cellule BU.MPT), è facilmente adattabile alle linee di cellule che non sono di origine epiteliale e / o derivato da organi diversi dal rene. L'uso di cellule morte come stimolo introduce diversi fattori unici che possono ostacolare la rilevazione di eventi di segnalazione intracellulare. Questi problemi, così come le strategie per ridurre al minimo o evitare loro, sono discusse all'interno del protocollo. L'applicazione di questo protocollo dovrebbe aiutare la nostra conoscenza in espansione della grande influenza che le cellule morte o morenti esercitano sui loro vicini in tempo reale, sia in salute e in DiseaSE.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L'apoptosi, o morte cellulare regolamentato 1, contribuisce in modo essenziale al mantenimento e sviluppo dei tessuti. Visto più semplicemente, permette di apoptosi età, danneggiati, o le cellule in eccesso per essere eliminati senza danno ai tessuti circostanti 2,3. Il contributo di apoptosi all'omeostasi del tessuto, tuttavia, è notevolmente più dinamica e variegata. Le cellule che muoiono per apoptosi acquisire molteplici nuove attività, sia secreta e cellulo-associati, che consentano loro di influenzare la funzione di cellule vive adiacenti 4-10. Studi precedenti focalizzati sulla capacità delle cellule apoptotiche per sopprimere l'infiammazione 11-16, ma le cellule apoptotiche anche modulano una vasta gamma di funzioni cellulari, tra cui tali attività vitali come la sopravvivenza 4,9,10, la proliferazione 4,9,10, differenziazione 17, la migrazione 18, e la crescita 19. Inoltre, questi effetti non sono limitati a fagociti professionali, come macrofagis, ma si estendono a quasi tutti i tipi e le linee cellulari, comprese le cellule tradizionalmente non fagocitiche, come le cellule epiteliali ed endoteliali 7,9,10,18-21.

La risposta specifica delle cellule vive adiacenti a seguito dell'esposizione ad apoptosi delle cellule dipende da molteplici fattori che riguardano sia le cellule che rispondono vitali e le cellule apoptotiche stessi. Ad esempio, nonostante l'esposizione a cellule apoptotiche inibisce la proliferazione di entrambi macrofagi murini e renali prossimali cellule epiteliali tubolari (PTECs), questi due tipi di cellule differiscono notevolmente nella loro risposta di sopravvivenza di cellule apoptotiche 4,6,9,10. Apoptotico cellule favoriscono la sopravvivenza di macrofagi, ma inducono la morte apoptotica delle PTECs 4,6,9,10. In particolare, la risposta di cellule apoptotiche può differire anche tra rispondendo cellule dello stesso lignaggio, a seconda degli organi della cellula risponde di origine 10 (ad esempio, PTECs renali rispetto epiteliali mammariecellule) o stato di attivazione 22 (ad esempio, neutrofili). Viceversa, le cellule apoptotiche possono evocare risposte differenti nella stessa cella a seconda della natura del apoptotico di stimolo 10,23 o la fase di apoptosi 10,14.

Data la diverseness e la complessità della risposta di cellule apoptotiche, grande cura deve essere presa in sezionare gli eventi di segnalazione e percorsi responsabili per qualsiasi particolare risultato. In primo luogo, le risposte che richiedono l'interazione fisica diretta tra cellule vitali e apoptosi devono essere differenziati da quelli ottenuti con mediatori solubili rilasciati o generate dal cellulare per apoptosi 3,6-10. Se è richiesta l'interazione fisica, poi un ulteriore differenziazione deve essere eseguita. eventi di segnalazione possono dipendere riconoscimento mediata dal recettore della cellula apoptotica, indipendentemente successiva engulfment, o assorbimento fagocitaria, indipendente dal recettore specifico che lega la cellula apoptotica 3-7,9,10,19. In quest'ultimo caso, la risposta non è specifico per cellule apoptotiche, e può essere attivato da qualsiasi materiale fagocitaria 4,6.

L'importanza di queste distinzioni può ancora essere apprezzato contrapponendo le risposte dei macrofagi e PTECs renali. Per entrambi i tipi di cellule, l'esposizione a cellule apoptotiche altera l'attività della chinasi pro-sopravvivenza Akt. La modulazione dipende interazione fisica, poiché la separazione di rispondere e cellule apoptotiche da una membrana di policarbonato 0,4 micron abolisce la risposta 4,9,10,19. Tuttavia, la risposta di PTECs è mediata da recettori e indipendente fagocitosi, considerando che la risposta dei macrofagi è guidato da fagocitosi 4,9,10,19. Questa conclusione è rafforzata dal fatto che l'esposizione a sfere di lattice, uno stimolo fagocitaria neutra, non ha alcun effetto sulle attività di Akt in PTECs, ma imita l'effetto di cellule apoptotiche nei macrofagi 4,9.

"> Anche se meno ben studiato, le cellule che muoiono da necrosi, o morte cellulare accidentale 1, modulano anche la funzione delle cellule vitali vicina 3-10,19. Come le cellule apoptosi, le cellule necrotiche esercitano i loro effetti attraverso una varietà di meccanismi, in particolare la perdita dei contenuti intracellulari attraverso la loro rottura membrana cellulare 3,5,6,9,24. Molte cellule, tra cui PTECs e macrofagi, possiedono recettori non concorrenti distinti per le cellule morte da necrosi 5,9. impegno di questi recettori induce eventi di segnalazione che sono spesso opposti a quelli indotti mediante impegno dei recettori per le cellule apoptotiche 4-10,19. ad esempio, in PTECs, cellule necrotiche aumentano fosforilazione di Akt, mentre le cellule apoptotiche diminuiscono fosforilazione 9,10,19.

Qui, descriviamo un protocollo per identificare gli eventi di segnalazione intracellulare indotti in PTECs renali vitali attraverso il riconoscimento mediata dai recettori di PTECs apoptotici adiacenti 9,10,19,25,26, è facilmente adattabile alle linee di cellule che non sono di origine epiteliale e / o derivato da organi diversi il rene. È importante sottolineare che l'uso di cellule apoptotiche come stimolo cella pone talune difficoltà inerenti sperimentali non presenti con ligandi solubili. Il più importante di questi è che le cellule apoptotiche devono essere aggiunti come sospensione piuttosto che come soluzione. Queste difficoltà, così come le strategie per ridurre al minimo o evitare loro, sono discusse all'interno del protocollo. Quasi tutte le tecniche descritte nel protocollo sono semplici e standard per coltura cellulare. Il vantaggio di questo protocollo sta nella sua attenzione alle molteplici meccanismi con cui le cellule apoptotiche modulano la trasduzione del segnale all'interno delle cellule che rispondono. Questi meccanismi comprendono l'associazione tramite i determinanti di superficie o colmare le molecole a specifici recettori sulla ricellule spondente, il rilascio di mediatori solubili e / o l'innesto della macchine fagocitaria. cellule necrotiche sono inclusi in tutti gli esperimenti per garantire che i risultati sono specifici per la modalità di morte cellulare, e non una risposta generalizzata cellule morte. Un approccio attento, come raccomandato in questo protocollo, è fondamentale per la nostra comprensione dell'influenza continua espansione che le cellule morenti esercitano sui loro vicini in tempo reale, sia in salute e malattia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. preparati

Nota: In questo protocollo, due o più linee cellulari o colture cellulari primarie, sono preparati in modo indipendente in condizioni specifiche. Queste preparazioni sono cellule in apoptosi (Protocollo 1), le cellule necrotiche (protocollo 2), e le cellule responder sani (protocollo 3). Dopo la preparazione indipendenti, cellule apoptotiche o necrotiche vengono aggiunti alle cellule responder e la trasduzione del segnale risultante viene monitorato (protocolli 4, 5 e 6).

  1. Preparare terreni di coltura e reagenti
    1. Preparare 500 ml di terreno di coltura A (per l'uso quando cresce cellule in condizioni permissive, vedi sezione 1.2), combinando il seguente: 1x Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 4,5 g / L di glucosio, 584 mg / L ʟ-glutammina, 110 mg / L di sodio piruvato, 100 unità / ml di penicillina-streptomicina, 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), e 10 unità / ml di interferone-γ (IFN-γ).
    2. Preparare 500 ml di terreno di coltura B (per l'uso when cellule siero-morire di fame in condizioni non permissive, vedi sezione 1.2) omettendo FBS e IFN-γ dalla ricetta di terreno di coltura A. Per crescere le cellule in condizioni non permissive (prima di siero-fame), aggiungere il 10% v / v FBS alla cultura medio B.
    3. Preparare 0,4% (v / v) paraformaldeide, pH 7,2, in tampone fosfato salino di 1x Dulbecco (DPBS) dal 4% paraformaldeide magazzino per il fissaggio di cellule morte.
      Nota: Paraformaldeide è tossico, e appropriato si deve usare cautela nel suo utilizzo.
  2. cellule BU.MPT Culture
    1. Scongelare da azoto liquido una fiala di cellule BU.MPT.
      Nota: BU.MPT è tubolare cellule epiteliali linea di topi renale prossimale (PTEC) derivata da un topo transgenico recante un (ts) mutazione termosensibile (tsA58) del grande antigene tumorale SV40 (TAG) sotto il controllo del mouse maggiore complesso di istocompatibilità (MHC) H-2K b classe I promotore 25,26.
    2. cellule piastra su polystyr sterileene plasma sottovuoto gas trattati piatti di coltura tissutale (~ 5 x 10 6 cellule per 100 piatto mm di diametro).
    3. Crescere le cellule in condizioni permissive in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera.
      Nota: le condizioni permissivi, che sono definiti come la cultura a 33-37 ° C in presenza di IFN-γ, consentono espressione stabile del transgene TAg tsA58-mutato. A differenza di colture primarie di topo PTEC renale, che non sopravvivono più di un singolo passaggio o due, BU.MPT coltivato in condizioni permissive possono essere diversi passaggi indefinitamente.
      1. Cellule Passage almeno tre volte dopo lo scongelamento prima di utilizzarli in un esperimento.
        1. Per le celle di passaggio, aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina per ogni piatto 100 mm, e incubare in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera a 37 ° C per 5 minuti. Neutralizzare la tripsina con l'aggiunta di 10 ml di terreno A. Aspirare le cellule staccate, e dividere 1: 3 a 1: 5 in nuovi 100 mm TISS polistirene sterile plasma sottovuoto gas trattatopiatti della cultura dell'UE. Aggiungere mezzo A per portare il volume fino a un totale di 10 ml per piastra a 100 mm.
    4. In preparazione per uso sperimentale come rispondere cellule, crescere le cellule a confluenza in un umidificata al 5% (v / v) atmosfera di CO 2 in condizioni non permissive (cioè a 39 ° C in assenza di IFN-γ [media B contenente 10% v / v FBS]).
      Nota: In condizioni non permissive, espressione del transgene TAg tsA58-mutato è inibita da> 95%, e le cellule si comportano come BU.MPT colture primarie di PTEC di rene di topo.

2. Preparazione di cellule apoptotiche BU.MPT (protocollo 1)

Nota: Questo protocollo è specifico per le cellule BU.MPT come fonte di cellule apoptotiche e staurosporine come metodo di induzione di apoptosi. In alternativa, un'altra linea cellulare, o colture primarie, possono essere utilizzati come fonte di cellule apoptotiche, con l'apoptosi indotta da protoco standardizzatals per quel particolare tipo di cellula e metodo di induzione di apoptosi.

  1. Dopo il passaggio sul diametro di 100 mm polistirene sterile plasma sottovuoto gas trattati piastre di coltura tissutale, crescono le cellule BU.MPT a confluenza in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera in condizioni permissive (cioè a 37 ° C in terreno di coltura A a 10 ml per piatto 100 mm), come descritto nella sezione 1.2.3.
  2. Risciacquare il monostrato cellulare aderente tre volte con mezzo di coltura B, utilizzando 10 ml per risciacquo.
  3. Indurre apoptosi incubando le cellule nel mezzo di coltura B contenenti staurosporine, un inibitore della proteina chinasi non selettivo, a 1 mg / ml per 3 h in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 atmosfera a 37 ° C.
  4. Aspirare il mezzo di staurosporine contenente contenente "galleggianti" apoptosi delle cellule che si sono staccati dalla monostrato. Centrifugare questo mezzo per 10 min a 500 xg, scartare il surnatante, il pellet lavare tre volte con mezzo di coltura B, eaggiungere il pellet torna a cellule raccolte nel passaggio successivo, 2.5.
  5. Staccare i restanti cellule aderenti da passi 2.3 e 2.4 con l'aggiunta di 5 mm (acido etilendiamminotetraacetico) EDTA in 1x Ca 2 + - e Mg 2 + -free DPBS a 1 ml per piatto per 5 min. Aspirare il mezzo di EDTA contenente contenente cellule apoptotiche staccate, e in comune le cellule staccate con i "galleggianti" apoptosi delle cellule dal punto 2.4 in una sterile 15 ml provetta di polistirene centrifuga.
  6. Lavare le cellule apoptotiche tre volte mediante centrifugazione per 10 min a 500 xg e risospensione in 10 ml di 1x Ca + 2 - e Mg + 2 senza glutine DPBS a lavaggio.
  7. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere le cellule apoptotiche in fresco terreno di coltura B a ~ 5 x 10 6 cellule per mL prima dell'uso per stimolare le cellule responder. In alternativa, fissare cellule apoptotiche lavata in 0,4% (v / v) in paraformaldeide 1x DPBS per 30 minuti, e poi lavare tre volte con culturamedio B, prima della sospensione nel terreno di coltura B.
  8. Se del caso, confermare l'induzione di apoptosi in citometria a flusso utilizzando una preparazione separata di cellule apoptotiche (o riservando alcune celle per questo scopo), come descritto in precedenza 6,9,10,15.
    Nota: I primi apoptosi delle cellule hanno le membrane delle cellule intatte, e appaiono come ioduro di propidio (PI), le cellule -negative e annessina V-positivo di diminuzione dimensione della cella (rispetto a cellule vitali). Tardo apoptosi delle cellule hanno le membrane cellulari non intatte, e appaiono come cellule PI-positivi e annessina V-positivo di diminuzione dimensione della cella. Utilizzando il protocollo attuale, preparazioni tipiche contengono ~ 85% apoptotico precoce e ~ 15% di cellule fine apoptotici.
  9. Aggiungere cellule apoptotiche al BU.MPT cellule responder (Protocollo 3) in un rapporto apoptotico-to-responder cellule di 1: 1, direttamente o dopo fissazione di cellule apoptotiche per 30 minuti con 0,4% (v / v) in paraformaldeide 1x DPBS .
    Nota: la fissazione per apoptosi prima della stimolazione dei responders dovrebbenon influenzare i risultati, a meno che gli eventi di segnalazione osservati sono dovuti al rilascio di un mediatore solubile (Tabella 1).

3. Preparazione di cellule necrotiche BU.MPT (protocollo 2)

Nota: Questo protocollo è specifico per le cellule BU.MPT come fonte di cellule necrotiche, e riscaldamento come metodo dell'induzione necrosi. In alternativa, un'altra linea cellulare, o colture primarie, possono essere utilizzati come fonte di cellule necrotiche, con necrosi indotta da protocolli standardizzati per quel particolare tipo di cellula e metodo di induzione necrosi.

  1. Dopo il passaggio sul diametro di 100 mm polistirene sterile plasma sottovuoto gas trattati piastre di coltura tissutale, crescono le cellule BU.MPT a confluenza in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera in condizioni permissive (cioè a 37 ° C in terreno di coltura A a 10 ml per piatto), come descritto nella sezione 1.2.3.
  2. Risciacquare il monostrato cellulare aderente tre volte con terreno di coltura B, utilizzando10 ml per risciacquare.
  3. Staccare le cellule con l'aggiunta di 5 mM EDTA a 1x Ca + 2 - e Mg + 2 senza glutine DPBS a 1 ml per piatto per 5 min. Aspirare il mezzo di EDTA contenente contenente cellule indipendenti, e aggiungere la sospensione cellulare ad una sterile 15 ml provetta di polistirene centrifuga.
  4. Lavare le cellule tre volte mediante centrifugazione per 10 min a 500 xg e risospensione in 10 ml di Ca + 2 - e Mg + 2 senza glutine DPBS a lavaggio.
  5. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere le cellule in coltura fresco medio B a ~ 5 x 10 6 cellule per ml.
  6. Indurre necrosi riscaldando le cellule a 70 ° C per 45 minuti in un bagno d'acqua, delicatamente vortex la sospensione cellulare ogni 10 min.
  7. Incubare le cellule per 2 h in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 atmosfera a 37 ° C. Delicatamente vortice la sospensione cellulare ogni 15 min.
  8. Se del caso, confermare l'induzione di necrosi mediante citometria a flusso utilizzando una preparazione separata di Necellule crotic (o riservando alcune cellule per questo scopo), come precedentemente descritto 6,9,10,15.
    Nota: le cellule necrotiche sono rotto le membrane cellulari, e appaiono come cellule PI-positivo di una maggiore dimensione della cella (relativi a cellule vitali). Utilizzando il protocollo attuale, preparazioni tipiche contengono ≥ 95% delle cellule necrotiche. In alternativa, l'induzione di necrosi e perdita di integrità della membrana può essere confermata da Trypan blu colorazione.

4. Preparazione di cellule BU.MPT risponditore (protocollo 3)

Nota: Questo protocollo è specifico per le cellule BU.MPT come fonte di cellule responder. In alternativa, un'altra linea cellulare, o colture primarie, possono essere utilizzate come cellule responder. Prima di uso sperimentale, quiescenza può essere indotta durante la notte dai protocolli standardizzati all'interno del laboratorio.

  1. Crescere le cellule BU.MPT a 100 mm piatti di coltura di tessuti sterili in condizioni permissive in terreno di coltura A a 10 ml per piatto fino a raggiungere ~85% di confluenza.
  2. cultura Aspirare media A, e lavare le cellule tre volte con terreno di coltura B a 10 ml per risciacquo. Serum-fame le cellule durante la notte per 18 a 24 h in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera in condizioni non permissive (cioè a 39 ° C in terreno di coltura B a 10 ml per piastra), come descritto nella sezione 1.2 .4, per indurre quiescenza. In alternativa, far crescere le cellule in terreno di coltura B più il 10% (v / v) di FBS a 39 ° C per un giorno prima di morire di fame le cellule siero durante la notte in terreno di coltura B senza FBS.
  3. Etichettare un piatto di coltura di tessuti separata di cellule confluenti BU.MPT per ogni condizione sperimentale.
  4. Includere i seguenti sei condizioni: la stimolazione dei responder BU.MPT vitali con fattore sia veicolo o epidermico di crescita (EGF) per 15 minuti, a seguito della loro esposizione per 30 minuti per entrambi non le cellule, le cellule apoptotiche, o cellule necrotiche.
    Nota: L'esposizione a cellule morte può stimolare o inibire il livello di attività di un giVen molecola di segnalazione. La stimolazione è più rilevata sopra un basso basale (ad esempio, assenza di EGF), che è meglio rilevato inibizione da un alto basale (ad esempio, presenza di EGF). Poiché l'effetto della stimolazione con le cellule morte è a priori sconosciuta, si raccomanda di effettuare tutti gli studi sia in assenza e presenza di EGF.

5. stimolazione delle cellule risponditore con apoptosi e cellule necrotiche (protocollo 4)

  1. Aspirare terreno di coltura B dai piatti pre-etichettati di riposo (siero-fame) BU.MPT cellule responder (Protocol 3).
    Nota: Dopo la cultura durante la notte in condizioni non permissive, le cellule BU.MPT dovrebbe comportarsi come colture primarie di PTEC di rene di topo.
  2. Per piatto 100 mm, aggiungere 2 ml di uno dei seguenti: terreno di coltura B (non le cellule); sospensione cellulare per apoptosi a ~ 5 x 10 6 cellule per ml in terreno di coltura B (Protocollo 1); o sospensione cellulare necrotico ~ 5 x 10 6 cellule per ml in terreno di coltura B (protocollo 2).
    1. Distribuire la sospensione 2 mL di cellule morte uniformemente sul piatto 100 mm, e mantenere il tempo per loro di depositarsi minimo. Per raggiungere questo obiettivo, distribuire il drop dead sospensione cellulare a goccia ad un'ampia pipetta punta su tutta la superficie dei piatti cellule responder. Utilizzare un volume di 2 ml come compromesso tra minimizzando il tempo di assestamento ed evitando la formazione di grumi di cellule morte.
      Nota: L'uso di una sospensione di cellule morte come stimolo comporta una serie di considerazioni particolari, descritte di seguito in maggior dettaglio (Tabella 2 e Discussione).
    2. Ottenere un rapporto cellulare dead-to-responder di ~ 1: 1 con l'aggiunta di 2 ml di cellule morte a ~ 5 x 10 6 cellule per ml in un piatto mm confluenti 100, che contiene ~ 10 x 10 6 cellule. In alternativa, al fine di stabilire la dose dipendenza di eventi di segnalazione osservati, variare il rapporto di morti cellule responder continuo mediante diluizione progressiva cultoure medio B delle sospensioni di cellule morte preparati in protocolli 1 e 2.
  3. Mescolare delicatamente i piatti, poi incubare a 37 ° C in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera.
  4. Dopo 30 min, stimolare le cellule responder sia con veicolo o 50 nM EGF, secondo la pre-etichettatura del piatto cultura.
  5. Incubare per 15 minuti a 37 ° C in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera.
  6. Lavare via le cellule morte con l'aggiunta di 5 ml di ghiacciata 1x DPBS, agitando il piatto, e aspirando il liquido di lavaggio. Ripetete tre volte.
  7. Subito posizionare i piatti cellule responder in ghiaccio per ulteriori elaborazioni.
  8. Preparare lisati cellulari
    1. Preparare tampone di lisi cellulare contenente le seguenti: 1 × Tris tamponata salina (TBS), 10 mM di sodio pirofosfato, 0.5% w / v desossicolato, 0,1% w / v SDS, 10% glicerolo, e fluoruro di sodio 25 mM.
      1. Immediatamente prima di lisi cellulare, aggiungere la seguente nell'esatto ordine dato al indLe concentrazioni icated: mini senza EDTA inibitore della proteasi cocktail (1 compressa ogni 10 ml di tampone di lisi), 10% (v / v) Triton X-100, 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF), e 10 mM orthovanadate di sodio.
    2. Aggiungere 700 ml di tampone di lisi cellulare ghiacciata ogni 100 mm piatto di cellule responder appena stimolate su ghiaccio a partire dal punto 5.7. Raschiare le cellule con un raschietto cellulare e trasferire il lisato di pre-raffreddata 1,5 microtubi mL. Mantenere i tubi in ghiaccio per 15 min.
    3. lisati Sonicare su ghiaccio con 10 impulsi di 20 Hz, meno di un secondo ogni durata. Evitare la creazione di schiuma all'interfaccia gas / liquido, in quanto questo può surriscaldare i campioni. Completamente immergere la sonda sonicatore nelle microprovette contenenti lisati prima di accendere il sonicatore, e passare il sonicatore prima di rimuovere la sonda dai lisati.
    4. Centrifugare a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C, trasferire il surnatante in microtubi fresco pre-raffreddata, E conservare a -70 ° C.
    5. Eseguire gel elettroforesi e immunoblotting su supernatanti di lisati, come precedentemente descritto 6,9,10,15.

6. Prevenire diretto contatto fisico tra Target e responder Utilizzando un semipermeabile in policarbonato a membrana (protocollo 5)

  1. Preparare le cellule responder BU.MPT secondo il protocollo 3, con una sola eccezione; crescere le cellule in coltura tissutale polistirene sterili trattati cluster da 12 pozzetti.
  2. In pozzetti selezionati, posizionare un sistema di supporto permeabile contenente una membrana di policarbonato 0,4 micron per impedire l'interazione fisica tra le cellule morte e responder. Include pozzetti di controllo senza membrana nello stesso esperimento.
  3. Aspirare terreno di coltura B da pozzi sperimentali di cellule BU.MPT responder siero-fame.
  4. Seguire protocollo 4 per la stimolazione delle cellule responder con cellule apoptotiche o necrotiche, con le seguenti modifiche:
    1. Per ben del 12-bene cluster, aggiungere 0,1 mL di uno dei seguenti: terreno di coltura B (non le cellule); sospensione cellulare per apoptosi a ~ 5 x 10 6 cellule per ml in terreno di coltura B (Protocollo 1); o sospensione cellulare necrotico al ~ 5 x 10 6 cellule per ml in terreno di coltura B (protocollo 2).
      Nota: Come ben confluenti di un cluster 12 pozzetti contiene ~ 0,5 x 10 6 cellule, l'aggiunta di 0,1 ml di cellule morte a ~ 5 x 10 6 cellule per ml produce un rapporto cellulare-to-responder morta di ~ 1: 1.
    2. Per pozzetti contenenti il ​​sistema di supporto permeabile, aggiungere le cellule morte in cima alla membrana di policarbonato 0,4 micron all'interno del sistema di supporto permeabile, quindi non c'è interazione fisica diretta tra cellule morte e responder.

7. L'inibizione della fagocitosi con Citocalasina D (Protocollo 6)

  1. Preparare le cellule responder BU.MPT secondo il protocollo 3.
  2. Preparare il citoscheletro inibitore citocalasina D in Dimethyl solfossido (DMSO) a 4 mg / ml (1.000 ×). Aggiungere i piatti pre-etichettati delle cellule responder BU.MPT o 10 ml di veicolo (DMSO) o 10 ml di citocalasina D per ottenere una concentrazione finale di 4 mg / ml a 10 ml di terreno di coltura B.
    Nota: A questa concentrazione di citocalasina D, la fagocitosi da parte delle cellule BU.MPT e una linea cellulare di macrofagi è stata inibita da ≥90% 9,10.
  3. Incubare per 2 ore a 37 ° C in un umidificata al 5% (v / v) di CO 2 nell'atmosfera.
  4. Seguire protocollo 4 per la stimolazione delle cellule responder con cellule apoptotiche o necrotiche.
  5. Se del caso, confermare l'inibizione della fagocitosi delle cellule morte mediante citometria di flusso utilizzando una preparazione separata di cellule morte e responder (o celle riservate a questo scopo), come descritto in precedenza 9,10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nella figura 1, forniamo uno schema che descrive i tempi e le critiche passaggi necessari per la preparazione di cellule apoptotiche (Protocollo 1) e le cellule necrotiche (protocollo 2) e la stimolazione delle cellule responder con sospensioni di cellule apoptotiche e necrotiche (protocollo 4).

Nella figura 2, forniamo risultati rappresentativi che mostrano l'effetto delle cellule apoptotiche sulla fosforilazione delle due isoforme della serina-treonina chinasi glicogeno sintasi chinasi-3 (GSK-3), GSK-3α e GSK-3β. GSK-3α / β ha un ruolo di primo piano nella regolazione della proliferazione cellulare e la sopravvivenza, così come il suo ruolo importante nel metabolismo del glucosio. La fosforilazione di GSK-3α a serina-21 e GSK-3β a serina-9 inibisce l'attività chinasi e, a sua volta, porta ad una diminuzione fosforilazione e una maggiore stabilizzazione della β-catenina. beta-cateninapoi trasloca al nucleo, dove promuove la trascrizione di geni noti per stimolare la proliferazione cellulare e inibire l'apoptosi. Pertanto, l'aumento della fosforilazione di GSK-3α / β è associata ad un aumento della proliferazione e della sopravvivenza, mentre la diminuzione della fosforilazione di GSK-3α / β correla con diminuzione della proliferazione e della sopravvivenza.

L'esposizione di responder BU.MPT quiescenti per apoptosi delle cellule per 30 min fortemente inibita la fosforilazione basale di GSK-3α / β (Figura 2A). Allo stesso modo, precedente esposizione agli obiettivi apoptotici per 30 minuti ha inibito fortemente la successiva fattore di crescita epidermico (EGF) fosforilazione indotta di GSK-3α / β (Figura 2A). Al contrario, l'esposizione di BU.MPT responder alle cellule necrotiche ha avuto alcun effetto su entrambi fosforilazione basale o EGF-indotta di GSK-3α / β.

per Prevent interazione fisica tra i responder BU.MPT e cellule apoptotiche, responders BU.MPT sono stati coltivati ​​in un sistema di supporto permeabile e separato dagli obiettivi apoptotici da una membrana di policarbonato 0,4 micron. La prevenzione di interazione fisica tra i responder BU.MPT e cellule apoptotiche abolito la capacità di obiettivi apoptotici di inibire la fosforilazione di GSK-3α / β (Figura 2B). Per valutare il ruolo della fagocitosi, abbiamo usato il citoscheletro inibitore citocalasina D per prevenire l'assorbimento fagocitosi delle cellule morte. L'inibizione della fosforilazione di GSK-3α / β in risposta a cellule apoptotiche verificato in assenza di fagocitosi (Figura 2C). Abbiamo precedentemente dimostrato che citocalasina D, alla concentrazione utilizzata, inibisce PTEC e fagocitosi dei macrofagi da ≥90% 9,10. Nel loro insieme, i nostri risultati mostrano che l'inibizione cellulo-mediata apoptotico della fosforilazione di GSK3α / β richiede diretta betwe interazione fisica en obiettivi e cellule responder, ma è indipendente fagocitosi.

Figura 1
Figura 1. Schema per l'induzione di segnalazione intracellulare Eventi a Cellule risponditore valide per l'interazione fisica con le cellule vicine sottoposti a morte cellulare. I grafici lineari rappresentano la sincronizzazione e critici eventi nella preparazione di (A) apoptotico (Apo) cellulare e (B) necrotico (Necro) sospensioni cellulari di cellule BU.MPT, e in (C) stimolo responder BU.MPT vitali cellule con sospensioni di cellule apoptotiche e necrotiche. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

/ftp_upload/54980/54980fig2.jpg "/>
Figura 2. L'inibizione della fosforilazione di GSK3α / β in cellule BU.MPT risponditore a seguito dell'esposizione ad apoptosi delle cellule Richiede diretto interazione cellula-cellula, ma è indipendente dalla fagocitosi. Cellule responder BU.MPT siero-fame sono stati pretrattati per 2 h con (A, B) del veicolo o (C) citocalasina D (4 mg / mL), e quindi stimolate per 30 min senza cellule (-), cellule apoptotiche (Apo ), o cellule necrotiche (NEC) ad una cellula morta a risponditore rapporto tra cellule di 1: 1. Le cellule responder sono state quindi lavate e incubate per 15 min in assenza o in presenza di EGF (50 nM), prima della raccolta. La fonte di cellule apoptotiche era cellule BU.MPT staurosporine-trattata. La fonte di cellule necrotiche era celle BU.MPT trattati termicamente. L'interazione tra le cellule morte e responder BU.MPT era o (A, C) senza ostacoli, consentendo direttadead cellule responder interazione fisica, o (B) con la separazione delle cellule morte e risponditori da una membrana di policarbonato 0,4 micron in un sistema di supporto permeabile. Le cellule morte e le cellule responder non aderenti sono stati rimossi mediante lavaggio, e BU.MPT risponditore lisati cellulari sono stati sondati con anticorpi GSK3α / beta anti-fosforilata come mostrato. Equal loading stata confermata sondando per deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato totale (GAPDH). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Effetto sulla segnalazione dell'evento assumendo questo meccanismo
Intervento mediatore solubile Il riconoscimento del recettore-mediata fagocitosi
Fissazione di cellule apoptotiche * Eliminazione Persistenza Persistenza
La separazione fisica di cellule apoptotiche e responder † Persistenza Eliminazione Eliminazione
Ultracentrifugati mezzo condizionato da cellule in fase di apoptosi come stimulus¶ Persistenza Eliminazione Eliminazione
cellule necrotiche come stimolo Eliminazione Eliminazione o la risposta verso opposto (ad esempio, l'inibizione contro stimolazione) Persistenza
sfere di lattice come stimolo Eliminazione Eliminazione Persistenza
l'inibizione farmacologica della fagocitosi Persistenza Persistenza Eliminazione * I risultati attesi per scontato che la fissazione non altera determinanti superficiali critiche responsabili del riconoscimento e / o la fagocitosi mediata da recettori.
risultati attesi comportano due ipotesi: in primo luogo, che il mediatore solubile è abbastanza piccolo da passare attraverso i pori della membrana che separa l'apoptosi e rispondere cellule, e la seconda, che qualsiasi vescicole o microvescicole capannone, corpi apoptotici spesso chiamati, sono troppo grandi per passare attraverso i pori della membrana. Un ruolo per vescicole o microvescicole sarebbe suggerita da una mancanza di concordanza negli eventi di segnalazione osservati con separazione fisica delle cellule apoptotiche e responder rispetto ultracentrifugato mezzo condizionato.
Ultracentrifugazione (20.000 × g per 30 minuti) è necessario rimuovere eventuali corpi apoptotici o altro capannone materiale insolubile che possono mimare la effeCTS del cellulare per apoptosi intatto.

Tabella 1. L'identificazione del meccanismo (s) responsabile per la segnalazione di eventi in cellule vitali a seguito dell'esposizione ad apoptosi delle cellule. Diverse strategie sperimentali semplici sono forniti per distinguere tra il potenziale meccanismo (s) responsabile degli eventi di segnalazione osservato in seguito alla esposizione a cellule apoptotiche. Questi meccanismi comprendono: interazione fisica della apoptosi con recettori specifici sulla cellula risponditore, rilascio di mediatori solubili del cellulare per apoptosi, e l'impegno delle macchine fagocitaria delle cellule responder.

problema sperimentale Le strategie disponibili per ridurre al minimo e / o elusione
numero ristrettocellule di apoptosi per cella risponde (~ rapporto 1: 1). 1. Aumentare il numero di cellule apoptotiche, ma il rapporto cellulare apoptotica-to-responder deve essere tenuto <2: 1. *
Necessità di assestamento gravità-dipendente apoptosi delle cellule. 1. Ridurre al minimo il volume del mezzo in cui le cellule apoptotiche sono sospese.
2. Centrifugare il piatto o piastra per guidare le cellule apoptotiche attraverso il mezzo di sospensione più rapidamente.
distribuzione spaziale irregolare di cellule apoptotiche. 1. distribuire accuratamente la goccia di sospensione cellulare per apoptosi a goccia ad un'ampia pipetta punta su tutta la superficie dei piatti cellule responder.
2. Evitare piatti della cultura o pozzi con un diametro <35 mm, in cui gli effetti meniscali possono portare a distribuzioni irregolari.
L'eterogeneità della popolazione cellulare per apoptosi. 1. Utilizzare un forte induttoredell'apoptosi.
2. Dopo l'induzione, fissare le cellule apoptotiche con paraformaldeide, e ordina per citometria a flusso per ottenere una popolazione più uniforme.
Rapporti cellulari * A apoptotico-to-responder> 2: 1, le cellule apoptotiche formeranno un tappeto confluenti e cellule apoptotiche integrativo non entrare in contatto diretto con le cellule responder

Tabella 2. Sperimentale problemi associati con l'uso di una sospensione cellulare come stimolo di segnalazione intracellulare eventi. Diversi ostacoli sperimentali associate con l'uso di una sospensione cellulare come stimolo sono elencati, così come le strategie per la loro parziale rimedio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Forniamo qui un protocollo per caratterizzare gli eventi di segnalazione intracellulare indotte nelle cellule vitali a seguito della loro esposizione alle cellule in fase di apoptosi, o altre forme di morte cellulare. Il protocollo sottolinea i molteplici meccanismi attraverso i quali l'esposizione a cellule apoptotiche possono modulare vie di segnalazione intracellulare all'interno delle cellule responder vitali. Questi meccanismi sono: l'interazione (tramite ponte molecole o fattori determinanti della superficie sulla cella morti o le sue vescicole capannone e microvescicole, spesso definito corpi apoptotici) con specifici recettori sulla cellula risponditore; il rilascio di mediatori solubili (o anche la loro generazione extracellulare 27); e l'impegno della macchina fagocitaria. In circostanze in cui si verifica sostanziale fagocitosi, un meccanismo aggiuntivo da considerare è la consegna di mediatori, come microRNA, arricchita all'interno della cellula apoptotica o suoi vescicole 21. Il significato del nostro protocollo, rispetto al ometodologie ther, sta nella sua attenta dissezione dei molteplici meccanismi con cui le cellule apoptotiche in grado di modulare la trasduzione del segnale all'interno delle cellule che rispondono. Uno dei vantaggi principali è che la maggior parte delle tecniche necessarie sono semplici e standard per coltura cellulare.

Mentre il protocollo è specifico per le cellule BU.MPT, un mouse rene linea PTEC immortalato, come fonte di entrambe le cellule morte e che rispondono, adattamento del protocollo di altre linee cellulari o colture cellulari primarie è semplice e di facile applicazione. Inoltre, come nelle nostre pubblicazioni precedenti, la fonte di cellule morte e rispondenti non deve necessariamente essere uguale 9,10,19. Mentre si descrive l'uso di staurosporine e calore come induttori di apoptosi e necrosi rispettivamente, la modalità e inneschi di morte cellulare possono anche variare. Mentre gli eventi di segnalazione indotti in responder BU.MPT seguenti l'esposizione a cellule apoptotiche sono in gran parte indipendente dalla modalità di induzione di apoptosi, abbiamo ettarove osservato alcune differenze 9,10. Per questo motivo, si consiglia di risultati chiave la replica con diversi fattori scatenanti della morte cellulare per apoptosi. Ad esempio, se le cellule altamente fagocitiche, come macrofagi, sono utilizzati come responder 4,6, o se la durata di interazione tra i responder e cellule morte è abbastanza lungo per sostanziale fagocitosi di verifica, allora si potrebbe considerare un induttore non tossico di apoptosi, come ultravioletta o raggi gamma 4,9,10, di escludere i potenziali consegna fagocitica della tossina. possono essere considerati metodi alternativi di induzione di necrosi. Mentre abbiamo ottenuto risultati identici con riscaldamento e congelamento-scongelamento delle cellule, l'ampia aggregazione delle cellule e detriti che si verificano con congelamento-scongelamento rendono il suo utilizzo problematico.

Diverse strategie semplici possono aiutare a chiarire il meccanismo particolare responsabili di eventuali eventi di segnalazione osservata dopo l'esposizione a cellule apoptotiche (Tabella 1 Tabella 1, l'effetto sull'evento segnalazione osservata può individuare il meccanismo responsabile. Ad esempio, nel caso del riconoscimento mediata da recettori della cellula apoptotica, l'evento di segnalazione deve persistere nonostante fissazione del cellulare per apoptosi, e dovrebbe essere eliminato con sostituzione di cellule apoptotiche da mezzo condizionato o lattice perline, nonché con separazione fisica di cellule morte e di rispondere. In risposta alle cellule necrotiche, l'evento di segnalazione dovrebbe essere eliminato o diventare opposto diretto (ad esempio, l'inibizione contro la stimolazione).

(Tabella 2). La maggior parte di questi problemi derivano dal numero sperimentalmente limitato di cellule apoptotiche per rispondere cella. Questo è in contrasto con fattori solubili. Anche quando usato in concentrazioni estremamente basse femtomolar caratteristici delle citochine, il numero di ligandi solubili supera di gran lunga il numero di cellule che rispondono. Nel caso di cellule apoptotiche, tuttavia, considerazioni sterici precludono l'aggiunta di cellule morte con un rapporto molto al di sopra di una cella per cella morti rispondere vitali. Per un grado reale, quindi, ogni morti questioni cellulari.

Ci sono diverse conseguenze di questa ristrette dead-to-responder rapporto cellulare che possonoportare ad una riduzione o di oscuramento degli eventi di segnalazione. Per interagire fisicamente con una cella risponditore vitale, un cellulare per apoptosi deve prima risolvere attraverso la colonna di sospendere media. Anche con volumi minimi, il tempo di assestamento delle cellule può essere sensibile, finché 10 a 20 min. eventi di segnalazione intracellulare saranno così coordinati tra le cellule che rispondono. Quindi, il contatto iniziale tra le cellule responder e morti può non essere perfettamente sincronizzata, ma rientra in un po vasta gamma di tempi. Per gli eventi che si verificano su un lasso di tempo più breve di quello richiesto per risolvere segnalazione, questa mancanza di sincronizzazione può portare ad un oscuramento del segnale in modo tale che non è più distinguibile dallo sfondo. Anche i segnali di durata prolungata, se non di grandezza sufficiente, possono essere sensibili a questo problema.

In aggiunta a queste questioni temporali, le questioni spaziali possono anche avere un impatto negativo i risultati. effetti meniscali, soprattutto in pozzi e piatti di sDiametro centro commerciale (ad esempio, colture di tessuti polistirolo trattata cluster a 96 pozzetti), o le correnti fluide generate pipettando troppo forte può portare a una distribuzione non uniforme delle cellule morte, creando così una situazione di festa o carestia tra responder cellule. Poiché il segnale misurato deriva da quello di tutte le cellule responder in un singolo pozzo o piastra, variazione della cattura di cellule morte può oscurare i segnali più deboli.

Un ultimo problema riguarda l'eterogeneità della popolazione cellulare per apoptosi. Anche con una forte attivazione di apoptosi, come staurosporina, una preparazione di cellule morte conterrà cellule a diversi stadi del processo di morte. Questo diventa rilevante, se la forza della risposta al cellulare per apoptosi dipende dalla sua fase nel processo 10,14 morte. Poiché in media ogni cella rispondere incontra un solo cellulare apoptotica, eterogeneità in questo caso può portare ad un indebolimento della manifestazione segnalazione rilevato complessiva. Tabella 2

Ci sono molti altri problemi sperimentali univocamente associati con l'uso di cellule morte come stimolo. È importante sottolineare che, condizioni di coltura possono influenzare non solo le cellule che rispondono, ma anche le cellule morte stessi. Ad esempio, proteine ​​del siero, se presenti, possono attaccarsi alla superficie della cellula morti e potenziare o inibire il riconoscimento rispondendo cellule. Nel risoluzione di un risultato incoerente, o di un risultato diverso da quello riportato in letteratura, l'attenzione dovrebbe essere data alle seguenti condizioni di coltura (sia per responder e le cellule morte): grado di confluenza, il numero di passaggio, la presenza di siero, l'inattivazione termica di siero , e la natura e la durata della quiescenza. Infine, si ha la necessità di essere a conoscenza che la morte delle cellule è un aspetto inesorabile del tutto coltura cellulare, e le cellule responder sono quindi continuamente esposti ad un basso livello di morticellule. Questa esposizione può potenzialmente influenzare la risposta sperimentale per un bolo di cellule morte, poiché gli stessi segnali in esame vengono continuamente indotti. modulazione del segnale può derivarne attraverso normali percorsi di retroazione, o anche attraverso la selezione di una sottopopolazione di cellule responder, soprattutto se gli eventi di segnalazione indotti coinvolgono sopravvivenza o proliferazione.

In sintesi, abbiamo descritto un protocollo per la determinazione degli eventi di segnalazione intracellulare indotte nelle cellule vitali dalla loro interazione fisica con le cellule morte o morenti adiacenti. Anche se l'attenzione è rivolta prevalentemente su eventi indotti dal riconoscimento mediata dal recettore delle cellule morte segnalazione, il protocollo permette anche l'individuazione di eventi indotti da assorbimento fagocitaria o il rilascio di mediatori solubili dalle cellule morte della segnalazione. L'uso di cellule morte come stimolo introduce diversi fattori unici che possono ostacolare la rilevazione di eventi di segnalazione intracellulare. La consapevolezza di questi ufattori nique, nonché le molteplici meccanismi con cui le cellule morte modulano segnalazione intracellulare, è fondamentale per la progettazione e l'interpretazione di esperimenti in questo campo crescente di studio. Il protocollo descritto qui dovrebbe aiutare a comprendere i meccanismi con cui le cellule morte o morenti influenzano i loro vicini dal vivo sia in salute e malattia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials
DMEM, 1x with [4.5 g/L] glucose, ʟ-glutamine & sodium-pyruvate Mediatech (Manassas, VA) 10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, fetal bovine serum GE Healthcare (Logan, UT) SH30066.03 add 10% (v/v)  to the culture medium A
Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 100x Life Technologies (Grand Island, NY) 10378-016 add 100 units/mL to the culture media A and B
γ-Interferon, mouse recombinant, from Escherichia coli Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) 407303 add 10 units/mL to the culture medium A
Falcon polystyrene tissue-culture treated dishes, non-pyrogenic Corning (Durham, NC) 353003 sterile, 100 mm diameter
Falcon polystyrene centrifuge tubes, conical bottom Corning (Durham, NC) 352095 sterile, 15 mL
Trypsin-EDTA, 0.05%, Gibco Fisher (Waltham, MA) 25300062 sterile, 100 mL
Name Company Catalog Comments
Chemicals and inhibitors
Staurosporine, from Streptomyces sp. Sigma (St. Louis, MO) S4400 use at [1 μg/mL] for 3 h to induce apoptosis
Epidermal growth factor (EGF), [1 mg/mL] Millipore (Billerica, MA) EA140 use at 50 nM to stimulate responder cells
UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies (Grand Island, NY) 15575-038 use 5 mM to detach adherent cells
Trypan blue solution, 0.4% MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 91691049 for dead cells staining
Paraformaldehyde Solution, 4% in DPBS Affymetrix (Santa Clara, CA) 19943 use 0.4% (v/v) in 1x DPBS for cell fixation
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), 1x, Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) 14040133 stock solution
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+- and Mg2+-free, 1x, Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) 14190367 stock solution
Cytochalasin D, 4 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO), from Zygosporium mansonii Sigma (St. Louis, MO) C8273 use at [4 μg/mL] to inhibit phagocytosis
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma (St. Louis, MO) D2650 solvent for cytochalasin D
Name Company Catalog Number Comments
Cell lysis buffer ingredients
Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 BioRad (Hercules, CA) 1706435 for cell lysis buffer
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 221368 10 mM for cell lysis buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) D6750 0.5% w/v for cell lysis buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) L3771  0.1% w/v for cell lysis buffer
Glycerol Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) G5516 10% for cell lysis buffer
Sodium fluoride Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 450022 25 mM for cell lysis buffer
Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablet Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) 4693159001 for cell lysis buffer, 1 tablet per 10 mL of buffer
Triton X-100 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) T8787 10% for cell lysis buffer
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 11DTT00005 1 mM for cell lysis buffer
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 4800263 1 mM for cell lysis buffer
Sodium orthovandate MP Biomedicals (Santa Ana, CA) 2159664 10 mM for cell lysis buffer
Name Company Catalog Comments
Equipment
Sorvall T6000B centrifuge Du Pont (Wilmington, DE) T6000B
Fisher Tissuemat, water bath Fisher (Waltham, MA)
Sonic Dismembrator (sonicator), model 100 Fisher (Waltham, MA)
Miscellaneous
Cell counting chamber, Neubauer Hawksley (Lancing, Sussex, UK) AC2000
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II Millipore (Billerica, MA) CBA059 for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis
Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mL Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) T9661
Transwell permeable support, 0.4 μm polycarbonate membrane Corning (Corning, NY) 3413 sterile, polystyrene, tissue culture treated
Name Company Catalog Comments
Antibodies
Phospho-glycogen synthase kinase-3α/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), polyclonal antibody Cell Signaling Technology 9331 rabbit polyclonal antibody
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) ) Cell Signaling Technology 2118 rabbit monoclonal antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
  2. Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
  3. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748 (2013).
  4. Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
  5. Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
  6. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
  7. Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
  8. Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
  9. Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
  10. Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
  11. Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
  12. Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
  13. Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
  14. Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7, (11), 1209-1216 (2006).
  15. Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
  16. Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
  17. Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13 (2010).
  18. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, (2010), 1007-1028 (2010).
  19. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
  20. Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
  21. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51 (2009).
  22. Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
  23. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
  24. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
  25. Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
  26. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
  27. Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
Identificazione di segnale intracellulare eventi indotta in cellule vitali per interazione con le cellule vicine sottoposti apoptotica delle cellule morte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vujicic, S., Feng, L., Antoni, A., Rauch, J., Levine, J. S. Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death. J. Vis. Exp. (118), e54980, doi:10.3791/54980 (2016).More

Vujicic, S., Feng, L., Antoni, A., Rauch, J., Levine, J. S. Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death. J. Vis. Exp. (118), e54980, doi:10.3791/54980 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter